羅 明，張匯征，嚴(yán)曉峰，曹培明，廖傳玉，何 瑛，李曉旭，王 靜，李同心，陳耀凱

結(jié)核病(tuberculosis，TB)由結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)引起，是威脅人類健康的重要傳染病之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織(world health organization，WHO)估計(jì)，2018年全球約有1 000萬新發(fā)結(jié)核病例[1]。由于長期沒有新的抗結(jié)核藥物推出，結(jié)核病的耐藥問題日益嚴(yán)重。據(jù)WHO估計(jì)，2018年全球共新發(fā)約39萬例耐多藥結(jié)核(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)，其中約6.2%為廣泛耐藥結(jié)核(extensively drug-resistant tuberculosis，XDR-TB)[1]。MDR-TB的治療非常困難，不僅療程長，費(fèi)用高，而且治愈率僅為56%左右，而XDR-TB的治愈率更是低至39%[1-2]。貝達(dá)喹啉(bedaquiline，Bdq)和德拉馬尼(delamanid，Dlm)是近50年來首次推出的具有全新作用機(jī)制的抗結(jié)核藥物，因此引起了廣泛關(guān)注，但目前國內(nèi)少見有關(guān)這兩種藥物耐藥性的研究[3-4]。本研究通過檢測(cè)貝達(dá)喹啉和德拉馬尼對(duì)重慶市MDR-TB臨床分離菌株的體外抑菌活性，初步了解重慶市MDR-TB菌株對(duì)這兩種新藥的敏感性，為兩種藥物的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株來源 共有111株MDR-TB臨床分離結(jié)核分枝桿菌菌株納入研究。所有菌株均來自2017年11月至2018年11月間經(jīng)重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心結(jié)核實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)分離并經(jīng)藥敏試驗(yàn)鑒定為MDR-TB的陽性培養(yǎng)物。標(biāo)準(zhǔn)菌株為中國疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室提供的結(jié)核分枝桿菌H37Rv(ATCC27294)。

1.2試劑和儀器 中性羅氏培養(yǎng)基和結(jié)核分枝桿菌藥敏檢測(cè)試劑盒(比例法)由珠海銀科醫(yī)學(xué)工程有限公司生產(chǎn)。7H9肉湯培養(yǎng)基、OADC增菌液、吐溫80及DMSO均購自西格瑪公司。Bdq、Dlm(純度≥98%)購自杭州光遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司。刃天青鈉購自生工生物工程(上海)股份有限公司。細(xì)菌超聲分散計(jì)數(shù)儀由廣東希格生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.3 方 法

1.3.1比例法藥敏檢測(cè) 參照結(jié)核分枝桿菌藥敏檢測(cè)試劑盒說明書及《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》，對(duì)分枝桿菌陽性培養(yǎng)物進(jìn)行利福平(rifampin，Rif，40 μg/mL)、異煙肼(isoniazid， H，0.2 μg/mL)、鏈霉素(streptomycin，Sm，4 μg/mL)、乙胺丁醇(ethambutol，E，2 μg/mL)、對(duì)氨基水楊酸(para-aminosalicylic acid，Pas，1 μg/mL)、阿米卡星(amikacin，Am，30 μg/mL)、利福噴丁(rifapentine，Rft，40 μg/mL)、丙硫異煙胺(prothionamide，Pto，40 μg/mL)、卷曲霉素(capromycin，Cm，40 μg/mL)、左氧氟沙星(Levofloxacin，Lfx，2 μg/mL)等抗結(jié)核藥物藥敏檢測(cè)，耐藥判定標(biāo)準(zhǔn)參照WHO的相關(guān)推薦標(biāo)準(zhǔn)[5-6]。使用對(duì)硝基苯甲酸(p-nitrobenzoic acid, PNB)鑒別結(jié)核分枝桿菌(tuberculosis，TB)與非結(jié)核分枝桿菌(non-tuberculosis mycobacterium，NTM)，菌株在PNB生長判定為NTM[5]。

