張敬蕊，劉 力，王怡倩，楊如剛，許彩虹，劉菁菁，葉長(zhǎng)蕓

單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes，Lm)廣泛存在于自然環(huán)境中，是一種重要的食源性感染致病菌，可導(dǎo)致人和動(dòng)物李斯特菌病[1]。Lm感染類型主要分為兩大類，一類為侵襲性感染，主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎及腦膜腦炎，死亡率較高；老幼、孕婦和免疫力低下的人群易感；圍產(chǎn)期孕婦感染Lm主要表現(xiàn)為流產(chǎn)、早產(chǎn)、以及死胎，胎兒感染后可發(fā)生新生兒敗血癥和腦膜炎。第二類為非侵襲性感染，即免疫力正常的健康人群進(jìn)食了被大量Lm污染的食品后出現(xiàn)發(fā)熱性胃腸炎癥狀，這類感染多為自限性，容易被忽視[2]。國(guó)內(nèi)腹瀉病人糞便中檢出Lm的報(bào)道很少，高波等[3]在410份腹瀉病人糞便標(biāo)本中分離到1株Lm。本研究從1例哺乳期患者糞便中分離到1株Lm，報(bào)道如下。

1 病 例

患者，28歲，哺乳期女性，嬰兒6個(gè)月。發(fā)病經(jīng)過(guò)：在進(jìn)食一個(gè)甜瓜和飲用冰箱冷藏的酸奶1 d后，出現(xiàn)腹瀉癥狀，最多時(shí)可達(dá)6～7次/ d。腹瀉第2 d就診于當(dāng)?shù)卦\所，口服黃連素治療，癥狀緩解，腹瀉次數(shù)減少，腹瀉2～3次/ d，大便仍為黏液狀。于2018年5月10日就診于我院內(nèi)科，詢問(wèn)病人初期情況，考慮急性胃炎，患者無(wú)發(fā)熱。實(shí)驗(yàn)室檢查：血常規(guī)白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞正常、C反應(yīng)蛋白正常；便常規(guī)：黃色稀便，白細(xì)胞3～4個(gè)/HP，潛血陰性，輪狀病毒和腺病毒檢測(cè)陰性。2018年5月15日糞便培養(yǎng)結(jié)果為L(zhǎng)m陽(yáng)性，因患者青霉素過(guò)敏，口服紅霉素進(jìn)行治療。2018年5月23日，患者復(fù)查便常規(guī)(黃色軟便，未見(jiàn)白細(xì)胞和紅細(xì)胞，潛血陰性)、便培養(yǎng)(未檢出Lm)。治療后患者未再出現(xiàn)腹瀉癥狀；在此期間嬰兒無(wú)腹瀉癥狀。

2 分離培養(yǎng)結(jié)果

參照《感染性腹瀉診斷標(biāo)準(zhǔn) WS271-2007》和《細(xì)菌性腹瀉臨床實(shí)驗(yàn)室診斷操作指南WS/T498-2017》[4]和相關(guān)文獻(xiàn)[5]分離培養(yǎng)腹瀉相關(guān)病原菌。

2.1志賀菌檢測(cè) 挑取適量糞便標(biāo)本分別加入接種于HE培養(yǎng)基和MAC培養(yǎng)基，36 ℃培養(yǎng)18 h，未檢出志賀菌。

2.2沙門菌檢測(cè) 挑取適量糞便接種于SBG增菌液，36 ℃培養(yǎng)18 h，轉(zhuǎn)種于沙門菌顯色平板和HE培養(yǎng)基，36 ℃培養(yǎng)18 h，未檢出沙門菌。

2.3致瀉性大腸桿菌和O157大腸桿菌檢測(cè) 將標(biāo)本接種于EMB、MAC和O157顯色培養(yǎng)基，36 ℃培養(yǎng)18 h，未檢出致瀉性大腸桿菌和O157大腸桿菌。

2.4Lm檢測(cè) 挑取適量糞便標(biāo)本接種于LB1 增菌液中，放入30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h，吸取LB1培養(yǎng)物1 mL 加入到 LB2 增菌液中， 30 ℃二次增菌培養(yǎng)18 h；取LB2 培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于李斯特菌顯色培養(yǎng)基(CHROMagar)，36 ℃培養(yǎng)18 h。顯色培養(yǎng)基上出現(xiàn)藍(lán)色、周圍有透明暈環(huán)的菌落(圖1)，接種于血平板后生長(zhǎng)的菌落光滑濕潤(rùn)，灰白色，可產(chǎn)生窄小的β-溶血環(huán)(圖2)。挑取可疑菌落進(jìn)行革蘭染色，采用細(xì)菌鑒定儀進(jìn)行鑒定。

