王潔，邵長敏，王月桐，孫凌云*，趙遠錦,*

a Department of Rheumatology and Immunology, Institute of Translational Medicine, The Affiliated Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School, Nanjing 210008, China

b College of Artificial Intelligence, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210031, China

c State Key Laboratory of Bioelectronics, School of Biological Science and Medical Engineering, Southeast University, Nanjing 210096, China

增材制造（additive manufacturing），又被稱為固體自由成型制造。與減材制造截然不同，增材制造是以計算機三維（3D）模型數(shù)據(jù)為藍本、以逐層疊加為主要制造方式的三維立體結(jié)構(gòu)構(gòu)建手段[1,2]。自20世紀(jì)80年代第一個3D結(jié)構(gòu)通過逐層疊加方式成功構(gòu)建到現(xiàn)在，增材制造已經(jīng)成為工業(yè)生產(chǎn)和科學(xué)研究領(lǐng)域中的一種新奇且實用的工具[3,4]。基于增材制造的方式，金屬、陶瓷、聚合物、生物材料和有機物化合物等具有不同制造特性的材料可被用于構(gòu)建復(fù)雜的3D結(jié)構(gòu)[5-8]，且在食品、制藥、醫(yī)學(xué)和機械加工等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[8-11]。由于增材制造具有成本低、可定制化和結(jié)構(gòu)構(gòu)建快速的加工特性，微流控、電噴、3D打印、熔融沉積制造和選擇性激光燒結(jié)等成型制造技術(shù)體系在醫(yī)用增材制造領(lǐng)域得到迅速構(gòu)建[12-15]，有效推動了醫(yī)療器械、醫(yī)學(xué)假體和臨床移植物的發(fā)展。

微流控（microfluidic）是一種可在微尺寸通道（幾十到幾百微米）中控制微量流體（通常為10-9～10-18L）的技術(shù)[16-20]。由于微流控技術(shù)對流體精準(zhǔn)控制的特性，其在構(gòu)建復(fù)雜結(jié)構(gòu)的微流控液滴/纖維方面的應(yīng)用被寄予厚望[21-24]。通過對液滴/纖維相關(guān)元件的裝配、堆疊，可以構(gòu)建由不同結(jié)構(gòu)和材料組成的3D結(jié)構(gòu)。此外，選擇在液滴/纖維中包埋、負載細胞還可以構(gòu)建具有生物相容性的細胞結(jié)構(gòu)[25-27]。近年來，高通量、結(jié)構(gòu)和尺寸控制精準(zhǔn)等優(yōu)勢使微流控技術(shù)在醫(yī)用增材制造領(lǐng)域顯露頭角，且已被應(yīng)用于藥物開發(fā)、組織工程和器官芯片的構(gòu)建[28-30]。在此背景下，對微流控技術(shù)在醫(yī)用增材制造領(lǐng)域的應(yīng)用現(xiàn)狀進行全面綜述，對具有不同學(xué)科背景的研究者來說是必要的。

本文綜述了微流控技術(shù)在醫(yī)用增材制造領(lǐng)域的最新研究進展。首先，闡述了基于微流控技術(shù)的單、雙和多重乳液微載體的制作方式，以及不同結(jié)構(gòu)微纖維的制備手段及其編織、堆疊和纏繞；其次，詳細介紹了微載體、微纖維在醫(yī)用增材制造領(lǐng)域的不同應(yīng)用，如細胞定向、細胞3D培養(yǎng)、體外組織構(gòu)建和細胞治療等；最后，討論了基于微流控技術(shù)的醫(yī)用增材制造未來發(fā)展面臨的挑戰(zhàn)與應(yīng)用前景。

2. 微流控液滴在醫(yī)用增材制造領(lǐng)域的應(yīng)用

微流控技術(shù)是一種在微尺寸通道中對流體進行系統(tǒng)操作和控制的技術(shù)。自20世紀(jì)70年代微流控技術(shù)問世以來，該多學(xué)科技術(shù)迅速發(fā)展，并逐漸滲透到生物學(xué)、微電子學(xué)、醫(yī)學(xué)、材料科學(xué)、化學(xué)和機械工程等諸多領(lǐng)域[31-36]。微流控系統(tǒng)中的流體具有高效的質(zhì)-熱傳遞、黏性相對于慣性的絕對優(yōu)勢以及顯著的表面效應(yīng)的特點，使得微流控系統(tǒng)對流體和流體界面的控制具有重要的現(xiàn)實意義。此外，微流控系統(tǒng)的高度集成性促進了多相流體的共軸流動和相互作用，從而能夠構(gòu)建復(fù)雜的流體體系[27,33,37,38]。因此，微流控技術(shù)被認(rèn)為是實現(xiàn)微尺寸復(fù)雜形貌和結(jié)構(gòu)的有效方法。

2.1. 液滴微流控的成型機理

作為微流控技術(shù)的重要分支，液滴微流控在其通道中可引入不相溶的多相（分散相和連續(xù)相）流體，并將流體分解成離散的液滴[21,39]。液滴微流控生成的液滴具有分散性好、體積小且大小可控、制備條件穩(wěn)定、液滴環(huán)境密閉無污染等優(yōu)點。因此，微液滴可以作為理想的模板或微反應(yīng)器，在材料制備、化學(xué)合成、細胞培養(yǎng)等方面具有重要的應(yīng)用價值。

