侯淼淼， 王春伶， 徐椿森， 3， 邱寧， 3， 夏治俊， 3， 蘇良霞， 3， 王劍偉*

(1. 大連海洋大學(xué)，遼寧大連116023； 2. 中國科學(xué)院水生生物研究所，武漢430072； 3. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049)

塑料因具有防水、耐用、質(zhì)輕、絕緣、抗腐蝕等諸多優(yōu)點，在人類生產(chǎn)生活中得到廣泛使用。據(jù)統(tǒng)計，全球每年的塑料使用量不少于3×108t，但塑料制品在自然環(huán)境下難以降解，大量使用導(dǎo)致生態(tài)環(huán)境中的廢棄塑料或塑料制品越來越多。截止2014年，全球僅海洋表面漂浮的塑料垃圾超過2.5×105t(Eriksenetal.，2014)。環(huán)境中的塑料經(jīng)過物理、化學(xué)或生物作用可分解為更小的塑料顆?；蛩槠?，加上直接排入環(huán)境中的微小塑料顆?；蛩槠?，造成了環(huán)境中嚴重的微塑料污染(Thompsonetal.，2004)。微塑料通常指尺寸在100 nm～5 mm的小塑料碎片，這一定義被多數(shù)人認同和采用(Law & Thompson，2014；丁劍楠等，2017；Toussaintetal.，2019)。調(diào)查結(jié)果表明，從南極到北極、從內(nèi)陸到海洋、從水體到沉積物，皆能發(fā)現(xiàn)不同程度的微塑料污染(Ivar do Suletal.，2014；Wagner & Lambert，2017；徐向榮等，2018)，甚至在人體中也檢測到了微塑料的存在(van Cauwenberghe & Janssen，2014；Smith-Llera，2019)。

作為一類新型污染物，微塑料已受到國內(nèi)外學(xué)者和公眾的高度關(guān)注，關(guān)于微塑料污染的研究已成為目前國際上的研究熱點之一(Koelmansetal.，2016；Toussaintetal.，2019)。近年來，有關(guān)微塑料來源、類型、分布以及對水生生物毒理學(xué)效應(yīng)等方面的研究報道日益增多(Andrady，2011；丁劍楠等，2017；陳啟晴等，2018)。已有研究表明，微塑料能夠賦存于水生生物體內(nèi)，并通過物理性損傷、載體效應(yīng)(如增塑劑釋放、富集其他污染物等)、生物積累與食物鏈傳遞等途徑危害水生生物健康(Oliveiraetal.，2013；Wrightetal.，2013；Bateletal.，2016)，在個體水平(如攝食率、繁殖率、存活率、生長速率等)、組織水平(如炎癥反應(yīng)、氧化損傷、脂肪空泡等)、細胞水平(如肝細胞壞死等)、基因水平(如內(nèi)分泌干擾基因表達變化等)表現(xiàn)出毒性效應(yīng)(von Moosetal.，2012；H?meretal.，2014；Rochmanetal.，2014；周倩等，2015)。但總體來看，關(guān)于微塑料本身對水生生物毒性效應(yīng)的研究較少，魚類僅見于斑馬魚Daniorerio、青鳉Oryziaslatipes、挪威舌齒鱸Dicentrarchuslabrax等少數(shù)物種(Rochmanetal.，2013，2014；Mazuraisetal.，2015；Luetal.，2016；Leietal.，2018)，因此，亟需積累更多的魚類毒理學(xué)數(shù)據(jù)，進一步解析微塑料毒性作用機制，以期更準確評價環(huán)境中微塑料的生態(tài)風(fēng)險。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.2 試驗方法

暴露試驗參照美國環(huán)境保護局的黑頭軟口鰷Pimephalespromelas仔魚7 d生長存活試驗(USEPA，2002)，試驗容器為500 mL圓形玻璃結(jié)晶皿，每個試驗容器放試驗液400 mL、初孵仔魚30尾，每個濃度設(shè)置3個平行，為暴露組，并設(shè)置空白對照組。結(jié)晶皿置于控溫的水浴中，實驗期間每天監(jiān)測水溫。暴露期間每天10∶00和16∶00投喂新孵豐年蟲Artemianauplii無節(jié)幼體，每天更換90%以上的暴露溶液，換液前使用HACH水質(zhì)分析儀(HQ30d，美國)隨機抽測3個結(jié)晶皿中的溶解氧。7 d后統(tǒng)計仔魚的存活率并將存活個體全部用100 mg·L-1中性MS-222麻醉后在解剖鏡下測量全長，從每個濃度組隨機選取3尾仔魚放置于熒光顯微鏡下拍攝帶熒光信號的照片，并使用ImageJ對熒光強度進行半定量分析。之后從每個結(jié)晶皿中隨機挑選10尾魚再進行7 d凈化試驗。凈化試驗中各濃度組更新溶液為與空白對照組相同的稀釋水，其他控制條件與7 d亞慢性毒性試驗期間相同。凈化7 d后從每個濃度組隨機挑選3尾仔魚用MS-222麻醉后置于熒光顯微鏡下觀察熒光微塑料的分布情況，拍攝照片并分析熒光強度。