1.3.2最小抑菌濃度法(minimum inhibitory concentration, MIC)藥敏檢測(cè) 采用最小抑菌濃度法(MIC)檢測(cè)MTB臨床分離株對(duì)Bdq和Dlm的敏感性。按照《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》操作，倍比稀釋制備含Bdq和Dlm的96孔板，藥物濃度梯度均設(shè)置為0.016至16 mg/L[5]。刮取羅氏培養(yǎng)基上處于生長對(duì)數(shù)期的培養(yǎng)物，經(jīng)超聲分散重懸后，用7H9培養(yǎng)基配成1個(gè)麥?zhǔn)蠞舛热芤海?∶10稀釋至含10% OADC的7H9培養(yǎng)基中。在制備好的藥敏平板每孔加入稀釋后的菌液100 μL，37 ℃恒溫培養(yǎng)7 d。每孔加入20 μL刃天青顯色液，再在37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察顯色讀取MIC，完全沒有變色的最小藥物濃度即為該菌株對(duì)這種藥物的MIC[5, 7]。根據(jù)文獻(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)中Bdq和Dlm的耐藥臨界濃度分別設(shè)置為0.25 mg/L和0.06 mg/L[7-9]。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。以卡方檢驗(yàn)檢測(cè)各組之間差異，當(dāng)n<5時(shí)，以fisher精確概率法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1貝達(dá)喹啉及德拉馬尼的藥物敏感性 111株菌株均完成了Bdq藥敏檢測(cè)，有109株菌株完成了Dlm藥敏檢測(cè)。如表1中所示，對(duì)Bdq，大部分菌株的MIC都小于0.031 mg/L，MIC50和MIC90分別為0.016 mg/L和0.125 mg/L；對(duì)Dlm，大部分菌株的MIC小于0.016 mg/L，MIC50和MIC90分別為0.016 mg/L和0.063 mg/L。各有5株菌株對(duì)兩種藥物耐藥，Bdq的耐藥率為4.50%，Dlm的耐藥率為4.59%。

表1 Bdq和Dlm藥物敏感性情況Tab.1 Drug-susceptibility test for bedaquiline and delamanid in MDR-TB isolates

2.2貝達(dá)喹啉與其他藥物的耐藥相關(guān)性 111株MDR-TB菌株的比例法藥敏結(jié)果如表2所示。對(duì)Bdq的耐藥率以XDR-TB最高(8.00%)，其次為耐Pto的MDR-TB(7.89%)，最低的是pre-XDR-TB(2.00%)，但各組與MDR-TB菌株的Bdq耐藥率之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。5株Bdq耐藥株的耐藥譜如表4所示。

表2 MDR-TB菌株比例法藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Drug-susceptibility results of MDR-TB isolates by proportion method

表3 不同耐藥類型菌株的Bdq耐藥情況Tab.3 Drug-susceptibility of bedaquiline in different drug-resistant types

表4 貝達(dá)喹啉耐藥菌株的耐藥譜Tab.4 Drug-susceptibility profile of bedaquiline resistant isolates

* R，耐藥；S，敏感。

2.3德拉馬尼與其他藥物的耐藥相關(guān)性 109例MDR-TB菌株完成Dlm藥敏檢測(cè)，對(duì)Dlm的耐藥率以XDR最高(8.70%)，其次為耐Pto的MDR-TB(8.11%)，最低的是耐E+Sm的MDR-TB(3.45%)，各組與MDR-TB菌株的Dlm耐藥率之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表5。5株Dlm耐藥株的耐藥譜如表6所示。

表5 不同耐藥類型菌株的德拉馬尼耐藥情況Tab.5 Drug-susceptibility of delamanid in different drug-resistant types

表6 德拉馬尼耐藥菌株的耐藥譜Tab.6 Drug-susceptibility profile of delamanid resistant isolates

* R，耐藥；S，敏感。

3 討 論

中國是結(jié)核病和耐藥結(jié)核病雙重高負(fù)擔(dān)國家，2018年估計(jì)有86.6萬新發(fā)及復(fù)發(fā)結(jié)核病例，其中6.6萬為MDR-TB或耐利福平結(jié)核(rifampin-resistant tuberculosis，RR-TB)[1]。貝達(dá)喹啉是一種二芳基喹啉類化合物，通過與MTB的ATP合成酶C亞基結(jié)合，抑制MTB的ATP合成，從而發(fā)揮抑菌和殺菌作用[10-11]。德拉馬尼屬于硝基咪唑類藥物，通過抑制分枝菌酸合成使MTB細(xì)胞壁合成受到抑制從而發(fā)揮作用[12]。目前認(rèn)為這兩種新藥由于其作用機(jī)制與以往抗結(jié)核藥物不同，因而在耐藥結(jié)核病尤其是MDR-TB治療上有很好的應(yīng)用前景[13]。在2019年WHO發(fā)布的耐藥結(jié)核病治療整合版指南中，Bdq和Dlm分別被列為MDR-TB治療的A組和C組藥物[14]。