多種材料可用于制造微流控芯片，如玻璃、晶體硅、石英、聚二甲基硅氧烷（PDMS）、塑料等[40-43]。在上述材料中，最常用的是PDMS和玻璃毛細管，如圖 1（a）、（b）所示[42,43]。1998年，Whitesides制備了第一個PDMS微流控芯片 [44]。PDMS器件的制作通常需要以下步驟：首先，通過標(biāo)準(zhǔn)接觸光刻技術(shù)[圖1（a-i）～（a-iii）]在光刻膠中構(gòu)建正結(jié)構(gòu)母版；其次，將混合的PDMS傾倒入母版生成有孔道的復(fù)制版[圖1（a-iv）、（av）]；最后，PDMS復(fù)制版黏合在平坦的基板上[圖1（avi）]。PDMS器件的低成本、易成型、良好的生物相容性和透明性等優(yōu)點使其得到廣泛應(yīng)用。然而，它們的二維（2D）特性、有機溶劑中的溶脹和形變效應(yīng)以及高壓耐受性不足限制了其在微流控技術(shù)中的應(yīng)用。因此，具有3D幾何形狀和極好的耐溶劑性的玻璃毛細管被引入微流控裝置的制作程序[42]。這些裝置由具有易改變通道表面潤濕性的玻璃毛細管共軸組裝而成[圖1（b）]。通過組裝一系列玻璃毛細管[圖1（b-ii）、（b-iii）]或使用陣列毛細管[圖1（b-i）]，可以獲得具有單、雙和多重乳液或結(jié)構(gòu)更復(fù)雜（如多個組分）的液滴。雖然具有以上優(yōu)點，但這種玻璃裝置在某些情況下也會受到限制。例如，手工制作玻璃毛細管裝置限制了它們的單次生產(chǎn)量。因此，應(yīng)根據(jù)不同的情況選擇不同的微流控器件。

在微流控通道中，互不相溶的流體在界面處交匯，并在流體動力作用下形成液滴。液滴的大小、速度和產(chǎn)生頻率受流速、幾何參數(shù)和流體性質(zhì)影響?；谕ǖ缼缀涡螤詈土黧w結(jié)構(gòu)，現(xiàn)已開發(fā)了不同的液滴形成技術(shù)，這些形成裝置可分為階梯狀、橫流、共流、幾何流動聚焦等[18,27,45]。圖1（c）[45]展示了用于生成液滴的典型微流體的幾何結(jié)構(gòu)示意圖。通過毛細管壓力的急劇變化，階梯狀的幾何結(jié)構(gòu)導(dǎo)致通道限制的改變從而產(chǎn)生均勻的液滴。在界面張力的驅(qū)動下，分散相在通道末端斷裂成液滴。在橫流裝置中（通常表現(xiàn)為T形接口裝置），兩種流體以0～180°角度分流，并在交界處形成界面。分散相在剪切力作用下進入連續(xù)相通道，隨后由于梯度壓力而破裂成液滴。共流是通過一組同軸通道實現(xiàn)的，這些通道可以是2D（PDMS）或3D（玻璃毛細管）同軸。與共流幾何結(jié)構(gòu)相似，兩相在流動聚焦芯片中通過一個狹窄區(qū)域同軸流動。由于收縮孔中剪切聚焦的作用，液滴的尺寸比同流結(jié)構(gòu)的小。

2.2. 單乳液和多組分液滴

基于不同的微流控液滴模板，研究人員對具有可設(shè)計尺寸、結(jié)構(gòu)和微環(huán)境的細胞微載體進行了研究。簡要來說，通過將生物相容性材料注入微流控通道，可以生成單分散的單乳液，隨后可聚合以獲得用于細胞培養(yǎng)的微載體。Liu等[46]通過在單液滴模板中分散二氧化硅納米粒子，開發(fā)出了一種尺寸可控、生物相容性好的新型光子晶體（PC）微載體。與2D培養(yǎng)相比，微載體表面培養(yǎng)的細胞更具有3D的形態(tài)[圖2（a-i）]，這是由微載體上懸浮培養(yǎng)細胞的特點引起的。此外，如圖2（a-ii）所示，Zheng等[47]通過在表面修飾適體探針，開發(fā)了用于捕捉、檢測和釋放多種循環(huán)腫瘤細胞（CTC）功能的PC微載體。

除二氧化硅外，水凝膠材料也被廣泛用于制造細胞微載體，如海藻酸鈉[48]、明膠[28]、膠原蛋白[49]、聚乙二醇[50]和殼聚糖[51]。這些微載體可以通過離子交聯(lián)、溫度誘導(dǎo)凝膠化和冷凍以及紫外線（UV）照射等多種方法固化。微載體的尺寸、形狀、孔隙率和機械性能可以通過調(diào)節(jié)微流控通道尺寸、流速、前體物濃度和交聯(lián)密度來調(diào)節(jié)。Segura等[52]利用微流控方法制備了由多臂聚（乙烯）乙二醇-乙烯基砜（PEG-VS）和細胞黏附肽組成的可注射微載體[圖2（b）]。細胞黏附在微載體表面，并具有高細胞活力和快速增殖能力。值得注意的是，微載體可以組裝成具有所需形狀的微孔粒子支架。

細胞除被接種在微載體的表面外，還可以在水凝膠前體乳化和聚合之前將其包埋。Garcia等[53]利用微流控技術(shù)制造了尺寸、滲透率和細胞微環(huán)境可控的微腔[圖2（c）]。他們證實了微載體可提高相關(guān)臨床細胞（如人胰島細胞和人間充質(zhì)干細胞）的活性。近年來，作為細胞微載體的響應(yīng)性水凝膠引起了廣泛關(guān)注。例如，Zhao等[54]利用近紅外（NIR）光響應(yīng)水凝膠開發(fā)出細胞可控培養(yǎng)的微載體系統(tǒng)，如圖2（d）所示。水凝膠前體物中的氧化石墨烯可以吸收近紅外光譜并將其轉(zhuǎn)化為熱量，從而導(dǎo)致溫度響應(yīng)水凝膠的收縮和微載體孔中捕獲細胞的釋放。微載體釋放的細胞具有與傳統(tǒng)消化細胞相似的活性，而微載體支架在釋放前可保護細胞免受免疫系統(tǒng)的傷害。這些特點促進了微載體在小鼠腫瘤模型構(gòu)建中的應(yīng)用。

