陳守斌，何佳麗，崔 雯，王 聰，陶 晴,計(jì)永勝,羅慶禮，胡曉東，沈繼龍，王 維

弓形蟲(chóng)(Toxoplasmagondii)是一種機(jī)會(huì)致病性寄生原蟲(chóng)，引起人獸共患弓形蟲(chóng)病[1]。弓形蟲(chóng)三種基因分型I型、II型和III型，II型蟲(chóng)株P(guān)RU株在歐洲、北美和非洲流行區(qū)占主導(dǎo)地位[2]。Chinese 1基因型包括I型Wh3型和II型Wh6型，是中國(guó)流行區(qū)的優(yōu)勢(shì)基因型[3-6]，我們自貓?bào)w內(nèi)分離出了該基因型的兩個(gè)蟲(chóng)株Wh3和Wh6,WH3株和WH6株是毒力截然不同的二個(gè)蟲(chóng)株，前者感染后小鼠在第8 d全部死亡，故為強(qiáng)毒株，而Wh6蟲(chóng)株感染后30d內(nèi)未見(jiàn)小鼠死亡，存活小鼠的腦組織內(nèi)僅見(jiàn)少量包囊，屬于弱毒株[7-8]。

弓形蟲(chóng)病是食源性寄生蟲(chóng)病，多數(shù)動(dòng)物因食入被包囊，卵囊污染的食物而感染。在自然界，人和各種動(dòng)物可能發(fā)生不同蟲(chóng)株或亞型的弓形蟲(chóng)重復(fù)感染，使宿主產(chǎn)生帶蟲(chóng)免疫，可誘導(dǎo)免疫保護(hù)性[9]，從而部分抑制或完全抵抗另一蟲(chóng)株的入侵。中國(guó)優(yōu)勢(shì)基因型的2個(gè)不同毒力蟲(chóng)株交叉感染的保護(hù)性免疫作用的研究未見(jiàn)報(bào)道。為了探討Wh6弱毒蟲(chóng)株感染后是否可誘導(dǎo)有效的抗再感染的免疫保護(hù)力，從而為經(jīng)射線或化學(xué)致弱的活蟲(chóng)疫苗的研究奠定基礎(chǔ)，本課題首先利用Chinese 1基因型Wh6株初次感染BALB/c小鼠，35d后建立慢性感染模型。其后用致死劑量的Wh3株速殖子攻擊感染，攻擊感染后，觀察各組小鼠存活率、腹腔蟲(chóng)荷、脾細(xì)胞分泌Th1和Th2細(xì)胞因子水平，旨在探討相同基因型不同毒力蟲(chóng)株誘導(dǎo)的免疫保護(hù)力，并為致弱的活蟲(chóng)疫苗研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1試劑 青霉素，鏈霉素，離子霉素(Sigma，USA)，Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基，胎牛血清(FBS)和Roswell Park Memorial Institute 1640培養(yǎng)基(RPMI 1640)(Montreal, QC, Canada)。 Brefeldin A，佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯，F(xiàn)ITC標(biāo)記的抗小鼠CD3+抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記的抗小鼠CD4+抗體，PE標(biāo)記的抗小鼠CD8+抗體，APC標(biāo)記的抗小鼠IL-4抗體，Percp-cy5.5 標(biāo)記的抗小鼠IFN-γ抗體，APC標(biāo)記的抗小鼠CD25+抗體，(紐約，BD，USA)。IL-10和IL-12ELISA試劑盒購(gòu)自R&D Systems(Minneapolis，MN，USA)。

1.1.2弓形蟲(chóng)蟲(chóng)株 Chinese1基因型的Wh6和Wh3兩個(gè)蟲(chóng)株分離自流浪貓，成囊型的Wh6弱(無(wú))毒株和Wh3強(qiáng)毒株均分別經(jīng)小鼠接種傳代保種和低溫凍存[3]。將凍存的Wh3速殖子37 ℃水浴復(fù)蘇，計(jì)數(shù)后注射到昆明小鼠腹腔內(nèi)，穩(wěn)定傳代3代以上獲得的速殖子分別用于實(shí)驗(yàn)鼠的慢性感染和攻擊感染。無(wú)痛取Wh6株弓形蟲(chóng)保種3個(gè)月以上的昆明小鼠腦組織，生理鹽水中無(wú)菌輕輕碾磨，制備混懸液，顯微鏡下計(jì)數(shù)包囊，用于實(shí)驗(yàn)鼠的灌胃感染。Wh3株蟲(chóng)體的制備同上，接種小鼠3 d后無(wú)痛處死，自腹腔液中分離速殖子，計(jì)數(shù)備用。

