魏 強(qiáng) 金權(quán)鑫 金琳博 于 然 李芳芳 李紅花 金 丹 孟繁平 金桂花

(延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)與病原生物學(xué)教研室，延吉 133002)

銀屑病是皮膚科常見(jiàn)的四大頑固性疾病之一，其病理改變主要為表皮的角化過(guò)度或角化不全，角質(zhì)形成細(xì)胞的過(guò)度增殖，臨床表現(xiàn)為皮膚的紅斑、鱗屑，常伴有全身癥狀且易復(fù)發(fā)，嚴(yán)重影響患者身心健康與生活質(zhì)量[1]。銀屑病的發(fā)病與遺傳、感染、環(huán)境和免疫等多重因素相關(guān)[2,3]。近來(lái)研究證實(shí)，IL-23/Th17軸在銀屑病發(fā)生發(fā)展中起重要作用[4]。目前，針對(duì)IL-23/Th17軸的藥物如Brodalumab、Ustekinumab等對(duì)中重度銀屑病患者表現(xiàn)出良好的療效，但停藥后容易復(fù)發(fā)[5,6]。

青蒿素是從菊科植物黃花蒿花蕾及葉中提取的一種具有高效抗瘧疾活性的中藥單體[7]，雙氫青蒿素(Dihydroartemisinin，DHA)是其衍生物之一。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，DHA在多種自身免疫性疾病(如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、狼瘡腎炎等)中表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗炎作用，且具有作用位點(diǎn)廣、毒性低等優(yōu)點(diǎn)[8,9]。我們的前期工作顯示，DHA可明顯抑制HaCaT細(xì)胞所分泌的IL-17A和IL-23等細(xì)胞因子的表達(dá)，提示DHA可能通過(guò)IL-23/Th17軸影響銀屑病的發(fā)生和發(fā)展[10]。近來(lái)研究證實(shí)，Th17分泌的細(xì)胞因子(IL-17、IL-22等)能夠作用于角質(zhì)形成細(xì)胞使其過(guò)度增殖，且分泌大量的促炎性介質(zhì)，同時(shí)這些促炎性介質(zhì)能夠刺激免疫細(xì)胞的活化，構(gòu)成維持銀屑病皮膚炎癥的惡性循環(huán)[11-13]?；谝陨涎芯勘尘拔覀兲岢鯠HA基于IL-23/Th17軸影響角質(zhì)形成細(xì)胞從而干預(yù)銀屑病發(fā)生和發(fā)展的可能性。因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)建立咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病模型，初步探討DHA是否通過(guò)影響角質(zhì)形成細(xì)胞抑制銀屑病的發(fā)生和發(fā)展，旨在為尋找新的治療銀屑病藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物 8～10周齡BALB/c雌性小鼠購(gòu)自延邊大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用和操作嚴(yán)格遵循延邊大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理委員會(huì)相關(guān)規(guī)定。

1.1.2主要試劑 DHA購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；咪喹莫特乳膏購(gòu)自美國(guó)3M Health Care Limit公司；羧甲基纖維素鈉(Carboxymethylcellulose sodium，CMC)購(gòu)自美國(guó)Amresco公司；兔抗鼠NF-κB(p65)、p-p38、p38、p-ERK，ERK一抗購(gòu)自CST公司；IL-1β、IL-6、IL-18及CXCL-1 ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1小鼠銀屑病模型的建立 8～10周齡雌性BALB/c小鼠剔除背部毛發(fā)，隨機(jī)分成正常組、模型組、DHA低劑量組[25 mg/(kg·d)]和DHA高劑量組[50 mg/(kg·d)]。將62.5 mg咪喹莫特乳膏連續(xù)涂抹小鼠背部皮膚6 d構(gòu)建銀屑病動(dòng)物模型，對(duì)照組給予同等劑量凡士林處理。DHA在咪喹莫特處理前1 h灌胃。每天觀察小鼠狀態(tài)，稱體重，根據(jù)銀屑、紅斑、皮膚增厚對(duì)各組小鼠進(jìn)行PASI臨床評(píng)分。

1.2.2小鼠皮膚組織病理檢測(cè) 第6天處死小鼠，取小鼠的皮膚組織用10%甲醛固定并制成石蠟切片，HE染色觀察小鼠的皮膚組織病理變化。

1.2.3免疫組化 取小鼠皮膚組織，制作石蠟切片經(jīng)脫蠟，檸檬酸緩沖液高溫高壓進(jìn)行抗原修復(fù)后，加入3%過(guò)氧化氫阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS清洗,室溫封閉30 min，加入1∶1 000 Anti-Ki67抗體于4℃避光孵育過(guò)夜，PBS清洗，二抗室溫孵育30 min，DAB染色，蘇木素復(fù)染。光鏡下觀察各組小鼠皮損表皮基底層中Ki67陽(yáng)性表達(dá)情況。