參考他人關(guān)于微塑料環(huán)境濃度調(diào)查和微塑料對水生生物的毒性效應(yīng)的相關(guān)研究(Zhaoetal.，2014；Luetal.，2016；涂燁楠，2018)設(shè)置濃度組，7 d亞慢性毒性試驗中暴露濃度分別為0.055 μg·L-1、0.55 μg·L-1、5.5 μg·L-1、55 μg·L-1、550 μg·L-1，采用血球計數(shù)板法實測微塑料濃度(豐度)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS Statistics 20進行數(shù)據(jù)分析。運用單因素方差分析(One-Way ANOVA)和Dunnett’s多重比較分析空白對照組與暴露組在存活率、全長等指標上的差異水平；采用獨立樣本t檢驗分析空白對照組與暴露組體內(nèi)熒光強度的差異性；所有結(jié)果表示為-x±SD，當P<0.05時認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。使用ImageJ對熒光強度進行半定量分析，使用Origin 8.5及PhotoShop CS6作圖。

2 結(jié)果

2.1 PS微塑料對稀有鯽仔魚存活、生長的影響

2.2 PS微塑料在稀有鯽仔魚體內(nèi)的累積和清除

暴露7 d后，除空白對照組外，各暴露組仔魚體內(nèi)均發(fā)現(xiàn)熒光微塑料賦存(圖版Ⅰ：A、C、E)。微塑料主要存在于暴露組仔魚的鰓部和消化道，在身體其他部位或組織中未見。熒光半定量分析表明，熒光強度與暴露濃度正相關(guān)(圖1)，其回歸方程為：0.1 μm PS微塑料：y=8 819.9e0.820 5lgx(R2=0.970 3，P<0.05)；1 μm PS微塑料：y=3 448.9e1.024 2lgx(R2=0.900 1，P<0.05)；10 μm PS微塑料：y=7 373.7e0.639 6lgx(R2=0.825 3，P<0.05)。

凈化7 d后，各組仔魚體內(nèi)PS微塑料均顯著減少(圖版 Ⅰ：B、D、F)，在0.055 μg·L-1、0.55 μg·L-1濃度暴露后，仔魚對3種粒徑微塑料的7 d清除率達到100%，其他3個較高濃度暴露后的清除率也在60%以上，但微塑料粒徑與暴露后清除效果關(guān)系并不明確(圖1)。

表1 3種粒徑聚苯乙烯微塑料暴露7 d后稀有鯽仔魚的存活率和全長Table 1 Survival rate and full length of Gobiocypris rarus larvae after exposure to3 sizes of polystyrene microplastics for 7 days

注： 同一列中具有不同字母表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)； 0.1 μm的微塑料顆粒在顯微鏡下難以計數(shù)， 此處為根據(jù)質(zhì)量濃度換算的標稱豐度

Notes： Different letters in the same column indicate there is a significant difference (P<0.05); as it is difficult to count 0.1 μm microplastic particles under the microscope， the nominal abundance was calculated by mass concentration

3 討論

3.1 PS微塑料在稀有鯽初孵仔魚體內(nèi)的攝入和清除

圖版Ⅰ 聚苯乙烯微塑料在稀有鯽仔魚體內(nèi)的累積與清除Plate Ⅰ Accumulation and removal of polystyrene microplastics in Gobiocypris rarus larvae

1.空白對照組， 2～6. 0.055 μg·L-1濃度組， 0.55 μg·L-1濃度組， 5.5 μg·L-1濃度組， 55 μg·L-1濃度組， 550 μg·L-1濃度組； 聚苯乙烯(PS)微塑料暴露7 d后， PS微塑料粒徑： A. 0.1 μm， C. 1 μm， E. 10 μm； 凈化7 d后， PS微塑料粒徑： B. 0.1 μm， D. 1 μm， F. 10 μm

1. control group， 2-6. exposure concentration of 0.055 μg·L-1， 0.55 μg·L-1， 5.5 μg·L-1， 55 μg·L-1， 550 μg·L-1group； after exposed to polystyrene (PS) microplastics for 7 days， PS microplastic size： A. 0.1 μm， C. 1 μm， E. 10 μm； after exposed for 7 days and then purified for 7 days， PS microplastic size： B. 0.1 μm， D. 1 μm， F. 10 μm

3.2 PS微塑料對稀有鯽初孵仔魚的7 d亞慢性毒性效應(yīng)

圖1 綠色熒光聚苯乙烯微塑料在稀有鯽仔魚體內(nèi)的相對表達量(A、B、C)和清除率(D)Fig. 1 Relative expression (A， B， C) and purification rate (D) of green fluorescent polystyrene microplasticsin Gobiocypris rarus larvae