1.1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雌性BALB/c小鼠級(jí)別為SPF級(jí)，49～56 d齡，體重范圍是20～25 g，購(gòu)于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司；雌性的昆明小鼠級(jí)別為潔凈級(jí)，6～8周齡，體重范圍為20～25 g，購(gòu)自安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 方 法

1.2.1小鼠模型的建立 6周齡雌性昆明小鼠和6～8周齡的雌性BALB/c獲自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。在標(biāo)準(zhǔn)條件下給小鼠自由飲水和進(jìn)食。嚴(yán)格按照安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心生物醫(yī)學(xué)研究所的機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)制定的倫理標(biāo)準(zhǔn)(許可證號(hào)：AMU26-081108)遵循所有程序。在昆明鼠體內(nèi)進(jìn)行弓形蟲(chóng)包囊傳代及保種，小鼠適應(yīng)新環(huán)境1周后，將BALB/c鼠隨機(jī)分成3組，每組10只動(dòng)物。選取一組BALB/c鼠口服灌胃25～35個(gè)Wh6包囊(I組)，包囊來(lái)自感染3個(gè)月以上的昆明小鼠腦組織勻漿。另外兩組，一組使用等量PBS灌胃處理(II組)，另一組不做任何處理(III組)作為正常對(duì)照。在感染后35 d，第I、II組用3 000個(gè)Wh3速殖子腹腔攻擊感染。在Wh3速殖子感染后1周處死，收集3組小鼠的組織標(biāo)本。

1.2.2制備單細(xì)胞懸液 分別將3組試驗(yàn)小鼠的脾臟無(wú)菌取出，置于200目鐵濾網(wǎng)，加入適量的PBS，并用注射器針蕊輕輕研磨。將細(xì)胞懸液移到15 mL離心管中，并加滿PBS。經(jīng)2 500 r/min 4 ℃離心5 min，棄去上層PBS液；加入3 mL紅細(xì)胞裂解液混勻，并置于4 ℃的冰箱中裂解10 min，在離心管加滿PBS溶液，以2 000 r/min 4 ℃離心5 min。棄去上層PBS液，加入1 mL PBS溶液重懸定容。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)分析 將1 mL 10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，將計(jì)數(shù)后的脾細(xì)胞懸浮液加入板中(細(xì)胞數(shù)為1×106/ mL)。用于細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色，加入布雷菲德菌素A(1 mg/mL)、離子霉素(1 mg/mL)和PMA(20 ng/mL)刺激細(xì)胞5 h。一組細(xì)胞用FITC標(biāo)記的抗小鼠CD4+抗體在4 ℃孵育30 min，另一組用FITC標(biāo)記的抗小鼠CD3+和PE標(biāo)記的抗小鼠CD8+抗體在4 ℃避光孵育30 min，并洗滌2次，根據(jù)廠家說(shuō)明用Cytofix/Cytoperm試劑盒固定；加入Percp-cy5.5標(biāo)記的抗小鼠IFN-γ和APC標(biāo)記的抗小鼠IL-4抗體 4 ℃避光孵育30 min。洗滌后，加入細(xì)胞固定劑并在流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

1.2.4RNA提取和q-PCR 小鼠脾組織用TRIzol(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA，USA)裂解，并按照制造商說(shuō)明使用Takara Kit(Takara，Japan)轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用SYBR Premix Ex Taq試劑盒(Takara，Japan)通過(guò)Light Cycler 480進(jìn)行定量分析，以檢測(cè)IFN-γ、IL-12和IL-10的表達(dá)。使用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。用公式2-ΔΔCt比較ΔCt方法計(jì)算相對(duì)mRNA表達(dá)水平。所有引物見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 細(xì)胞因子引物序列Tab.1 Primer squences of cytokines detected by q-PCR

1.2.5酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 將含有10%FBS的1 mL RPMI 1640培養(yǎng)基加入24孔板中培養(yǎng)脾細(xì)胞，每孔2×106個(gè)細(xì)胞，用離子霉素(1 mg/mL)和PMA(20 ng/mL)刺激脾細(xì)胞5 h。通過(guò)離心收獲細(xì)胞上清液，ELISA檢測(cè)IL-10和IL-12含量。每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔。使用酶標(biāo)儀(Biotek，Winooski，VT，USA)在450 nm下測(cè)量吸光度。