用多個平行通道代替單乳液微流控裝置的分散通道，可以制備多室液滴。不相溶的分散相相互接觸，同時被連續(xù)相乳化。由于微流體中雷諾數(shù)（Re）較低，流體保持層流狀態(tài)。因此，液滴形成過程中的對流流動不會導(dǎo)致分散相的混合，而分散相的混合是以流體間擴散為主。因此，當(dāng)流體間擴散速度較慢時，會出現(xiàn)明顯的界面和隔室?；谶@些理論，Weitz等[55]通過應(yīng)用多個注入通道制備多室微載體[圖3（a）]。海藻酸鈣（Ca-Alg）快速凝膠化可用于制備微載體間的明顯界面。有學(xué)者認(rèn)為這項技術(shù)可以作為一種在單細胞水平上，研究細胞間相互作用的新方法。微流控技術(shù)可以制備出結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多室微載體。Zhao等[56]應(yīng)用毛細管陣列微流控技術(shù)，在中心生成具有多種結(jié)構(gòu)和大孔的細胞微載體，如圖3（b）所示。Zhao等利用微纖維陣列首次制備出多室液滴的微纖維。通過去除聚合液滴中的微纖維，相應(yīng)地開發(fā)了具有大孔的多室微載體。與沒有大孔的微載體相比，大孔微載體在細胞培養(yǎng)過程中可提供充足的營養(yǎng)。

圖1. 微流控裝置和液滴制備過程。（a）PDMS微流控器件的制作步驟[43]；（b）玻璃毛細管微流控芯片的組裝[42]；（c）在PDMS和玻璃毛細管芯片中制備不同幾何結(jié)構(gòu)的微流控液滴[45]。

2.3. 雙乳液和多重乳液液滴

雖然由單乳液液滴作為模板的細胞微載體具有許多優(yōu)點，但過于簡化的結(jié)構(gòu)限制了其在某些情況下的應(yīng)用。因此，能夠制造出結(jié)構(gòu)更復(fù)雜的微載體尤為重要。通過多級乳化，可以根據(jù)需要獲得雙乳液或多重乳液液滴。

圖2. 由單一乳液模板制備的微載體。（a）PC微載體[46-47]；（b）PEG-VS微載體[52]；（c）具有可控細胞微環(huán)境的微載體[53]；（d）NIR光響應(yīng)水凝膠微載體[54]。DTT：二硫蘇糖醇；RGD：海藻酸鈉-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸。

在單乳液液滴形成的基礎(chǔ)上，對混合液進行二次乳化，可以制備出雙乳液液滴。雙乳液是通過雙重共流毛細管裝置實現(xiàn)的，如圖4（a）[57]所示。首先，在內(nèi)毛細管的末端產(chǎn)生油包水乳液；然后將混合液乳化成水包油雙乳液。基于雙乳液，可制備具有內(nèi)外連通結(jié)構(gòu)的多孔微載體和生物聚合物基質(zhì)填料，用于3D細胞培養(yǎng)。多孔結(jié)構(gòu)不僅能保護細胞在培養(yǎng)過程中不受剪切力的影響，而且為多個細胞球體的形成提供了良好的環(huán)境。除了在微載體上接種，細胞還可以被封裝在具有核-殼結(jié)構(gòu)的水凝膠微載體中，這種微載體是基于雙乳液液滴制備的。如圖4（b）[58]所示，癌細胞被包埋在微載體的核心中，以獲得無血管的微腫瘤。這些微載體與基質(zhì)細胞組裝成3D血管化腫瘤，用于腫瘤研究。與普通水凝膠微載體相比，核-殼微載體具有更好的細胞包埋性。圖4（c）[59]為在固體水凝膠微載體中培養(yǎng)的胰島細胞與在核-殼微載體中培養(yǎng)的胰島細胞的比較，結(jié)果表明后者具有良好的細胞包埋性以及免疫保護作用。除了固態(tài)的水凝膠核心，核-殼微載體的核心也可以是液體。Kang等[60]將細胞懸浮液與培養(yǎng)基一起注入核心，同時利用海藻酸鹽溶液形成微載體的外殼。研究人員發(fā)現(xiàn)，在核-殼微載體的核心中培養(yǎng)的細胞比在固體水凝膠微載體中培養(yǎng)的細胞更容易聚集[圖4（d）]，這對單個胚胎體的形成是有利的。

與雙乳液的形成類似，多重乳液液滴可以通過多液滴反應(yīng)器或一步乳化法制備。圖4（e）[60]為具有三分支的三重微載體的微流控裝置。Kang等[60]利用這一設(shè)備制備微載體，其核心是干細胞，周圍層是分化細胞，外殼用于負載熒光標(biāo)記、磁操控的多功能微珠或藥物遞送。

3. 微流控纖維在醫(yī)用增材制造領(lǐng)域的應(yīng)用

3.1. 微流控紡絲

微流控紡絲技術(shù)被用于構(gòu)造具有不同形態(tài)、組分和結(jié)構(gòu)的纖維狀組織，其在芯片設(shè)計和操控方面與上文提到的液體微流控技術(shù)類似[19,42,61-64]。如圖5（a）[62]所示，用于生成微纖維的微流控芯片中的流體的流動方式主要有交叉流、聚合流和并行流三種。其中，并行流是穩(wěn)定構(gòu)建纖維材料的一種溫和且應(yīng)用較為廣泛的方式。在并行流過程中，內(nèi)相（核）和外相（殼）兩組分流體通過兩個共軸通道在微流控芯片的連接處交匯，流體的黏度、界面張力等參數(shù)，以及設(shè)備的幾何結(jié)構(gòu)都會影響流體在芯片通道中的流動。由于流體在通道內(nèi)的雷諾數(shù)較小，流體在通道內(nèi)將始終保持層流狀態(tài)而無湍流情況發(fā)生，內(nèi)相和外相流體受制于兩相界面處的緩慢擴散。基于流體動力學(xué)，兩相流體形成同軸結(jié)構(gòu)，于通道內(nèi)原位固化并經(jīng)出口擠出成纖維。

