[摘要]目的 探討非小細胞肺癌（NSCLC）組織晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）/S100P、信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）表達及其意義。

方法收集NSCLC及其癌旁組織標本各40例，應用Westernblot方法和RT-PCR方法檢測其RAGE、S100P、STAT3和Pim1的表達，并分析不同臨床病理特征病人的表達差異。

結果

肺癌組織中RAGE蛋白表達明顯低于癌旁正常組織，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（t=5.756，Plt;0.05）;S100P、STAT3和Pim1蛋白在肺癌組織中表達明顯高于癌旁正常組織，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（t=2.414～10.141，Plt;0.05）。RT-PCR結果顯示，與癌旁正常組織相比，RAGEmRNA在癌組織中表達明顯減少（t=21.530，Plt;0.05），而S100P、STAT3、Pim1mRNA在癌組織中表達明顯增多（t=10.430～13.640，Plt;0.05）。RAGEmRNA表達量在腺癌組織中高于鱗癌組織，在高中分化組織中表達高于低分化組織，在伴有淋巴結轉(zhuǎn)移的癌組織中表達明顯低于不伴有淋巴結轉(zhuǎn)移癌組織，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.157～2.908，Plt;0.05）。S100PmRNA在鱗癌組織中的表達高于腺癌組織，在低分化組織中表達高于高中分化組織，在伴有淋巴結轉(zhuǎn)移癌組織中的表達高于不伴有淋巴結轉(zhuǎn)移癌組織，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.132～2.590，Plt;0.05）。Pearson相關性分析顯示，NSCLC組織RAGE表達與S100P表達、STAT3表達呈負相關（r=-0.430、-0.417，Plt;0.05），STAT3表達與S100P表達、S100P表達與Pim1表達、Pim1表達與miR-21表達呈正相關（r=0.324～0.337，Plt;0.05）。

結論RAGE、S100P及STAT3、Pim1可能參與NSCLC的發(fā)生發(fā)展。

[關鍵詞]癌，非小細胞肺;高級糖化終產(chǎn)物受體;S100蛋白;信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3;Pim1

[中圖分類號]R730.26

[文獻標志碼]A

[文章編號]2096-5532（2020）01-0040-05

肺癌是我國發(fā)病率和死亡率均較高的一種惡性腫瘤，其中非小細胞肺癌（NSCLC）占肺癌病人的80%～85%[1]。多數(shù)病人早期無明顯癥狀及體征，就診時多處于中晚期，治療困難，預后較差。早期肺癌治療以手術切除為主，中晚期肺癌手術切除配合放化療、靶向治療及免疫治療等綜合措施[2-3]。肺癌發(fā)生發(fā)展涉及多種細胞因子、多條信號通路，其發(fā)病機制一直是研究熱點。晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）是一種跨膜的信號轉(zhuǎn)導受體，屬于免疫球蛋白超家族，與相關配體結合后，會激活胞內(nèi)多種信號轉(zhuǎn)導通路，引起相應的生物學效應[4-5]。RAGE在惡性腫瘤如肝癌、胃癌、胰腺癌及前列腺癌等的表達異常增加，與癌細胞的增殖、遷移、侵襲及腫瘤的分期和預后等密切相關[6-10]。S100蛋白（S100P）屬于鈣結合蛋白家族，可以與RAGE結合介導腫瘤如黑色素瘤的發(fā)生[11-12]。信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）為常見癌基因之一，其異常激活與腫瘤的生物學效應密切相關[13-14]。Pim-1是一種癌基因，有研究表明Pim-1是細胞因子信號通路傳導的下游效應因子，能夠通過改變細胞周期調(diào)節(jié)因子的活性而縮短細胞周期，參與調(diào)控細胞的增殖、分化和凋亡[15]。本文研究采用Westernblot和RT-PCR方法，分別檢測NSCLC病人癌組織及其癌旁組織中RAGE、S100P、STAT3和Pim1蛋白和基因表達，分析其在病人不同臨床病理特征下的差異性表達，旨在探討以上因子在NSCLC中的表達和意義。

1材料與方法

1.1標本及其來源

標本來自2018年4—8月青島大學附屬醫(yī)院胸外科手術切除且病理證實為NSCLC的病人（均由兩位病理醫(yī)師獨立診斷），共40例，男24例，女16例;年齡43～81歲，中位年齡61歲。病人臨床資料完整，術前均未行其他抗腫瘤治療。標本為每例病人的肺癌組織及對應的癌旁正常肺組織（距癌灶邊緣5cm）。研究經(jīng)青島大學附屬醫(yī)院倫理委員會批準，并獲得病人知情同意書。