2 結(jié) 果

2.1強(qiáng)毒株Wh3攻擊感染后小鼠的生存狀況 初次攻擊感染(Wh6株包囊)后35 d，所有小鼠存活。無(wú)痛剖殺小鼠取腦組織壓片，鏡檢查見(jiàn)具有完整囊壁的圓形包囊，內(nèi)含緩殖子(圖1)，表明慢性感染BALB/c鼠模型建立成功。在Wh3株速殖子攻擊感染后第3～4 d時(shí)，I組小鼠出現(xiàn)一過(guò)性急性感染癥狀，表現(xiàn)為弓背、毛發(fā)豎立，隨后癥狀逐漸減輕。1周后所有攻擊感染鼠恢復(fù)正常，繼續(xù)存活直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。同期PBS實(shí)驗(yàn)對(duì)照的II組小鼠在Wh3感染后第3～4 d時(shí)，出現(xiàn)弓背豎毛的癥狀，隨天數(shù)增加癥狀逐漸加重，在第7 d內(nèi)死亡5只小鼠，剩余小鼠在第8 d凌晨全部死亡(圖2)。

圖1 普通光學(xué)顯微鏡下觀察，Wh6株感染后35 d，BALB/c鼠腦組織壓片中典型弓形蟲(chóng)包囊Fig.1 Optical microscopy appearance of brain tissue cysts in infected BALB/c mice with Wh6 stain of Toxoplasma gondii on day 35 post infection

圖2 25-35個(gè)Wh6株包囊感染后42 d后，I組(藍(lán)色)、II組(綠色)和III組(紅色)BALB/c鼠存活狀況Fig.2 At42 days postinfection, percent survival of Group I (Blue), Group II (Green) and Group III (Red) mice orally attacked with 25-35 T.gondii Wh6 strain cysts.The combined results of two experiments are shown (n=10)

2.2小鼠腹腔內(nèi)速殖子計(jì)數(shù) 使用2 mL無(wú)菌生理鹽水灌洗小鼠腹腔，鏡下進(jìn)行腹腔灌洗液速殖子計(jì)數(shù)。Wh3株攻擊感染后第7 d，隨機(jī)取3只II組小鼠進(jìn)行腹腔蟲(chóng)荷計(jì)數(shù)，腹腔速殖子計(jì)數(shù)為1.28±0.0351×106/mL，而I組感染免疫小鼠Wh3株攻擊感染后，腹腔灌洗液未查見(jiàn)速殖子。

2.3小鼠脾細(xì)胞上清液和脾組織中IFN-γ、IL-10和IL-12水平 為進(jìn)一步探討慢性弓形蟲(chóng)感染小鼠對(duì)強(qiáng)毒W(wǎng)h3株攻擊感染的免疫應(yīng)答，在二次攻擊感染后第8 d，剖殺各組全部的小鼠，取脾臟制成脾細(xì)胞懸液，培養(yǎng)收集上清，q-PCR和ELISA分別檢測(cè)脾細(xì)胞上清液和脾組織IFN-γ、IL-10和IL-12水平。q-PCR結(jié)果顯示，II組小鼠脾細(xì)胞中IFN-γ、IL-10和IL-12水平較I組、III組升高(F=719.1，P<0.001)；I組動(dòng)物的IFN-γ、IL-10和IL-12細(xì)胞因子水平低于II組(F=432.2，P<0.001)，但高于正常組(F=67.47，P<0.001)(圖3)。

與q-PCR結(jié)果一致，ELISA結(jié)果顯示，II組鼠IL-10和IL-12水平較I組、III組升高(F=38.79，P<0.05)。I組小鼠的IL-10、IL-12水平仍高于正常組(F=87.34，P<0.01)(圖4)。

* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001圖3 q-PCR分別檢測(cè)I組、II組和III組鼠脾組織IFN-γ、IL-12和IL-10水平Fig.3 Levels of IFN-γ, IL-12 and IL-10 in the spleen tissues of Group I, Group II and Group III were detected by q-PCR

* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001圖4 ELISA檢測(cè)I組、II組III組鼠脾細(xì)胞上清IL-10和IL-12的水平(pg/mL)Fig.4 Levels of IL-10 and IL-12 (pg/mL) in the cultured splenocyte suspensions of Group I, Group II and Group III were determined by ELISA

2.4小鼠脾CD4+T細(xì)胞IFN-γ和IL-4表達(dá) 分離和培養(yǎng)原代脾細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)IFN-γ和IL-4的水平，分析結(jié)果顯示II組鼠IFN-γ和IL-4增高。I組小鼠IFN-γ和IL-4相比于II組表達(dá)降低，且低于正常組的水平(F=10.96,7.86；P<0.05)。見(jiàn)圖5。