用于構(gòu)建微流控纖維的材料種類繁多，大致可劃分為自然提取材料和人工合成材料[65-71]。自然提取材料主要由海藻酸鈉、透明質(zhì)酸、殼聚糖和瓊脂糖等多糖以及膠原蛋白、明膠和纖維蛋白等蛋白質(zhì)組成。基于這類材料的物理/化學(xué)交聯(lián)，可形成具有水凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的高度生物相容微纖維。雖然自然提取材料具有良好的生物相容性，但是機械強度低、改性困難等材料固性在一定程度上限制了其在微流控技術(shù)中的應(yīng)用。相比之下，人工合成材料是高度工程化的，可以通過對其改性來系統(tǒng)地研究材料結(jié)構(gòu)、功能和性能之間的關(guān)系，諸如聚乙二醇二甲基丙烯酸酯（PEGDA）、聚乳酸-羥乙酸共聚物（PLGA）和聚（N-異丙基丙烯酰胺）（pNIPAM）此類典型的人工合成材料，這些材料在固化后可被用于微流控紡絲技術(shù)制備功能性纖維。

不同的纖維材料對應(yīng)不同的固化成型方式，如圖5（b）[72]所示的光聚合、離子交聯(lián)和溶劑交換。在光聚合過程中[圖5（b-i）]，光聚物和光引發(fā)劑作為核流被擠出，并在紫外線的照射下誘導(dǎo)聚合以形成纖維的骨架結(jié)構(gòu)，而鞘流則作為潤滑劑以加速固化后纖維的擠出。雖然光聚合方式具有簡單、快捷的聚合特性，然而基于光聚合方式的微纖維材料的應(yīng)用受限于其潛在的細胞毒性及缺乏生物降解性。對離子交聯(lián)來說，最具代表性的是海藻酸鹽和Ca2+之間的交聯(lián)反應(yīng)[圖5（b-ii）]。在此過程中，海藻酸鹽和Ca2+分別作為核流和鞘流被注射進微流控芯片通道，并在兩相流體交匯的瞬間即發(fā)生交聯(lián)固化。與離子交聯(lián)聚合類似，在溶劑交換法中，核流和鞘流組分分別被替換成溶劑相和非溶劑相流體[圖5（b-iii）]。值得一提的是，基于擴散效應(yīng)的組分交換也可誘導(dǎo)微流控內(nèi)相的固化以生成微纖維，這種方式在基于PLGA這種聚合材料的微纖維生成中應(yīng)用較廣。利用微流控技術(shù)可以連續(xù)生成不同形狀、組成和結(jié)構(gòu)的微纖維，其小尺寸、高比表面積、多孔水凝膠結(jié)構(gòu)和良好的生物相容性使微纖維成為理想的細胞培養(yǎng)平臺。

圖3. 不同微流控裝置制備多室微載體。（a）PDMS芯片[55]；（b）玻璃毛細管芯片[56]。

3.2. 微纖維的特殊形態(tài)和結(jié)構(gòu)

基于微流控技術(shù)，微纖維以一種溫和且連續(xù)的方式生成，并展現(xiàn)出高比表面積、生產(chǎn)方式靈活且可重復(fù)，以及形態(tài)和組分可調(diào)控的獨特優(yōu)勢。因此，負載細胞的微纖維也在細胞研究和組織工程領(lǐng)域被寄予厚望[73,74]。迄今為止，構(gòu)建具有特殊形態(tài)和結(jié)構(gòu)的細胞負載微纖維受到越來越多的關(guān)注和研究。Zhao等[75]利用玻璃毛細管微流控裝置成功構(gòu)建了具有可伸縮性的螺旋型海藻酸鹽纖維[圖6（a）]?；诹黧w聚焦原理和擴散效應(yīng)，海藻酸鈣微纖維在原位生成并通過離子交聯(lián)快速成型。此外，研究發(fā)現(xiàn)，改變裝置內(nèi)流體的流動速率可在微纖維收集裝置中觀察到微纖維的4種不同的流動形態(tài)（阻塞型、波浪型、直線型和螺旋型）[76]。如圖6（b）所示，通過擴大內(nèi)相流與外相流流速的比值，可將該理論進一步應(yīng)用于螺旋型微纖維的制備[76]。由于兩相流動速率的差異，使得通道內(nèi)流體剪切力不穩(wěn)定，從而進一步導(dǎo)致微纖維形態(tài)轉(zhuǎn)變的現(xiàn)象發(fā)生。這種新式的螺旋型微纖維被廣泛用于心肌細胞力學(xué)傳感器的構(gòu)建，并在心臟器官芯片研究領(lǐng)域起著關(guān)鍵的作用。

除螺旋結(jié)構(gòu)外，還可以針對微流控通道進行改進和修飾以構(gòu)建形態(tài)和結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜的微纖維。Seki等[77]設(shè)計了一種微流控裝置，該裝置由三通道入口網(wǎng)絡(luò)聯(lián)合一個平頭微噴管構(gòu)成，負載/不負載細胞的海藻酸鈉的溶液首先被注入多通道網(wǎng)絡(luò)，然后通過特殊的平頭微噴管組合在一起，再一同被擠出形成片層狀條帶微纖維[圖6（c）] [77]。肝癌細胞和成纖維細胞被包埋于這種片層狀微纖維中，用于模擬肝臟的微結(jié)構(gòu)。如圖6（d）所示，Lee等[78]通過一個計算機控制的氣動閥單獨控制微流控裝置的輸入端，可數(shù)控編碼生成連續(xù)、平行或者混合體系的海藻酸鹽微纖維。此外，研究人員還利用帶有溝槽的柱形毛細管成功構(gòu)建了表面帶有溝槽結(jié)構(gòu)的管狀纖維[圖6（e）] [78]，且溝槽結(jié)構(gòu)基于通道幾何特性和流速等參數(shù)高度可控，隨后這種表面帶有溝槽結(jié)構(gòu)的微纖維被證實有助于神經(jīng)元細胞的定向排列。除上述兩種具有不同形態(tài)、結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)的微纖維外，還可以通過微流控系統(tǒng)交替控制流體相的流動行為以形成串珠型纖維?；谠摾碚?，Zhao等[79]將微納紡絲技術(shù)和材料乳化效應(yīng)進行了巧妙的結(jié)合，生成了一種液滴串聯(lián)纖維的復(fù)合結(jié)構(gòu)，這給串珠型微纖維的生成提供了實例模板[圖6（f）]。一些研究人員還采用甲基丙烯酸化明膠（GelMA）等光聚物替代乳化效應(yīng)以在微纖維上形成串珠，用于3D細胞培養(yǎng)。此外，其他設(shè)計也被用于生產(chǎn)串珠型微纖維，如將氣泡和液滴包埋進海藻酸鹽微纖維[78,80]。