1.2RAGE、S100P、STAT3等蛋白表達檢測

采用Westernblot方法進行檢測。取凍存肺組織，每250mg組織加入1mLRIPA裂解液，使用勻漿器于冰上研磨組織靜置30min;4℃、12000r/min離心10min，取上清液;行SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，然后用50g/L脫脂奶粉封閉2h，分別加入含對應一抗Anti-RAGE、Anti-S100P、Anti-STAT3、Anti-Pim1（賽爾生物，天津）的Blotto，4℃搖床孵育過夜;再加入HRP標記山羊抗兔IgG二抗（abcam，USA）Blotto于37℃室溫下靜置孵育1.5h，將膜置于TBST溶液中搖動漂洗5min，共4次;WesternLightningTMChemiluminescenceReagent

顯色劑（PerkinElmer，美國）中顯色30s。

[JP3]最后用LabWorksTM凝膠成像及分析系統(tǒng)（UVP，美國）進行攝像，計算各組蛋白條帶的灰度值，以其表示各蛋白表達。

1.3RAGE、S100P、STAT3及Pim1mRNA表達檢測

采用RT-PCR方法。充分研磨凍存NSCLC組織及癌旁正常肺組織，加入適量裂解液，離心，取上清液，應用Trizol法提取組織總RNA;將3μL總RNA加入到13.5μL反應體系中進行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。熒光定量PCR（Takara，Japan）方法擴增RAGE、S100P、STAT3、Pim1及β-actin、U6sn-RNA基因。循環(huán)參數(shù)為：94℃、4min;94℃、30s，56℃、30s，72℃、30s;共40個循環(huán)。各樣品目的基因和管家基因分別進行熒光定量PCR反應。目的基因擴增產(chǎn)物的相對含量用2-△△Ct表示。各基因引物序列見表1。

1.4統(tǒng)計學分析

應用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料結果用[AKx-D]±s形式表示，數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗;相關性分析采用Pearson相關檢驗法。Plt;0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1兩種組織中RAGE、S100P、STAT3及Pim1蛋白表達比較與癌旁正常組織相比，肺癌組織中RAGE蛋白表達明顯減少（t=5.756，Plt;0.05），S100P、STAT3、Pim1蛋白表達明顯增高，差異均有統(tǒng)計學意義（t=2.414～10.141，Plt;0.05）。見圖1、表2。

2.2肺癌以及癌旁組織中RAGE、S100P、STAT3及Pim1mRNA表達比較

與癌旁正常組織相比較，肺癌組織中的RAGEmRNA表達明顯減少，S100P、STAT3以及Pim1mRNA表達明顯增多，差異有顯著性（t=10.430～21.530，Plt;0.05）。見表3。

2.3不同臨床病理參數(shù)肺癌病人RAGE、S100P基因的差異性表達

RAGE和S100PmRNA表達與肺癌病人的性別、年齡、癌組織大小均無關（P>0.05）;腺癌組織RAGEmRNA表達明顯高于鱗癌組織，高中分化組織表達高于低分化組織，伴有淋巴結轉(zhuǎn)移肺癌組織中的表達明顯低于不伴有淋巴結轉(zhuǎn)移肺癌組織，差異均有統(tǒng)計學意義（t=2.157～2.908，Plt;0.05）;S100PmRNA在鱗癌組織中的表達明顯高于腺癌組織，在低分化組織中的表達明顯高于高中分化組織，在伴有淋巴結轉(zhuǎn)移的癌組織中的表達明顯高于不伴有淋巴結轉(zhuǎn)移的癌組織，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.132～2.590，Plt;0.05）。見表4。

2.4NSCLC組織RAGE、S100P與STAT3/Pim1及miR-21表達相關性

NSCLC組織中RAGE的表達與S100P表達、STAT3表達呈負相關（r=-0.430、-0.417，Plt;0.05），STAT3表達與S100P表達、S100P表達與Pim1表達、Pim1表達與miR-21表達均呈正相關（r=0.324～0.337，Plt;0.05）。