迄今，有關(guān)Bdq和Dlm的可靠藥敏檢測(cè)體系仍未完全建立，目前研究多以MIC來描述其抗性[15]。在已有的研究中，不同地區(qū)的MTB對(duì)Bdq的MIC存在差異。在本研究中，大部分菌株對(duì)Bdq的MIC低于0.063 mg/L，與南非的結(jié)果、我國胡彥以及Pang等的研究結(jié)果一致，而與韓國研究中MIC主要處于0.125至0.25 mg/L不同[7, 16-18]。從本研究中Dlm的MIC分布上來看，大部分菌株對(duì)Dlm的MIC介于0.016 mg/L至0.063 mg/L之間，與韓國及我國Pang等的研究結(jié)果基本一致[7, 18]。造成這些差異的原因是否是由于各個(gè)地區(qū)流行菌株譜系的不同，還需要進(jìn)一步的研究。

國外已有研究報(bào)道了Bdq和Dlm的獲得性耐藥和原發(fā)性耐藥，而這兩種藥物在我國剛獲得批準(zhǔn)，尚未在臨床大規(guī)模使用，因此我們判斷本研究中的耐藥菌株應(yīng)屬于原發(fā)耐藥[19-20]。2016年，胡彥等報(bào)道287株MDR-TB中，Bdq耐藥率為6.6%，且北京基因型菌株的耐藥率(4.6%)低于非北京基因型菌株的耐藥率(10.9%)[17]。而Pang等人對(duì)北京胸科醫(yī)院XDR-TB菌株的研究結(jié)果顯示，對(duì)Bdq的耐藥率為3.3%，對(duì)Dlm的耐藥率為4.4%[7]。韓國的研究顯示，420株MDR-TB和XDR-TB中，Bdq的耐藥率為11%，Dlm的耐藥率為10%[18]。在本研究中，Bdq和Dlm均表現(xiàn)出了很好的抗結(jié)核作用，檢出的耐藥率分別僅為4.50%和4.59%。研究結(jié)果顯示，重慶市MDR-TB的Bdq的耐藥率低于韓國的研究以及胡彥等的研究，但是與胡彥研究中北京基因型菌株的耐藥率非常接近[17-18]；同時(shí)，Dlm的耐藥率與Pang的研究結(jié)果接近，但低于韓國的研究結(jié)果[7, 18]。是流行菌株的不同還是不同地區(qū)菌株耐藥譜的不同造成了這些差異，仍需進(jìn)一步研究。

在本研究中，盡管不同藥物耐藥組合類型的菌株對(duì)Bdq和Dlm的耐藥率之間并未表現(xiàn)出差異，但5株Bdq耐藥株均對(duì)4種一線藥(RIF、INH、Sm、EMB)全部耐藥，與胡彥的報(bào)道一致[17]。5株耐Dlm的菌株對(duì)5種抗結(jié)核藥物(R、H、E、Rft、Lfx)全部耐藥；10株Bdq和Dlm耐藥株均為pre-XDR或XDR，提示隨著耐受藥物的增多，菌株對(duì)Bdq和Dlm的敏感性有可能降低[17]。已有研究顯示，氯法齊明(Clo)與Bdq有交叉耐藥現(xiàn)象，而Clo已經(jīng)運(yùn)用于我國的TB治療中，是否是Clo的使用造成了Bdq的耐藥，尚需要進(jìn)一步研究[21]。

本研究也存在一些不足：第一，樣本僅來源于一家結(jié)核病?？漆t(yī)院，有可能導(dǎo)致結(jié)果的偏倚；第二，兩種藥物均為新的抗結(jié)核藥物，耐藥率低，導(dǎo)致檢出的耐藥株較少，降低了統(tǒng)計(jì)分析的可靠性，下一步仍需要更大樣本量的多中心研究。

通過本研究，我們初步明確了重慶市MDR-TB對(duì)Bdq和Dlm的藥敏MIC分布情況，結(jié)果表明重慶市大部分MDR-TB菌株對(duì)這兩種新的抗結(jié)核藥物非常敏感。同時(shí)我們也注意到，盡管這兩種藥物尚未在重慶投入臨床使用，但仍不應(yīng)忽視原發(fā)耐藥，說明在制定臨床治療方案時(shí)，仍需重視對(duì)新藥的藥敏檢測(cè)。也許對(duì)醫(yī)生而言，面臨的最大挑戰(zhàn)是如何使用這些新藥來設(shè)計(jì)一種有效的方案，以防止TB對(duì)這些新藥物產(chǎn)生獲得性耐藥[22]。

利益沖突：無

引用本文格式：羅明，張匯征，嚴(yán)曉峰，等.重慶市耐多藥結(jié)核分枝桿菌對(duì)貝達(dá)喹啉和德拉馬尼的藥物敏感性研究[J].中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2020，36(2)：100-104. DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2020.00.024