1.2.4ELISA 取第3天和第6天小鼠皮膚組織，以1∶9 的比例將皮膚組織加入PBS中研磨并提取上清，實(shí)驗(yàn)操作按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。簡(jiǎn)述如下，將待測(cè)樣品及標(biāo)準(zhǔn)品加入96孔板內(nèi)，加入一抗工作液，37℃孵育1 h，去除板內(nèi)液體，再次充分洗滌5次，加入顯色劑避光顯色15 min后，加入終止液，在450 nm處測(cè)吸光值。

1.2.5蛋白免疫印跡法 以1∶10的比例將皮膚組織加入蛋白裂解液中研磨并提取蛋白，再向提取的蛋白中加入含有DTT的上樣緩沖液煮沸變性，等量蛋白經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入適宜濃度一抗4℃封閉過(guò)夜，次日洗去未結(jié)合一抗，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，加入化學(xué)發(fā)光顯色液曝光顯影。

2 結(jié)果

2.1DHA改善IMQ誘導(dǎo)的小鼠銀屑病皮膚炎癥反應(yīng) DHA治療6 d后觀察各組小鼠背部皮膚變化。與模型組相比，DHA治療組小鼠皮膚紅斑、銀屑顯著減少，皮膚增厚明顯緩解，以DHA高劑量組更為顯著，并且DHA處理組PASI評(píng)分明顯低于模型組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1A、B)。HE染色結(jié)果顯示，相對(duì)于模型組，DHA治療組小鼠皮膚中表皮層明顯變薄且釘狀凸起明顯縮短，角化不全減少，伴隨炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，并且DHA高劑量組Munro微膿腫消失(圖1C)。以上結(jié)果提示，DHA可以明顯緩解咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣皮膚炎癥。

2.2DHA抑制銀屑病小鼠皮膚中角質(zhì)形成細(xì)胞的過(guò)度增殖 使用免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)各組小鼠皮膚中Ki67陽(yáng)性表達(dá)情況。如圖2所示，與對(duì)照組相比，模型組Ki67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯增加，而給藥組的Ki67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯少于模型組。以上結(jié)果提示，DHA能夠抑制銀屑病小鼠皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的過(guò)度增殖。

2.3DHA抑制銀屑病樣小鼠皮損中角質(zhì)形成細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá) DHA處理后的第3天和第6天取小鼠皮損組織，經(jīng)ELISA法檢測(cè)組織上清中的細(xì)胞因子與趨化因子的表達(dá)。如圖3所示，模型組小鼠在第3天和第6天皮膚上清液中IL-1β、IL-18、IL-6、CXCL-1表達(dá)明顯上升，但是經(jīng)過(guò)不同濃度DHA治療后，表達(dá)明顯下降，并且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。有趣的是，第6天高劑量組IL-6的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果提示，DHA能夠抑制角質(zhì)形成細(xì)胞所分泌的促炎性細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生。

圖2 DHA抑制銀屑病小鼠皮膚中角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖Fig.2 DHA inhibited proliferation of keratinocytesin in psoriasis-like skin lesionsNote: Immunohistochemical images of keratinocytes proliferation in mice skin.Red arrow mean Ki67 positive cell.Scale bar=100 μm.

圖3 DHA抑制銀屑病樣小鼠皮損中角質(zhì)形成細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)Fig.3 DHA inhibited expression of inflammatory cytokines in psoriasis-like skin lesionsNote: ELISA was performed to determine levels of IL-1β,IL-18,IL-6 and CXCL-1 in skin tissue.#.P PP PP P

圖4 DHA抑制銀屑病樣小鼠皮膚中NF-κB(p65)、p-p38和p-ERK的表達(dá)Fig.4 DHA inhibited expression of NF-κB(p65),p-p38 and p-ERK in psoriasis-like skin lesionsNote: Protein levels of NF-κB(p65),which in nuclear,p-p38，p-ERK，p38 and ERK in the skin of mice.β-actin was used to confirm equal amount of protein.###.P PP P

2.4DHA抑制銀屑病樣小鼠皮膚中NF-κB(p65)、p-p38和p-ERK的表達(dá) 經(jīng)蛋白印跡試驗(yàn)檢測(cè)DHA給藥后皮損中NF-κB和MAPK信號(hào)通路的表達(dá)變化。如圖4所示，與正常組相比，模型組小鼠皮膚中NF-κB(P65)、p-p38和p-ERK水平增加，加入DHA后，低劑量組和高劑量組均能顯著抑制NF-κB(p65)和p-p38水平，但只有在高劑量組時(shí)，p-ERK的表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。以上結(jié)果說(shuō)明DHA可能通過(guò)抑制NF-κB和MAPK信號(hào)通路，緩解咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病樣皮膚炎癥。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，DHA可以顯著緩解咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣皮膚炎癥反應(yīng)。最近研究證實(shí)，銀屑病皮損中角質(zhì)形成細(xì)胞在Th17細(xì)胞所分泌炎癥細(xì)胞因子IL-17和IL-22的刺激下，細(xì)胞內(nèi)的Nrf2和Keap1分離，而分離后的Nrf2磷酸化轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，在那里與角質(zhì)形成細(xì)胞的角蛋白K6、K16和K17結(jié)合并上調(diào)它們的表達(dá)，導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖[14]。Li等[15]證明橘皮苷通過(guò)抑制角質(zhì)形成細(xì)胞中的IRS-1Ser312的磷酸化以及p-ERK的表達(dá)，明顯抑制銀屑病樣皮膚炎癥中角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖，進(jìn)而改善銀屑病樣皮膚炎癥反應(yīng)。此外研究發(fā)現(xiàn)，瞬時(shí)感受器電位香草酸受體Ⅰ型(TRPV1)基因敲除小鼠能夠明顯抑制銀屑病皮損中角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖以及炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，進(jìn)而改善銀屑病樣皮膚炎癥反應(yīng)[16]。本研究結(jié)果顯示，相對(duì)于模型組，DHA處理組小鼠皮損中Ki67陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量明顯減少。以上結(jié)果提示，DHA通過(guò)抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖緩解銀屑病的可能性。