3討論

RAGE作為一種模式識別受體，可以與多種配體結合介導疾病的發(fā)生發(fā)展。RAGE在肺泡上皮細胞中呈高表達，維持肺泡的正常形態(tài)結構及穩(wěn)定性，介導肺泡上皮細胞與基底膜的黏附;RAGE減少可導致去極化和去分化，細胞功能破壞，與腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移有關[16]。已有研究結果發(fā)現(xiàn)，RAGE在胃癌、胰腺癌、乳癌等中高表達[6，8-9]，但在肺癌組織中低表達，被認為發(fā)揮抑癌基因的作用[5]。目前，對于RAGE-配體結合在腫瘤中的調(diào)控機制的研究越來越多，其主要的配體S100家族在其中發(fā)揮著重要的作用[17]。S100P與RAGE結合后可以導致ERK1/2發(fā)生磷酸化，激活MAPK/ERK信號途徑[18]。有研究表明，S100P在結腸癌、胰腺癌等高表達[19-21]，S100P可能通過與整合素α7相互作用活化激酶FAK和AKT而促進肺癌細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲[22]。在體實驗和細胞實驗發(fā)現(xiàn)，Keap1-Nrf2軸可以通過靶向S100P而抑制肺腺癌的遷移和進展[23];AGER/RAGE介導的自噬可能通過IL-6/STAT3信號途徑促進胰腺癌的發(fā)生[24]。本文研究結果表明，肺癌組織RAGE蛋白表達低于正常組織，S100P、STAT3和Pim1蛋白表達明顯高于正常組織。此外，我們還發(fā)現(xiàn)與癌旁組織相比，肺癌組織中RAGEmRNA表達明顯減少，S100P、STAT3、Pim1mRNA表達明顯增多，與其蛋白水平表達情況一致。說明肺癌病人RAGE表達減少，S100P、STAT3、Pim1表達增多。有研究發(fā)現(xiàn)RAGE在肺癌組織中表達較低[5]，基因芯片技術篩選出的差異性基因包括S100P等參與早期NSCLC[25]，JAK/STAT3活化參與NSCLC的發(fā)生發(fā)展[26]，Pim1在肺腺癌中過表達與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移有關[27]，本文研究結果與以上文獻報道基本一致。本文分析了不同臨床病理參數(shù)NSCLC病人RAGE和S100PmRNA表達差異，結果顯示RAGE、S100P表達在不同年齡、性別、腫瘤大小病人間差異無統(tǒng)計學意義;RAGE在NSCLC腺癌中表達較高，S100P在鱗癌中表達較高，提示兩者可能與肺癌的病理形態(tài)特征有關;RAGE在高中分化NSCLC組織中表達較高，在無淋巴結轉(zhuǎn)移的NSCLC組織中表達較高;而S100P在低分化NSCLC組織中表達較高，在有淋巴結轉(zhuǎn)移的肺癌組織中表達較高，提示兩者可能影響腫瘤的生物學行為，其異常表達可能與腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移有關。RAGE在正常肺組織中高表達，可發(fā)揮信號傳導功能和黏附分子的作用，維持正常細胞的增殖、代謝、死亡等;在某些內(nèi)外刺激的作用下被降解或表達下調(diào)，從而導致其調(diào)控的下游分子異常表達介導腫瘤發(fā)生。結合對其他惡性腫瘤的研究，RAGE及其配體S100P在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機制復雜，在NSCLC中兩者可能存在不同于其他腫瘤中的負反饋調(diào)節(jié)機制或者拮抗作用，其對腫瘤的作用可能具有雙向性，具體作用取決于組織細胞的類型、細胞所處的微環(huán)境和相應的上下游分子等，有待進一步證實。

MELOCHE等[28]通過體外實驗發(fā)現(xiàn)，STAT3可以依賴RAGE激活Pim1，通過促進轉(zhuǎn)錄因子NFAT的表達而促進血管內(nèi)皮細胞的增殖和抗凋亡;RAGE低表達可減少STAT/Pim1/NFAT的活化，逆轉(zhuǎn)大鼠損傷的冠脈血管重塑。BLOCK等[29]對胰腺癌細胞研究發(fā)現(xiàn)，IL-6可以激活STAT3，上調(diào)Pim1的表達，同時IL-6的表達也會因此升高，從而對腫瘤的進展產(chǎn)生正反饋的作用。結腸癌組織中氧化應激反應產(chǎn)生的活性氧可抑制JAK2/STAT3通路，從而抑制Pim1的表達。Pim1作為原癌基因其表達下調(diào)會抑制癌細胞生長，促進癌細胞凋亡，使其侵襲轉(zhuǎn)移受限，從而達到治療的目的[30]。本文相關性分析顯示，RAGE與S100P、STAT3可能存在拮抗作用，S100P、STAT3和Pim1存在協(xié)同作用。結合以上文獻報道及本文研究結果，推測RAGE、S100P、STAT3和Pim1及其他下游因子等信號通路可能參與NSCLC的發(fā)生發(fā)展，有待于進一步研究證實。