圖4. 以雙乳液和多重乳液液滴為模板構(gòu)建的微載體。（a）多孔微載體[57]；（b）具有核-殼結(jié)構(gòu)的水凝膠微載體[58]；（c）具有改進的細胞封裝的核-殼微載體[59]；（d）具有液體內(nèi)核的微載體[60]；（e）三重微載體[60]。

除上文主要討論的實心微纖維外，一些具有核-殼結(jié)構(gòu)、中空結(jié)構(gòu)和多組分結(jié)構(gòu)的微纖維也備受關(guān)注。如圖7（a）所示，Zhao等[75,81]對常規(guī)的微纖維紡絲毛細管裝置進行改進，使流體在其中具有多個輸入端和分層同步輸出端，最終得到具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的微纖維。其中，以內(nèi)相海藻酸鹽通道為基礎(chǔ)，再向其中插入一個或數(shù)個CaCl2毛細管通道[圖7（a-i）]。當(dāng)海藻酸鹽相與CaCl2相接觸時，海藻酸鹽在內(nèi)、外界面處發(fā)生瞬時交聯(lián)，隨后具有單個或多個中空結(jié)構(gòu)的微纖維被連續(xù)擠出。若想進一步生成帶有多個組分結(jié)構(gòu)的微纖維，則需要用多管道毛細管代替原始單通道作為輸入端通道[圖7（a-ii）]，在此過程中，位于海藻酸鹽溶液中的多相流體被同步注入毛細管并在原位固化。由于流體的雷諾數(shù)較低，層流效應(yīng)在微流控通道內(nèi)發(fā)生，流體間無明顯的擴散混合現(xiàn)象發(fā)生，使得微纖維中不同組分間的界面線清晰明顯。有趣的是，選擇將中空纖維微流控裝置和多組分微流控裝置結(jié)合使用后，可得到具有中空和多組分兩種結(jié)構(gòu)性質(zhì)的微纖維[圖7（a-iii）]。在微流控技術(shù)領(lǐng)域中，制作具有特殊形態(tài)和結(jié)構(gòu)的微纖維的裝置并不局限于玻璃毛細管，PDMS微流控芯片也是一種被廣泛應(yīng)用的微流控裝置。如圖7（b）所示，Qin等[82]在一項研究中開發(fā)了一種創(chuàng)新的PDMS微流控芯片，該種芯片具有分層、多層和微通道的結(jié)構(gòu)，可制備多孔、多組分的微流控纖維。這種芯片由內(nèi)層流體相、中層水凝膠支架相和外層殼相三層結(jié)構(gòu)組成，與玻璃毛細管微流控裝置相比，PDMS微流控芯片具有較好的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。

圖5. 微流控紡絲技術(shù)與微纖維的聚合。（a）微流控芯片中流體的不同流動方式[62]；（b）各相流體的三種聚合方式[72]。

3.3. 微纖維集成的3D 細胞結(jié)構(gòu)

得益于微纖維穩(wěn)定、易操控以及生成方式平緩和良好的生物相容性，負載細胞的微纖維被通過各種方式進行體外組裝成3D細胞結(jié)構(gòu)。Fukuda等[83]將磁性納米顆粒包埋入微纖維，然后在磁場的作用下將微纖維聚集在支撐模型中，以實現(xiàn)3D結(jié)構(gòu)[圖8（a）]。這種組裝方法對負載細胞的損傷可以忽略不計。此外，Lee等[84]利用微流控紡絲技術(shù)成功制備了純殼聚糖基微纖維，然后使用X-Y軸可調(diào)的纏繞器將微纖維纏繞成3D結(jié)構(gòu)[圖8（b）]。微纖維中負載的肝癌細胞經(jīng)一段時間培養(yǎng)后，自組裝成球狀體并具有較高水平的肝臟功能特異性表達。Juncker等[85]開發(fā)了基于微流控直寫技術(shù)（MFDW）的3D細胞結(jié)構(gòu)搭建技術(shù)，將固化的海藻酸鹽微纖維從受電機控制的微流控噴頭中擠出，在載物臺上一層層堆積形成特定的3D結(jié)構(gòu)[圖8（c）] [85]。Takeuchi等[86]設(shè)計了一種實驗室級別的微流控編織機[圖8（d）]，該設(shè)備以負載細胞的功能性纖維為紡織單元，隨后對其進行高度集成。這項技術(shù)的基本原理是通過玻璃毛細管噴射微纖維，然后在編織機的作用下編織成2 cm × 1 cm的3D細胞實體。

如圖8（e）[81]所示，除編織外，逐層堆積也是構(gòu)建3D細胞結(jié)構(gòu)的重要手段，因此生物3D打印技術(shù)在3D細胞結(jié)構(gòu)搭建方面被寄予厚望。如圖8（f）[87]所示，研究人員將微流控噴頭整合到生物3D打印機上即可打印多組分纖維集成結(jié)構(gòu)。此外，3D打印技術(shù)的多噴頭打印特性可以實現(xiàn)微流控多噴頭的3D打印[圖8（f-iii）]，進而構(gòu)建更為復(fù)雜、更貼合體內(nèi)組織結(jié)構(gòu)特性的工程組織。