角質(zhì)形成細(xì)胞受到促炎性細(xì)胞因子(如IL-17、IL-22和IFN-γ等)刺激時(shí)，跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白PlexinB2表達(dá)上升，活化NLRP3炎癥小體，導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞分泌大量促炎性細(xì)胞因子和趨化因子，包括IL-1β、IL-18、CXCL-1和CCL-20等[13]。這些細(xì)胞因子和趨化因子在銀屑病的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用。Cai等[17]發(fā)現(xiàn)在銀屑病皮損中IL-1β能夠協(xié)同IL-23促進(jìn)γδT細(xì)胞增殖，進(jìn)而產(chǎn)生大量的IL-17。相關(guān)研究顯示，在銀屑病中IL-18能與Th1細(xì)胞表面的IL-18R結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)IFN-γ的產(chǎn)生[18]。此外，IL-6與T細(xì)胞膜表面的IL-6受體gp130結(jié)合，通過(guò)STAT3通路刺激Th17細(xì)胞活化[19]。趨化因子CXCL-1能夠與中性粒細(xì)胞表面受體CXCR2結(jié)合，使其浸潤(rùn)至皮膚組織引起皮膚銀屑病樣炎癥反應(yīng)[20]。近來(lái)研究表明，TRPV1的缺失能明顯抑制銀屑病小鼠皮膚中IL-1β、IL-6、IL-23和S100A8的表達(dá)，進(jìn)而緩解小鼠銀屑病樣皮膚炎癥反應(yīng)[16]。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)抗壞血酸衍生物DDH-1通過(guò)抑制咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣皮膚中炎性細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α的表達(dá)，改善小鼠銀屑病樣皮膚炎癥[21]。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，第3天和第6天DHA治療組小鼠皮膚中細(xì)胞因子IL-1β、IL-18、IL-6和趨化因子CXCL-1的表達(dá)水平明顯降低。以上結(jié)果提示，DHA能夠減少角質(zhì)形成細(xì)胞分泌的促炎性細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生。

NF-κB是細(xì)胞內(nèi)的一個(gè)重要轉(zhuǎn)錄因子，它的激活可誘導(dǎo)一些炎癥細(xì)胞因子釋放，在調(diào)控免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)中具有重要作用[22]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)則是一種絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶，當(dāng)細(xì)胞受到胞外刺激時(shí)通過(guò)酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)把信號(hào)傳遞至核內(nèi)，并通過(guò)調(diào)控下游的轉(zhuǎn)錄因子，從而調(diào)控多種細(xì)胞因子的表達(dá)，對(duì)調(diào)控炎癥反應(yīng)起著關(guān)鍵性作用[23]。最近研究表明，皮膚組織中角質(zhì)形成細(xì)胞受到刺激時(shí)，NF-κB和MAPK信號(hào)通路被激活，導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)度增殖并分泌大量的細(xì)胞因子，進(jìn)而促進(jìn)銀屑病的發(fā)生和發(fā)展[13,24,25]。同時(shí)研究表明，低劑量羥氯喹和青蒿素的聯(lián)合應(yīng)用通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB的表達(dá)水平，改善系統(tǒng)性紅斑狼瘡導(dǎo)致的脾臟和腎臟的損傷[26]。本研究結(jié)果顯示，DHA處理后可顯著抑制小鼠皮損組織中NF-κB(p65)、p-p38和p-EKR的表達(dá)。以上結(jié)果表明，給予DHA可以顯著抑制NF-κB和MAPK信號(hào)通路的激活，提示DHA的抗炎作用可能與NF-κB和MAPK信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，DHA改善咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣皮膚炎癥反應(yīng)，其可能機(jī)制是通過(guò)MAPK/NF-κB信號(hào)通路抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的過(guò)度增殖及其所分泌的細(xì)胞因子。DHA表現(xiàn)出來(lái)的較強(qiáng)的抗炎作用，使其有望成為一種新型的抗銀屑病藥物。