圖1 李斯特菌顯色培養(yǎng)基(CHROMagar)上生長(zhǎng)菌落Fig.1 Colonies growing on Listeria chromogenic medium (CHROMagar)

圖2 血平板上生長(zhǎng)的疑似菌落Fig.2 Suspected colonies growing on blood plate

3 Lm的鑒定

對(duì)可疑菌落進(jìn)行涂片染色，結(jié)果為革蘭陽(yáng)性桿菌。同時(shí)將可疑菌落穿刺于半固體培養(yǎng)管進(jìn)行動(dòng)力試驗(yàn)，30 ℃培養(yǎng)箱中24 h，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果為動(dòng)力陽(yáng)性，取菌落的純培養(yǎng)物經(jīng)VITEK- 2 COMPACT30 全自動(dòng)細(xì)菌分析儀鑒定系統(tǒng)鑒定為L(zhǎng)m。實(shí)驗(yàn)采用ATCC19115菌株作為L(zhǎng)m質(zhì)控菌株。

4 Lm血清型、PFGE分析、MLST分型和毒力基因檢測(cè)

4.1使用日本Denka-Seiken公司的血清抗體，按照產(chǎn)品的說(shuō)明書(shū)對(duì)分離到的Lm進(jìn)行血清型檢測(cè)，證實(shí)該分離株為4b血清型。

4.2參照法國(guó)巴斯德研究所Lm多位點(diǎn)序列分型(MLST)數(shù)據(jù)庫(kù)的操作流程(http://www.pasteur.fr/recherche/genopole/PF8/mlst/Lmoono. html)，采用PCR方法，對(duì)Lm 7個(gè)管家基因(abcZ，blgA，cat，dapE，dat，ldh，lhkA)的部分片段進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序，將獲得的基因序列與MLST數(shù)據(jù)庫(kù)信息進(jìn)行比對(duì)分析，證實(shí)分離的Lm菌株為ST145型，屬于家系I的CC2克隆群。

4.3按照CDC PluseNet標(biāo)準(zhǔn)化操作方法，應(yīng)用脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)對(duì)Lm分析，采用AscI和ApaI對(duì)Lm進(jìn)行酶切，菌株DNA電泳圖像使用BioNumerisc軟件分析，并與中國(guó)CDC病原菌識(shí)別網(wǎng)中的單增李斯特菌數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，確定Lm分離株為GX6A16.CN0033型。

4.4參照相關(guān)文獻(xiàn)[6-7]進(jìn)行毒力基因檢測(cè)，本研究病例分離的Lm攜帶毒力基因plcB、act、hly、iap、prfA、inlA。

5 藥敏試驗(yàn)

按照2018年CLSI(美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì))標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用溫州康泰的E-test條，采用E-test方法對(duì)Lm分離株進(jìn)行5種抗生素的藥敏試驗(yàn)，結(jié)果證實(shí)其對(duì)青霉素、氨芐西林、美羅培南、紅霉素和復(fù)方磺胺均敏感。

6 討 論

Lm是一種重要的食源性病原菌，能引起人的侵襲性及非侵襲性感染[8]。Lm能產(chǎn)生溶血素，對(duì)人的致病性較強(qiáng)，可引起成人腹瀉，尤其容易導(dǎo)致老年人、孕婦、新生兒和免疫缺陷患者感染發(fā)生李斯特菌病[9]。文獻(xiàn)[10]報(bào)道健康成年人對(duì)Lm具有抵抗性，暴露后僅發(fā)生輕度胃腸炎，且具有自限性。Lm 可突破腸道黏膜屏障，進(jìn)入肝細(xì)胞進(jìn)行繁殖和擴(kuò)增，并可通過(guò)血液系統(tǒng)在體內(nèi)擴(kuò)散，能被T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)清除[11]。高波等[3]從410份腹瀉病人便標(biāo)本中分離到1株Lm，提示Lm可感染人群可引起不可自愈的腹瀉癥狀。本例患者食用甜瓜和冰箱保存的酸奶后發(fā)生未能自愈的較嚴(yán)重的李斯特菌性腹瀉，可能與感染的Lm菌量、菌株型別以及機(jī)體免疫力等有關(guān)，因此對(duì)于臨床腹瀉患者糞便標(biāo)本的檢測(cè)病原應(yīng)該包括Lm，避免漏診及不良預(yù)后。