圖6. 具有不同形態(tài)、結(jié)構(gòu)的微纖維。（a）海藻酸鹽微纖維[75]；（b）螺旋型微纖維[76]；（c）條帶型微纖維[77]；（d）編碼型海藻酸鹽微纖維[78]；（e）溝槽型微纖維[78]；（f）串珠型微纖維[79]。

4. 應(yīng)用

基于微流控技術(shù)形成的液滴或微纖維具有尺寸調(diào)節(jié)方便、組成成分多樣及結(jié)構(gòu)可控的優(yōu)勢。微流體的形成不需要高溫或高壓條件，只需要構(gòu)建一個相對溫和的環(huán)境。因此，一些包括細胞在內(nèi)的對環(huán)境敏感的生命體，可以在液滴或微纖維中培養(yǎng)而不會失去其功能活性。這些獨特的性質(zhì)使得通過微流控制備的細胞負載的微載體或微纖維，在醫(yī)用增材制造方面具有一定的應(yīng)用性[88-112]。

4.1. 細胞定向

細胞外基質(zhì)影響不同類型細胞的形態(tài)和排列方式[88-90]。目前利用微流控紡絲微纖維引導(dǎo)不同類型細胞定向生長已被廣泛報道，如成肌細胞、成纖維細胞、心肌細胞和神經(jīng)元細胞等。Scheibel等[91]對在膠原微纖維中孵育72 h后的神經(jīng)元NG108-15的細胞形態(tài)進行研究，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元NG108-15細胞沿著微纖維軸方向發(fā)生了軸突生長（最長可達100 μm）。Lee等[92]提出用連續(xù)微流控技術(shù)制造一種帶有溝槽結(jié)構(gòu)的微纖維，并對帶溝槽結(jié)構(gòu)的纖維和光滑纖維上神經(jīng)元細胞的生長狀況進行比較[圖9（a）]，發(fā)現(xiàn)在帶溝槽結(jié)構(gòu)的纖維中大多數(shù)神經(jīng)元細胞沿溝槽定向生長，而在平滑纖維上的神經(jīng)元細胞隨機排列。結(jié)果表明，微纖維表面的溝槽結(jié)構(gòu)有助于神經(jīng)元細胞的定向生長。此外，還有學(xué)者研究了微纖維尺寸對黏附細胞排列方向的影響[93]，發(fā)現(xiàn)成纖維細胞在PLGA微纖維上生長時，隨著微纖維尺寸的減小，細胞沿著纖維取向定向排列增加。

圖7. 不同微流控裝置制得的多中空、多組分微纖維。（a）玻璃毛細管裝置[75,81]；（b）PDMS裝置[82]。

圖8. 微纖維集成3D細胞結(jié)構(gòu)的不同方法。（a）磁誘導(dǎo)[83]；（b）纏繞器[84]；（c）微流控直寫[85]；（d）微流控纖維編織機[86]；（e）逐層堆疊[81]；（f）生物3D打印[81]。STP：三聚磷酸鈉。

除了帶溝槽結(jié)構(gòu)的纖維外，通過其他方法構(gòu)建的圖案化微纖維也具有引導(dǎo)細胞定向生長的能力[94,95]。Zhang等[94]基于開爾文-亥姆霍茲不穩(wěn)定性波的形成原理，構(gòu)造了一種表面具有定向排列的亞微米結(jié)構(gòu)的海藻酸鹽微纖維。通過調(diào)節(jié)纖維的灌注速度和紡絲速度來調(diào)整水凝膠紡絲制得微纖維的亞微米形態(tài)，以此改變細胞生長的定向性。PC12細胞在表面具有剪切花紋的微纖維上培養(yǎng)時呈現(xiàn)沿纖維軸定向生長的趨勢，但在培養(yǎng)皿或者光滑纖維上生長時呈現(xiàn)隨機排列的趨勢[圖9（b）]

[94]。如圖9（c）[95]所示，通過3D打印微流體構(gòu)建的3D微纖維網(wǎng)絡(luò)，也具有引導(dǎo)細胞定向生長的功能。在空氣中打印一種表面具有程序化周期褶皺的殼聚糖支架，發(fā)現(xiàn)L929成纖維細胞在支架中沿著殼聚糖纖維絲方向定向生長。

4.2. 3D 細胞培養(yǎng)

細胞易受微環(huán)境的影響，微環(huán)境會影響細胞的形態(tài)、黏附、遷移、增殖和分化[96,97]。與傳統(tǒng)的2D培養(yǎng)相比，3D培養(yǎng)的優(yōu)勢在于能夠模擬細胞間的相互作用和體內(nèi)的微環(huán)境[98,99]，且3D培養(yǎng)能夠在體外重構(gòu)組織的3D結(jié)構(gòu)以及恢復(fù)組織生理學(xué)的部分功能。因此，細胞3D培養(yǎng)技術(shù)在細胞生物學(xué)、藥物研發(fā)、組織工程等領(lǐng)域至關(guān)重要?，F(xiàn)已有多種細胞3D培養(yǎng)的方法[100-102]。由于微流控技術(shù)具有可構(gòu)建仿生體系、高通量制造、形狀及細胞微環(huán)境可控等優(yōu)勢，其生成的微載體或微纖維已經(jīng)成為一種新型的3D細胞培養(yǎng)平臺。目前研究人員在這個領(lǐng)域已經(jīng)開展了大量的研究工作。