NSCLC的發(fā)生發(fā)展是多因子、多因素共同作用的結果，其確切機制目前還不明確。RAGE、S100P、STAT3和Pim1具有調(diào)控細胞增殖、侵襲、分化和凋亡等重要作用，但是其在肺癌發(fā)生發(fā)展過程中的確切作用尚不清楚，與臨床疾病發(fā)展之間的關系尚需要進一步研究。

[參考文獻]

[1]SIEGELRL，MILLERKD，JEMALA.Cancerstatistics，2019[J].CA-ACancerJournalforClinicians，2019，69（1）：7-34.

[2]HIRSCHFR，SCAGLIOTTIGV，MULSHINEJL，etal.Lungcancer：currenttherapiesandnewtargetedtreatments[J].Lancet，2017，389（166）：299-311.

[3]OSMANIL，ASKINF，GABRIELSONE，etal.CurrentWHOguidelinesandthecriticalroleofimmunohistochemicalmarkersinthesubclassificationofnon-smallcelllungcarcinoma（NSCLC）：movingfromtargetedtherapytoimmunotherapy[J].SeminarsinCancerBiology，2018，52（Pt1）：103-109.

[4]AHMADS，KHANH，SIDDIQUIZ，etal.AGEs，RAGEsands-RAGE;friendorfoeforcancer[J].SeminarsinCancerBiology，2018，49：44-55.

[5]WUShuangshuang，MAOLiping，LIYan，etal.RAGEmayactasatumoursuppressortoregulatelungcancerdevelopment[J].Gene，2018，651：86-93.

[6]KWAKT，DREWS-ELGERK，ERGONULA，etal.TargetingofRAGE-ligandsignalingimpairsbreastcancercellinvasionandmetastasis[J].Oncogene，2017，36（11）：1559-1572.

[7]HOLLENBACHM.TheroleofGlyoxalase-I（Glo-I），advancedglycationendproducts（AGEs），andtheirreceptor（RAGE）inchronicliverdiseaseandhepatocellularcarcinoma（HCC）[J].InternationalJournalofMolecularSciences，2017，18（11）：2466.

[8]HUDan，LIUQing，LINXiandong，etal.AssociationofRAGEgenefoursinglenucleotidepolymorphismswiththerisk，invasion，metastasisandoverallsurvivalofgastriccancerinChinese[J].JournalofCancer，2019，10（2）：504-509.

[9]AZIZANN，SUTERMA，LIUY，etal.RAGEmaintainshighlevelsofNFκBandoncogenicKrasactivityinpancreaticcancer[J].BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications，2017，493（1）：592-597.

[10]KOLONINMG，SERGEEVAA，STAQUICINIDI，etal.InteractionbetweentumorcellsurfacereceptorRAGEandproteinase3mediatesprostatecancermetastasistobone[J].CancerResearch，2017，77（12）：3144-3150.

[11]XIONGTingfeng，PANFuqiang，LIDong.ExpressionandclinicalsignificanceofS100familygenesinpatientswithmelanoma[J].MelanomaResearch，2019，29（1）：23-29.

[12]ZHUL，ITOT，NAKAHARAT，etal.UpregulationofS100P，receptorforadvancedglycationendproductsandezrininmalignantmelanoma[J].TheJournalofDermatology，2013，40（12）：973-979.

[13]CHAIEZ，SHANMUGAMMK，ARFUSOF，etal.TargetingtranscriptionfactorSTAT3forcancerpreventionandtherapy[J].Pharmacologyamp;Therapeutics，2016，162：86-97.

[14]YANGMengqi，CHENHuanting，ZHOULin，etal.ExpressionprofileandprognosticvaluesofSTATfamilymembersinnon-smallcelllungcancer[J].AmericanJournalofTranslationalResearch，2019，11（8）：4866-4880.