我國(guó)北京通州、河北、福建以及黑龍江等多個(gè)地方在食品中Lm分離株主要為1/2a血清型[12]，不同血清型Lm菌株的致病力有所不同，98%以上人類李斯特菌病主要由1/2a、1/2b、1/2c和4b等血清型引起[13]。李秀娟等[14]報(bào)道石家莊地區(qū)李斯特菌食源性感染分離的Lm菌株血清型為1/2a型、2b型、1/2c型和4b型，其中1/2a型菌株數(shù)量最多。閆鶴等[15]分析河北省91株食源性致病李斯特菌證實(shí)主要血清型為1/2a型。大部分人類李斯特菌病由4b血清型Lm菌株引起，腦膜炎病人樣本中4b型Lm菌株的分離率明顯高于一般患者，而且4b血清型Lm感染者的死亡率(26%)顯著高于1/2血清型(1/2a、1/2b和1/2c)菌株感染患者(16%)[16]。本例患者分離的菌株也為4b型，該型菌株在消化道中的耐受力是否更強(qiáng)以及和(或)比其他型別菌株進(jìn)入宿主細(xì)胞的效率更高，有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。

Sylvain等[17]對(duì)來(lái)源于五大洲的300株單增李斯特菌進(jìn)行基因型分析發(fā)現(xiàn)，家系Ⅰ中CC3克隆群是一個(gè)世界性分布的流行克隆群。本例患者分離的Lm為ST145型屬于CC2克隆群，ST145型菌株最早在俄羅斯海參崴地區(qū)的嚙齒動(dòng)物和河流淤泥中分離出，且與ST2比較屬于同一克隆復(fù)合群[18-19]。甘霖等[20]從云南滇池棲息的候鳥(niǎo)-紅嘴鷗糞便中分離到ST145型Lm菌株，其基因組與本例病人分離的菌株具有高度的同源性，而我國(guó)此前尚未有關(guān)從食品、環(huán)境及病人分離到ST145型Lm的報(bào)道，因此由紅嘴鷗等跨國(guó)遷徙的候鳥(niǎo)所導(dǎo)致的高致病性Lm傳入我國(guó)對(duì)人群具有較高的感染風(fēng)險(xiǎn)。

王紅等[2]報(bào)道四川省自貢市分離的3株Lm臨床分離菌株為ST8型、ST778型；王艷等[21]對(duì)28例臨床病人分離單增李斯特菌分析發(fā)現(xiàn)了1/2b血清型的ST87和ST3型菌株為病人感染的優(yōu)勢(shì)菌型；張曉嬡等[22]對(duì)北京市49例李斯特菌病人分離的Lm進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)菌株為ST8、ST5、ST87型。提示石家莊地區(qū)食源性感染的Lm 存在和我國(guó)其他地區(qū)不同的ST型別。本例患者腹瀉癥狀明顯、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，是否與ST145型Lm特殊的致病性有關(guān)還需進(jìn)一步研究證實(shí)。Lm的致病性與其毒力基因有密切相關(guān)性，缺失毒力基因?qū)?huì)導(dǎo)致其致病性消失或下降。本例患者分離的Lm 攜帶6種毒力基因，與2005-2011年(無(wú)2009年)石家莊市地區(qū)食品中分離Lm菌株一致[14]。

由于缺乏當(dāng)?shù)赝诘氖称芳傍B(niǎo)類等來(lái)源菌株的相關(guān)信息，無(wú)法對(duì)本例患者感染的來(lái)源進(jìn)行追溯。但作為我國(guó)首例ST145型菌株引起的感染病例報(bào)道，對(duì)于監(jiān)測(cè)該型菌株在我國(guó)的分布狀況、評(píng)價(jià)動(dòng)物輸入性李斯特菌病的感染風(fēng)險(xiǎn)分析及制定有效的防控措施具有重要意義。

李斯特菌病尚未納入我國(guó)法定傳染病的范疇，缺乏對(duì)于人群感染風(fēng)險(xiǎn)及臨床李斯特菌病發(fā)病率的相關(guān)數(shù)據(jù)，已有報(bào)道以食源性單增李斯特菌分析為多。近年來(lái)各地報(bào)道的李斯特菌臨床病例不斷增加，而單增李斯特菌引起的腹瀉患者容易漏診，臨床機(jī)構(gòu)應(yīng)加強(qiáng)孕婦等高危人群腹瀉患者糞便標(biāo)本中Lm的檢測(cè)，這對(duì)于李斯特菌病病人的及時(shí)治療和避免不良預(yù)后具有重要意義。

利益沖突：無(wú)

引用本文格式：張敬蕊，劉力，王怡倩，等.1例產(chǎn)后哺乳期腹瀉患者分離單增李斯特菌的生物學(xué)特征分析[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2020，36(2)：169-172. DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2020.00.021