朱昱蓉，史 倩，盧 葉，凌 薇，袁 琳，楊詩(shī)嫻，王蓓蕾，姜旭淦，陳盛霞

單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes，Lm)簡(jiǎn)稱單增李斯特菌，是一種革蘭陽(yáng)性胞內(nèi)寄生桿菌，在2000年被WHO列為四大食源性致病菌之一[1]。臨床上Lm感染率低，但致死率極高[2]。Lm可通過(guò)人體的3大屏障：血腦屏障，血腸屏障(腸道屏障)以及胎盤屏障，引起細(xì)菌性腦膜炎、細(xì)菌性腸胃炎、流產(chǎn)、死胎等疾病[1]。胎盤屏障主要由滋養(yǎng)層細(xì)胞、微血管內(nèi)皮細(xì)胞以及兩者之間的基底膜構(gòu)成，是藥物、病毒、細(xì)菌以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在胎兒與母體之間傳遞的必經(jīng)之路[3]。其中，作為胎盤屏障第一道屏障的滋養(yǎng)層細(xì)胞直接與母體接觸，在胎盤屏障中起重要作用。滋養(yǎng)層細(xì)胞向子宮的適度遷移對(duì)正常妊娠的維持起重要作用。滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移受嚴(yán)格的時(shí)空限制，細(xì)胞異常遷移與流產(chǎn)、子癇和胎兒異常生長(zhǎng)等病理狀態(tài)的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4]，其中基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)在調(diào)控滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲遷移過(guò)程中起重要作用[5]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、炎癥和轉(zhuǎn)化等生理過(guò)程[6-8]，是胞內(nèi)外轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，主要包括p38MAPK、ERK1/2及JNK等3條通路。研究表明，MAPK家族在胎盤屏障抵御外界病原體感染以及調(diào)控MMPs[9]的表達(dá)中發(fā)揮著重要作用。本文以胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞系Bewo細(xì)胞為模型，研究Lm感染引起滋養(yǎng)層細(xì)胞相關(guān)炎癥反應(yīng)及其對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移能力、遷移相關(guān)蛋白的影響，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行研究，為L(zhǎng)m感染所致的流產(chǎn)等疾病提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1細(xì)胞與菌株 實(shí)驗(yàn)用單核細(xì)胞增生李斯特菌EGD株由天津醫(yī)科大學(xué)申艷娜博士惠贈(zèng)，胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞Bewo細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)(武漢)。

1.1.2主要試劑 胎牛血清和F12-K培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco，腦心浸出液肉湯(BHI)購(gòu)自北京路橋技術(shù)股份有限公司，PCR引物由上海生工合成，Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR試劑均購(gòu)自南京Vazyme公司，MMP2、MMP9抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司，p38MAPK、p-p38MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2、TIMP-1抗體購(gòu)自萬(wàn)類生物，HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗、HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗購(gòu)自康為世紀(jì)，ECL顯色液購(gòu)自Millipore公司。

1.1.3主要儀器 二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermofisher公司，恒溫空氣浴搖床購(gòu)自?，敼?，普通PCR儀購(gòu)自天能公司，熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI StepOnePlus公司， Western Blot電泳儀購(gòu)自美國(guó)BioRad公司，Imge Quant LAS 4000 mini購(gòu)自美國(guó)GE公司。

1.2 方 法

1.2.1Lm及Bewo細(xì)胞的培養(yǎng) Lm接種于BHI培養(yǎng)液中，37 ℃ 250 r/min恒溫空氣浴搖床過(guò)夜培養(yǎng)。Bewo細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，用含10%胎牛血清的F12-K培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中，4～5 d傳代1次，傳代時(shí)用含EDTA的0.25%胰酶消化5 min。

1.2.2Bewo細(xì)胞炎癥因子檢測(cè) 采用熒光定量PCR SYBR green法進(jìn)行檢測(cè)，相關(guān)引物序列見(jiàn)表1。Bewo細(xì)胞以5×105/孔接種于6孔板中，將過(guò)夜培養(yǎng)的Lm用滅菌PBS清洗2遍，調(diào)整至OD600=1.000(109CFU/mL)，以感染復(fù)數(shù)(multiplieity of infection，MOI)=10感染Bewo細(xì)胞，共孵育1 h后加入慶大霉素殺滅細(xì)胞外細(xì)菌，殺菌0.5 h后換無(wú)抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)。以加入細(xì)菌為計(jì)時(shí)起點(diǎn)，收集Lm感染1 h、3 h、6 h、12 h的細(xì)胞，用Trizol法提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(qRT-PCR)檢測(cè)IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA水平。結(jié)果分析采用相對(duì)定量分析方法，根據(jù)2-△△Ct值來(lái)確定基因的相對(duì)表達(dá)量。所有標(biāo)本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔并進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