[15]ZHUQiaojuan，LIYazhao，GUOYang，etal.LongnoncodingRNASNHG16promotesproliferationandinhibitsapoptosisofdiffuselargeB-celllymphomacellsbytargetingmiR-497-5p/PIM1axis[J].JournalofCellularandMolecularMedicine，2019，23（11）：7395-7405.

[16]SIMSGP，ROWEDC，RIETDIJKST，etal.HMGB1andRAGEininflammationandcancer[J].AnnualReviewofImmunology，2010，28：367-388.

[17]LIUQiongqiong，HUOYansong，ZHENGHong，etal.Ethylpyruvatesuppressesthegrowth，invasionandmigrationandinducestheapoptosisofnon-smallcelllungcancercellsviatheHMGB1/RAGEaxisandtheNF-κB/STAT3pathway[J].OncologyReports，2019，42（2）：817-825.

[18]TESAROVAP，KALOUSOVAM，ZIMAT，etal.HMGB1，S100proteinsandotherRAGEligandsincancer-markers，mediatorsandputativetherapeutictargets[J].BiomedicalPapersoftheMedicalFacultyoftheUniversityPalacky，Olomouc，Czechoslovakia，2016，160（1）：1-10.

[19]MERCADO-PIMENTELME，ONYEAGUCHABC，LIQ，etal.TheS100P/RAGEsignalingpathwayregulatesexpressionofmicroRNA-21incoloncancercells[J].FEBSLetters，2015，589（18）：2388-2393.

[20]NAKAYAMAH，OHUCHIDAK，YONENAGAA，etal.S100Pregulatesthecollectiveinvasionofpancreaticcancercellsintothelymphaticendothelialmonolayer[J].InternationalJournalofOncology，2019，55（1）：211-222.

[21]NAKAYAMAH，OHUCHIDAK，YONENAGAA，etal.S100Pregulatesthecollectiveinvasionofpancreaticcancercellsintothelymphaticendothelialmonolayer[J].InternationalJournalofOncology，2019，55（1）：211-222.

[22]HSUYL，HUNGJY，LIANGYY，etal.S100Pinteractswithintegrinα7andincreasescancercellmigrationandinvasioninlungcancer[J].Oncotarget，2015，6（30）：29585-29598.

[23]CHIENMH，LEEWJ，HSIEHFK，etal.Keap1-Nrf2interactionsuppressescellmotilityinlungadenocarcinomasbytargetingtheS100Pprotein[J].ClinicalCancerResearch：anOfficialJournaloftheAmericanAssociationforCancerResearch，2015，21（20）：4719-4732.

[24]KANGR，TANGDL，LOTZEMT，etal.AGER/RAGE-mediatedautophagypromotespancreatictumorigenesisandbioenergeticsthroughtheIL6-pSTAT3pathway[J].Autophagy，2012，8（6）：989-991.

[25]TIANWen，LIUJie，PEIBaojing，etal.IdentificationofmiRNAsanddifferentiallyexpressedgenesinearlyphasenon-smallcelllungcancer[J].OncologyReports，2016，35（4）：2171-2176.

[26]ZHENGXianan，LUGuohua，YAOYinan，etal.AnautocrineIL-6/IGF-1RloopmediatesEMTandpromotestumorgrowthinnon-smallcelllungcancer[J].InternationalJournalofBiologicalSciences，2019，15（9）：1882-1891.

[27]CAOLianjing，WANGFan，LIShouying，etal.PIM1kinasepromotescellproliferation，metastasisandtumorgrowthoflungadenocarcinomabypotentiatingthec-METsignalingpathway[J].CancerLetters，2019，444：116-126.

[28]MELOCHEJ，PAULINR，COURBOULINA，etal.RAGE-dependentactivationoftheoncoproteinPim1playsacriticalroleinsystemicvascularremodelingprocesses[J].ArteriosclerosisThrombosisandVascularBiology，2011，31（9）：2114-2124.

[29]BLOCKKM，HANKENT，MAINEEA，etal.IL-6stimulatesSTAT3andPim-1kinaseinpancreaticcancercelllines[J].Pancreas，2012，41（5）：773-781.

[30]LIUKaili，GAOHui，WANGQiaoyun，etal.HispidulinsuppressescellgrowthandmetastasisbytargetingPIM1throughJAK2/STAT3signalingincolorectalcancer[J].CancerScience，2018，109（5）：1369-1381.

（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）