3 討 論

弓形蟲(chóng)病最常見(jiàn)的感染方式是通過(guò)攝入含有包囊的食物和水[20]。在小腸中，從包囊中釋放的緩殖子，轉(zhuǎn)化為速殖子并在組織中繁殖。在免疫功能正常的機(jī)體，感染的宿主可以抑制蟲(chóng)體的增殖，蟲(chóng)體在腦組織和肌肉組織內(nèi)形成包囊，宿主呈隱性或慢性感染狀態(tài)。在艾滋病，腫瘤和器官移植等免疫功能低下的患者[10-11]，隱性感染的包囊可被激活，包囊破裂，蟲(chóng)體釋出，引起弓形蟲(chóng)腦炎或全身播散性弓形蟲(chóng)病等嚴(yán)重后果。研究表明，穿孔素(profilin)介導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞活化可在此階段從腦中除去繁殖階段寄生蟲(chóng)[12]。已知宿主固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中經(jīng)典途徑活化的巨噬細(xì)胞(M1)分泌的IL-12以及NK、Th1等分泌的IFN-γ在宿主抗弓形蟲(chóng)免疫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Wh6株攜帶致密顆粒蛋白GRA15II，在急性感染階段可直接激活NF-κB，誘導(dǎo)M1的活化[13]。M1的極化可有效啟動(dòng)Th1型適應(yīng)性免疫應(yīng)答。感染誘導(dǎo)的免疫力可以通過(guò)上調(diào)小鼠細(xì)胞免疫相關(guān)GTP酶(immunity-related GTPaseIRGs)，IRG在PVM上累積，導(dǎo)致PVM破裂和弓形蟲(chóng)裂解[14]。細(xì)胞中的病原體也可通過(guò)觸發(fā)呼吸爆發(fā)和釋放一氧化氮(NO)而被殺滅。

弓形蟲(chóng)至今尚無(wú)有效的防治藥物，安全有效的疫苗是防治弓形蟲(chóng)病的策略之一，弓形蟲(chóng)疫苗的研發(fā)經(jīng)歷了活疫苗、減毒活疫苗、滅毒疫苗、蛋白疫苗、核酸疫苗等幾個(gè)階段。滅活疫苗、蛋白疫苗和核酸疫苗都有一定的干預(yù)作用，但存在返毒現(xiàn)象和缺乏有效保護(hù)力等問(wèn)題[15-17]。減毒活疫苗是將病原體經(jīng)過(guò)人工處理，雖然大大降低其致病性，但仍可能存在一定致病性和免疫原性等問(wèn)題。利用弓形蟲(chóng)速殖子制成的弱毒活疫苗可以誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生與天然主動(dòng)免疫相似的免疫應(yīng)答，其免疫效果強(qiáng)于滅活疫苗[18]。

* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)I組、II組和III鼠原代脾細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞INF-γ和IL-4水平(%)Fig.5 At 42 days postinfection,level of INF-γ and IL-4 in primary splenocyte CD4+ Tcells from mice in Group I, Group II and Group III detected by Flow cytometry, respectively

S48株是從流產(chǎn)的羊體內(nèi)分離出來(lái)，速殖子在小鼠體內(nèi)經(jīng)過(guò)多次傳代，失去了形成包囊的能力[19-20]。用減毒活疫苗S48免疫羊后可以明顯減少其體內(nèi)的弓形蟲(chóng)數(shù)量，現(xiàn)已在動(dòng)物體內(nèi)推廣使用[21]。理想活蟲(chóng)疫苗不僅能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生有效保護(hù)性，而且不具備在體內(nèi)增殖和播散能力。近年Fox等研發(fā)出一株尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型非復(fù)制型II型蟲(chóng)株的減毒活疫苗，接種小鼠后既無(wú)毒力，在體內(nèi)也不成囊，因此無(wú)引起慢性感染的安全性問(wèn)題。此外，該疫苗可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗強(qiáng)毒I型或弱毒II型蟲(chóng)株急性感染的完全的保護(hù)力，有望成為基因改造的活蟲(chóng)疫苗[22]。Wh6蟲(chóng)株是從我國(guó)流浪貓?bào)w內(nèi)分離而獲得，屬于Chinese 1型的弱(無(wú))毒株，對(duì)感染動(dòng)物僅有輕微的致病作用。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物常呈一過(guò)性自愈的慢性感染，并且成囊數(shù)量較少。而且Chinese 1型蟲(chóng)株具有ROP16I/ III和GRA15II多態(tài)性。在感染孕鼠模型中，雖然Wh3蟲(chóng)株和Wh6蟲(chóng)株都能夠誘導(dǎo)孕鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡，但是其母胎界面免疫極化機(jī)制不同，Wh3蟲(chóng)株誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2/Th2方向極化。而Wh6蟲(chóng)株誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1/Th1方向極化[4,23-25]。鑒于Wh6蟲(chóng)株這些特性，因而具有成為候選活蟲(chóng)減毒疫苗蟲(chóng)株的潛在應(yīng)用價(jià)值。