表1 炎癥因子及MMP2轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)用qRT-PCR引物Tab.1 Primers for qRT-PCR to detect the expression of inflammatory cytokines and MMP2

1.2.3Bweo細(xì)胞遷移能力的檢測(cè) 劃痕試驗(yàn)，六孔板中接種106個(gè)/孔細(xì)胞，次日，以MOI=10 Lm感染Bewo細(xì)胞。共孵育1 h后，用10 μL槍頭垂直劃線，PBS清洗3次，以去除漂浮細(xì)胞。以此時(shí)為計(jì)時(shí)起點(diǎn)，在0 h、6 h、9 h、12 h用倒置顯微鏡觀察并拍照。Transwell試驗(yàn)，同1.2.2操作獲得Lm感染的Bewo細(xì)胞，收集Bewo細(xì)胞，以無(wú)血清F12-K培養(yǎng)液重懸至5×105/mL。在小室上室接種200 μL Bewo細(xì)胞懸液，下室加30% F12-K培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后取出小室，用4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，顯微鏡觀察并拍照。Image-Pro Plus軟件測(cè)量劃痕寬度并計(jì)數(shù)小室細(xì)胞數(shù)。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔并進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4Lm感染所致Bewo細(xì)胞功能改變的相關(guān)機(jī)制 同1.2.2操作方法收集Lm感染的Bewo細(xì)胞，常規(guī)方法提取細(xì)胞總蛋白，將各樣本蛋白濃度調(diào)整一致后，用12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，然后350 mA、90 min將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，一抗4 ℃過(guò)夜孵育后，TBST洗膜，HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜后ECL顯色，檢測(cè)遷移相關(guān)蛋白MMP2、MMP9、TIMP-1的表達(dá)，以及MAPK家族蛋白p38MAPK及ERK1/2的表達(dá)及活化水平的變化。同時(shí)，用qRT-PCR檢測(cè)MMP2轉(zhuǎn)錄水平的變化(引物見(jiàn)表1)。Image-Pro Plus軟件進(jìn)行蛋白灰度掃描分析。實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用GraphPad Prism6進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)(student’s test)，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1Bewo細(xì)胞炎癥因子mRNA水平的改變 用qRT-PCR法檢測(cè)Lm感染Bewo細(xì)胞1 h、3 h、6 h、12 h炎癥因子(圖1)，結(jié)果表明，隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA水平與1 h相比均增高，且均在3 h mRNA水平最高。

A: mRNA expression of IL-1β, B: mRNA expression of IL-6, C: mRNA expression of TNF-α;(*P<0.05)圖1 Lm感染Bewo細(xì)胞炎癥因子轉(zhuǎn)錄水平的變化Fig.1 Transcription levels of inflammatory cytokines in Bewo infected by Listeria monocytogenes

2.2Bewo細(xì)胞遷移能力的變化 用劃痕試驗(yàn)和Transwell試驗(yàn)檢測(cè)Lm感染Bewo細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞遷移能力的改變，結(jié)果顯示，Lm感染Bewo細(xì)胞后，劃痕寬度隨著時(shí)間延長(zhǎng)變窄；Transwell試驗(yàn)結(jié)果顯示Lm感染之后穿過(guò)小室的細(xì)胞增多，細(xì)胞的遷移能力增強(qiáng)(圖2)。

A: Wounding healing-0 h, B: Wounding healing-3 h, C: Wounding healing-6 h, D: Wounding healing-12 h, E: Scratch width, F: Transwell-Control, G: Transwell-MOI=10, H: Count of migration results;(*P<0.05)圖2 Lm感染Bewo后遷移能力的變化Fig.2 Changes in migration ability of Bewo infected by Listeria monocytogenes

2.3Lm感染Bewo細(xì)胞MMPs的改變 Western Blot結(jié)果表明，隨著Lm感染時(shí)間延長(zhǎng)，MMP2蛋白水平升高；MMP9和TIMP-1表達(dá)水平先上升，隨后下降(圖3 A)。qRT-PCR檢測(cè)MMP2在mRNA水平的變化，結(jié)果顯示MMP2的mRNA水平先下降后上升(圖3B)。

A: Protein expression of MMPs, B: mRNA expression of MMP2; (*P<0.05)圖3 Lm感染Bewo細(xì)胞MMPs表達(dá)水平Fig.3 The expression levels of MMPs proteins in Bewo infected by Listeria monocytogenes

2.4Lm感染所致Bewo細(xì)胞功能改變的機(jī)制 Western Blot結(jié)果顯示(圖4)，隨著Lm感染時(shí)間的延長(zhǎng)，p38MAPK及ERK1/2蛋白磷酸化的水平發(fā)生改變，p38MAPK隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸被激活，磷酸化水平呈上升趨勢(shì)；ERK1/2隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，磷酸化水平升高，在感染3 h達(dá)到高峰后稍有下降。