Wang Y和Wang J [103]開發(fā)了一種液滴微流控的方法，采用由海藻酸鈉和人工基底膜交聯(lián)形成的水凝膠微載體制備腫瘤多細胞球體。將人宮頸癌細胞（HeLa細胞）包埋在微載體內(nèi)，細胞間緊密相連。用抗腫瘤藥物測試在微載體中形成的HeLa細胞球體，發(fā)現(xiàn)腫瘤多細胞球體在體外具有模擬腫瘤特性的能力。這種制備腫瘤多細胞球體的微流控方法可用于細胞間相互作用的研究、腫瘤的治療和高通量抗腫瘤藥物的篩選。He等[104]用微流控技術(shù)制備了一種包裹胚胎干細胞（ES細胞）的核-殼結(jié)構(gòu)微載體，這種微載體在ES細胞的3D培養(yǎng)中表現(xiàn)出良好的促聚集和促增殖的能力。且與2D培養(yǎng)相比，3D培養(yǎng)的ES細胞保持了更高的多能性。此外，研究人員將細胞封裝在具有核-殼結(jié)構(gòu)的微載體中進行培養(yǎng)，通過用不同種類的生物相容性聚合物取代核-殼結(jié)構(gòu)中的核材料，研究細胞微環(huán)境對細胞3D培養(yǎng)的影響[105]。這種仿生3D細胞技術(shù)在發(fā)育生物學(xué)和高通量藥物篩選方面具有較好的應(yīng)用發(fā)展前景。Leong等[106]更為詳盡地對細胞球狀體在微載體中培養(yǎng)的微環(huán)境進行評估[圖9（d-i）]。研究人員用油層代替水凝膠外殼，簡化了封裝過程，同時降低了各相的黏度要求。如圖9（d-ii）[106]所示，由于與油中的兩親性表面活性劑相結(jié)合，液滴微流控系統(tǒng)在150 min后即可誘導(dǎo)形成球狀體，而現(xiàn)有的其他技術(shù)則需要1～4 d。此外，分別用海藻酸鈉和海藻酸鈉-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（-RGD）將hMSC包裹在核-殼結(jié)構(gòu)中形成球狀體，其中后者展現(xiàn)出增強的細胞成骨分化能力[圖9（d-iii）、（d-iv）[106] ]。結(jié)果表明，可以微調(diào)微環(huán)境，如改變液滴微流控系統(tǒng)的內(nèi)芯材料，從而促進細胞分化。

負載細胞的微纖維在3D細胞培養(yǎng)中也起著重要作用。如圖9（e）所示，Zhao等[75]用海藻酸鹽微纖維進行細胞3D培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)肝癌細胞（HepG2細胞）在微纖維中增殖并聚集形成球狀體。用連續(xù)微流控紡絲制得負載細胞的微纖維，可獲得大量的細胞球體。通過破壞海藻酸鈣凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)釋放出細胞球體，以進行后續(xù)研究與應(yīng)用。另外，該研究還探究了不同微纖維結(jié)構(gòu)對細胞性能的影響。

4.3. 組織構(gòu)建

將工程化的微載體、微纖維經(jīng)過組裝或堆疊成任意的3D結(jié)構(gòu)，可以體外構(gòu)建3D細胞結(jié)構(gòu)。Takeuchi等[107]將大量負載細胞的膠原蛋白微載體堆疊到設(shè)計好的硅樹脂組分中[圖10（a）]，由于位于微載體表面的細胞間存在黏附作用，無需添加任何黏合劑，從而快速構(gòu)建了宏觀3D細胞模型。He等[58]用類似方法進行自下而上組裝，在體外構(gòu)建了人類乳腺血管瘤。在這項研究中，研究人員首先將癌細胞在微載體中進行3D培養(yǎng)，以獲得無血管的微腫瘤，然后將其與內(nèi)皮細胞和其他基質(zhì)細胞組裝在一起制造出人工血管瘤。人工血管瘤比無血管的微腫瘤或2D培養(yǎng)的癌細胞表現(xiàn)出更高的耐藥性，這表明了細胞外微環(huán)境的重要性。Zhao等[81]利用微流控技術(shù)制備了具有生物活性的微纖維以建立多種形態(tài)的3D結(jié)構(gòu)，并首次構(gòu)建了能夠裝載人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）的中空水凝膠微纖維。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HUVEC附著在中空微纖維的內(nèi)界面上，鋪展形成在成分和結(jié)構(gòu)上與血管相似的單層細胞管。隨后，通過堆疊或交叉紡織微纖維構(gòu)建了多層結(jié)構(gòu)或網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，這在仿生微纖維網(wǎng)絡(luò)組織方面具有一定的應(yīng)用前景。除了基于微載體或微纖維構(gòu)建3D細胞模型，Wallace等[108]使用手持式微流控生物打印方法構(gòu)建了3D類腦結(jié)構(gòu)模型[圖10（b）]。這種自由形成的3D結(jié)構(gòu)具有分層結(jié)構(gòu)，由多肽修飾的生物聚合物和裝載的原代神經(jīng)細胞組成。如圖10（b-iii）所示，在該3D結(jié)構(gòu)模型中形成了多層神經(jīng)回路，推動了對腦部疾病病發(fā)機理與大腦學(xué)習(xí)和記憶功能相關(guān)的研究。

圖9. 細胞定向和細胞3D培養(yǎng)在醫(yī)用增材制造領(lǐng)域的應(yīng)用。（a）～（c）細胞定向[92,94,95]；（d）、（e）細胞球狀體制作[106,75]。

4.4. 細胞治療

可將在負載細胞的微載體或微纖維中注射水凝膠材料、生物活性物質(zhì)或者治療性細胞的方法應(yīng)用于醫(yī)學(xué)移植、傷口愈合和組織再生領(lǐng)域[109,110]。這些方法能夠復(fù)制組織結(jié)構(gòu)功能，在微創(chuàng)植入方面具有巨大的潛力和前景。因而這些方法在這一領(lǐng)域的應(yīng)用越來越受到人們的重視，各類相關(guān)的研究成果相繼問世。