本研究結(jié)果顯示，弱毒株Wh6感染的機(jī)體可抵抗強(qiáng)毒株Wh3致死性入侵，推測(cè)與下列因素有關(guān)：1)蟲(chóng)株Wh6毒力弱，Wh6蟲(chóng)株誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1/Th1方向極化[4,23-25]，致密顆粒蛋白GRA15II 和Profilin是重要的免疫誘導(dǎo)因子，可在急慢性感染階段有效驅(qū)動(dòng)M1-Th1型應(yīng)答[13,26]；2)相比較正常小鼠體內(nèi)IFN-γ水平，活蟲(chóng)感染能夠刺激機(jī)體較長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)產(chǎn)生相對(duì)較高的IFN-γ水平。有文獻(xiàn)報(bào)道弓形蟲(chóng)慢性感染的小鼠能使小鼠體抵抗李斯特菌等細(xì)菌的致死性感染[27]；3)Wh6與強(qiáng)毒株Wh3同屬于Chinese 1基因型，具有良好的交叉免疫保護(hù)性。

弓形蟲(chóng)感染小鼠體內(nèi)免疫應(yīng)答，細(xì)胞因子表達(dá)水平是動(dòng)態(tài)變化的，與不同感染時(shí)間有關(guān)，IFN-γ的表達(dá)水平在感染1月后呈下降趨勢(shì)[28]。本研究結(jié)果顯示，在攻擊感染后期，I組小鼠Th1細(xì)胞因子IFN-γ明顯低于II感染組小鼠但高于正常對(duì)照組。推測(cè)其原因，第一，Wh6株慢性感染的小鼠體內(nèi)CD4+CD25+的細(xì)胞群的比例上升[29]，流式檢測(cè)結(jié)果中，I組小鼠攻擊感染后，CD4+T表達(dá)IFN-γ不僅低于II感染組小鼠也低于正常對(duì)照組，但是I組小鼠體內(nèi)IFN-γ總水平是高于正常對(duì)照小鼠的，可能是IFN-γ的分泌不只是來(lái)源于CD4+T細(xì)胞。第二，BALB/c鼠在慢性感染過(guò)程中，可能產(chǎn)生對(duì)Th1細(xì)胞因子的免疫抑制作用[29]，因?yàn)閃h6具有ROP16I/ III和GRA15II多態(tài)性，Wh6蟲(chóng)株雖然結(jié)局上誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1/Th1方向極化，但ROP16I/ III可能依然起作用，會(huì)抑制Th1細(xì)胞因子的分泌[30-31]。過(guò)高水平的Th1炎性因子也可能對(duì)小鼠造成病理?yè)p傷，甚至導(dǎo)致小鼠死亡，本研究中Wh3攻擊感染，抑制了過(guò)高水平的IFN-γ的產(chǎn)生，間接發(fā)揮了免疫保護(hù)作用，使得小鼠不會(huì)死于過(guò)高水平的Th1炎性因子[32-33]。綜上所述，Wh6株感染小鼠，可能獲得了對(duì)Th1細(xì)胞因子的免疫抑制性，在Wh3株急性攻擊感染小鼠時(shí)，避免產(chǎn)生急劇的Th1細(xì)胞因子水平的上升，超過(guò)小鼠自身耐受，達(dá)到致死性水平。但是Th1細(xì)胞因子總體水平與正常小鼠相比是上升的，使得小鼠可以清除體內(nèi)的速殖子，控制了速殖子的繁殖，讓小鼠成功的存活下來(lái)。

利益沖突：無(wú)

引用本文格式：陳守斌，何佳麗，崔雯，等.弓形蟲(chóng)Chinese 1基因型Wh6弱毒株感染小鼠抗強(qiáng)毒株致死性感染的免疫保護(hù)作用[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2020，36(2)：87-93. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2020.00.013