3 討 論

Lm作為胞內(nèi)寄生菌，可穿越機(jī)體3大屏障而致病[10-12]。雖然Lm感染率低，但致死率極高[13]，因此對(duì)Lm致病機(jī)制的研究尤為重要。本研究主要探討Lm感染對(duì)胎盤屏障的影響。胎盤屏障[14]是多種物質(zhì)從母體進(jìn)入胎兒的必經(jīng)之路，其中滋養(yǎng)層細(xì)胞為屏障的最外層，在胎盤的形成、抵抗病原微生物的入侵以及妊娠識(shí)別都具有重要的作用[2]。 Bewo細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特性和生化指標(biāo)均與正常滋養(yǎng)細(xì)胞相同，Bewo 細(xì)胞作為體外模型常應(yīng)用于滋養(yǎng)細(xì)胞功能的研究[15-16]。因此，本研究選用Bewo細(xì)胞為滋養(yǎng)層細(xì)胞模型，研究Lm感染與滋養(yǎng)層細(xì)胞之間的關(guān)系。

本研究發(fā)現(xiàn)，Lm感染Bewo細(xì)胞激活了炎癥反應(yīng)，細(xì)菌感染相關(guān)的炎癥因子轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，與其他研究報(bào)道一致[11]。IL-1β、TNF-α、IL-6在細(xì)菌感染之后相繼被激活，表明Lm成功感染Bewo細(xì)胞并產(chǎn)生抗感染免疫反應(yīng)。有研究表明[17]，外界病原體刺激胎盤相關(guān)細(xì)胞時(shí)，IL-6水平上升會(huì)導(dǎo)致流產(chǎn)，這提示單增李斯特菌感染所致的流產(chǎn)可能與炎癥因子水平的升高相關(guān)，滋養(yǎng)層細(xì)胞可能參與炎癥致流產(chǎn)的過(guò)程。我們通過(guò)劃痕試驗(yàn)及Transwell試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Lm感染會(huì)導(dǎo)致Bewo細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)；Western Blot結(jié)果表明，Lm感染對(duì)Bewo細(xì)胞遷移能力的影響主要是由滋養(yǎng)層細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2、MMP9及相關(guān)的組織型基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑TIMP-1的變化所致。Lm感染導(dǎo)致Bewo細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)，MMP2水平升高，MMP9水平先上升后稍有下降，說(shuō)明MMP2在Lm感染引起的Bewo細(xì)胞遷移能力改變中發(fā)揮著重要作用；表達(dá)和分泌MMP9 的細(xì)胞可能是滋養(yǎng)層細(xì)胞以外的一些其他類型的細(xì)胞，如基質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等[18-20]。

A: Protein expression of p-p38MAPK, p38MAPK; B: Protein expression of p-ERT1/2, ERK1/2;(*P<0.05)圖4 Lm感染Bewo細(xì)胞 p38MAPK、ERK1/2表達(dá)水平的變化Fig.4 Expression levels of p38MAPK、ERK1/2 in Bewo infected by Listeria monocytogenes

已有研究表明，MAPK家族蛋白p38MAPK及ERK1/2參與抗感染免疫的發(fā)生并對(duì)細(xì)胞侵襲遷移能力具有調(diào)控作用[21]。因此我們檢測(cè)了MAPK家族p38MAPK及ERK1/2活化水平，結(jié)果表明Bewo細(xì)胞在Lm感染后p38MAPK及ERK1/2被不同程度的激活。我們推測(cè)MMP9在6 h和9 h的改變可與ERK1/2通路的激活相關(guān)，這與陳升平等[19]的報(bào)道一致。

綜上所述，Lm感染Bewo細(xì)胞導(dǎo)致Bewo細(xì)胞炎癥反應(yīng)的發(fā)生，細(xì)胞p38MAPK及ERK1/2通路被激活，同時(shí)基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)亦增高，Bewo細(xì)胞遷移功能增強(qiáng)。我們推測(cè)Lm感染激活Bewo細(xì)胞炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞遷移能力的變化可能是通過(guò)p38MAPK及ERK1/2通路實(shí)現(xiàn)的，但p38MAPK以及ERK1/2在Lm感染所致Bewo細(xì)胞炎癥因子及遷移能力變化中的具體作用仍需進(jìn)一步研究。本研究為進(jìn)一步明確Lm的致病機(jī)制、開(kāi)發(fā)有效的預(yù)防治療藥物奠定了基礎(chǔ)。

利益沖突：無(wú)

引用本文格式：朱昱蓉，史倩，盧葉，等.單核細(xì)胞增生李斯特菌感染對(duì)Bewo細(xì)胞炎癥因子及遷移能力的影響[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2020，36(2)：94-99. DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2020.00.032