Takeuchi等[86]探討了負載細胞微纖維在醫(yī)學(xué)移植中治療糖尿病的適用性。他們首先用海藻酸鹽-瓊脂雙交聯(lián)互穿網(wǎng)絡(luò)（IPN）水凝膠包裹負載有胰島細胞的微纖維，以避免纖維發(fā)生纖維化反應(yīng)，同時保護細胞免受免疫攻擊。然后，他們將被水凝膠包裹的負載有胰島細胞的微纖維植入糖尿病小鼠體內(nèi)，小鼠血糖濃度逐漸恢復(fù)正常。相反地，直接在小鼠體內(nèi)注射負載有等量原代胰島細胞卻不起作用。這一結(jié)果證實了負載有原代胰島細胞的微纖維對糖尿病具有治療能力。Zhao等[111]提出了一種新型微纖維，負載維生素金屬有機骨架（MOF），用于傷口愈合[圖10（c）]。在通過微流控紡織具有核-殼結(jié)構(gòu)的海藻酸鹽微纖維的過程中，MOF在原位合成了。微纖維高度可控的核-殼結(jié)構(gòu)使得負載的MOF可被溫和地釋放，從而具有抗菌和抗氧化能力。當(dāng)將微纖維制成的薄膜應(yīng)用于皮膚創(chuàng)口感染的小鼠模型時，釋放出的銅離子、鋅離子和生物相容的維生素配體加速了組織創(chuàng)傷的愈合過程。除了在創(chuàng)傷愈合上的應(yīng)用，Segura等[52]還開發(fā)了一種構(gòu)建塊的方法，以獲得基于微載體可注射的組織仿生結(jié)構(gòu)，并將其輸送到傷口部位用于傷口愈合。如圖10（d）[52]所示，注射組織的仿生結(jié)構(gòu)的傷口愈合速度明顯快于其他對照組。傷口愈合的速度由3D仿生結(jié)構(gòu)模型中微載體孔隙的大小決定。

負載干細胞的微載體或微纖維已經(jīng)在細胞治療方面展現(xiàn)出一定的應(yīng)用前景。攜帶干細胞的微載體或微纖維在被注射入體內(nèi)后能夠迅速降解，使細胞在體內(nèi)釋放。例如，人臍帶間充質(zhì)干細胞（HUCMSC）在注射4 d后即從微載體中釋放出來，并表現(xiàn)出良好的增殖特性和成骨分化能力[112]。另外，負載干細胞的微載體或微纖維具有良好的生物相容性，有望用作長期運輸治療因子的新平臺。綜上所述，負載功能細胞（無論是高度分化的細胞還是干細胞）的微載體或微纖維在細胞治療和再生醫(yī)學(xué)中展現(xiàn)出極為重要的作用。

圖10. 組織構(gòu)建和細胞治療在醫(yī)用增材制造中的應(yīng)用。（a）、（b）組織構(gòu)建[107,94]；（c）、（d）創(chuàng)傷愈合[111,52]。MOF：金屬有機骨架。

5. 總結(jié)與展望

本文針對負載細胞的微載體、微纖維的微流控生成技術(shù)及其在醫(yī)用增材制造領(lǐng)域的應(yīng)用進行綜述。從對液滴微流控和微流控紡絲技術(shù)的原理介紹開始，闡述了基于微流控技術(shù)的特殊形態(tài)、結(jié)構(gòu)的微載體和微纖維的生成，并著重介紹了將負載細胞的微載體和微纖維進行體外組裝成復(fù)雜3D細胞結(jié)構(gòu)的各種方法。負載細胞的微載體、微纖維具有良好的機械性能、加工特性和生物相容性，未來將會在細胞定向、細胞3D培養(yǎng)、組織構(gòu)建和細胞治療等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。

盡管微流控技術(shù)在醫(yī)用增材制造領(lǐng)域已經(jīng)取得了不少開創(chuàng)性的成果，但一些科學(xué)問題依然需要解決且該學(xué)科仍具有長遠的發(fā)展前景。主要涉及以下三個問題：其一，雖然具有復(fù)雜形態(tài)、結(jié)構(gòu)的微載體在體外構(gòu)建仿生3D細胞結(jié)構(gòu)過程中起到關(guān)鍵作用，然而鑒于微流控裝置的固有特性，目前這種微載體的大規(guī)模生成面臨著嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。文中提到，PDMS和玻璃毛細管是制造微流控裝置最常用的材料。基于PDMS的微流控芯片具有規(guī)?；梢旱蔚膬?yōu)勢，而使用玻璃毛細管構(gòu)造的微流控裝置可穩(wěn)定生成結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜的微流控液滴。若將上述兩種方式的優(yōu)勢進行有機結(jié)合，則有機會推動新一代微流控裝置的誕生，并為具有復(fù)雜形態(tài)和結(jié)構(gòu)的微載體的規(guī)?；a(chǎn)提供潛力。其二，人工體外構(gòu)建的細胞3D結(jié)構(gòu)與體內(nèi)天然組織結(jié)構(gòu)之間存在較大的差異。一方面，在細胞種類、形態(tài)、排列和結(jié)合位點等方面模擬天然組織的非均質(zhì)結(jié)構(gòu)需要付出巨大努力；另一方面，細胞外微環(huán)境和細胞間的相互作用在維持體內(nèi)組織的生理功能方面發(fā)揮著重要作用，可通過在工程組織中附加適合的天然組織源材料以更好地模擬體內(nèi)環(huán)境。其三，目前工程組織搭建方式的可控性和精度都較低，在復(fù)雜的微小組織搭建方面并不適用，此時則需要借助器械裝置。生物3D打印是一種具有廣闊前景的機器構(gòu)建宏觀細胞組織的方式，可用微流控芯片噴頭對生物3D打印機單口噴頭進行替換以實現(xiàn)對多種生物墨水的控制。除上述三個主要問題外，用于長期遞送治療因子或分化細胞的負載細胞的微載體、微纖維的開發(fā)，及其在器官芯片領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用同樣值得期待。

致謝

本研究得到國家重點研究發(fā)展計劃（2020YFA0908200）、國家自然科學(xué)基金（22002061、52073060、61927805）、 江 蘇 省 自 然 科 學(xué) 基金（BE2018707）、江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新基金[CX(20)3051]的資助。

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