金舒文，王 瓊，周 利，鄒 燃，樂 薇，楊 敏，孫 濱，龐爭爭

（1.湖北中醫(yī)藥大學針灸骨傷學院 武漢 430061；2.湖北中醫(yī)藥大學附屬武漢市中西醫(yī)結合醫(yī)院 武漢 430022）

高脂血癥（HL）可獨立誘發(fā)動脈粥樣硬化性心腦血管疾?。ˋSCVD），對人類健康產(chǎn)生極大危害，造成了沉重的社會負擔[1]。血脂水平過高可傷及血管內皮，經(jīng)由相關炎癥、免疫活動誘導，巨噬細胞（m?）形成泡沫細胞，促使脂質大量積聚于內皮下[2]。巨噬細胞膜蛋白三磷酸腺苷結合盒轉運體A1（ABCA1）通過多種途徑將胞內膽固醇和磷脂轉運由胞內向胞外轉移，降低胞內脂質蓄積，抑制炎性因子表達，減輕細胞壁炎性反應，對預防ASCVD 有重要意義。研究證實，其下游Janus 激酶2/信號傳導和轉錄激活子3/鋅指蛋白3636（JAK2/STAT3/TTP）信號通路活化，可引發(fā)若干相關瀑布反應，從而發(fā)揮脂質逆轉運和抗炎的作用[3-4]。前期研究結果顯示，針刺誘導HL 大鼠ABCA1 的表達上調，促進膽固醇逆轉運，同時削弱m? 炎性活動[4][5][6]。同時，臨床試驗還發(fā)現(xiàn)，對HL 患者行豐隆穴針刺治療，可使血脂水平顯著下降[7][8]。然而尚無臨床研究探討針刺豐隆穴對HL 患者血脂調控的長期療效及對血清m?信號通路JAK2/STAT3/TTP的調控機制。本實驗依托武漢市衛(wèi)生和計劃生育委員會青年項目（WZ17Q01），通過測定治療前后及治療后1月、2月、6月高脂血癥患者血脂水平，并檢測巨噬細胞中JAK2、STAT3、TTP mRNA 及蛋白表達，進一步探究電針豐隆穴對高脂血癥患者的臨床療效及對巨噬細胞信號通路的調節(jié)作用。以下為具體的研究。

圖1 病例招募流程圖

表1 三組高脂血癥患者一般資料比較

1 臨床資料

1.1 一般資料

自 2017 年 9 月-2019 年 2 月期間武漢市第一醫(yī)院針灸科篩選出109 位HL 病人，其中90 位病人滿足“痰濁阻遏證”標準，作為研究對象。由隨機數(shù)字表，將這90位病人按1:1:1的比例分為對照組、藥物組與電針組（具體如圖1 所示）?；€期3 組患者一般情況比較無顯著差異（P＞0.05），見表1。此項試驗由武漢市第一醫(yī)院臨床研究倫理委員會審批通過。

1.2 診斷標準

1.2.1 西醫(yī)診斷標準

基于2016 修訂版《中國成人血脂異常防治指南》[9]。在飲食正常時，經(jīng)12 至14h 禁食后，對血脂進行測定，滿足下述任1條及以上者，即可確診HL：1)總膽固醇（TC）≥5.20mmol/L；2)低密度脂蛋白（LDL-C）≥3.4mmol/L；3)甘油三酯（TG）≥1.70mmol/L。

1.2.2 中醫(yī)診斷標準

診斷標準參考《中藥新藥臨床研究指導原則》所示“HL”部分[10]。在診斷痰濁阻遏證方面，標準如下：1)主癥表現(xiàn)為肢體沉重麻木，體胖，頭重似裹，易嘔吐痰涎，胸悶脘痞；2)兼癥表現(xiàn)為食量下降，食欲減弱，口淡，失眠等；3)在舌脈上，表現(xiàn)為舌淡胖且苔白膩，脈弦滑。上述主癥若滿足2 項，同時參考兼癥、舌脈，可確診此病。

1.3 納入標準

①同時符合中西醫(yī)診斷標準；②診斷為原發(fā)性高脂血癥，年齡在30 歲至70 歲之間的患者；③2 周內未服用降脂藥物，血脂水平仍符合診斷標準者；④自愿加入本試驗積極配合并簽署知情同意書者。

1.4 排除標準

①妊娠或哺乳期的女性患者，對降血脂藥物存在過敏反應患者；②6 個月內有心腦血管意外經(jīng)歷，包括腦梗死、急性心肌梗死、曾行重大手術、重度創(chuàng)傷人員；③當前服用甲狀腺素、肝素等對血脂代謝存在影響的藥物的患者；④近14天內接受其他降脂療法的患者；⑤伴發(fā)其它系統(tǒng)（如包括泌尿、心血管、消化與呼吸系統(tǒng)等）嚴重原發(fā)性疾病患者；⑥精神疾病患者。

遠看，菊花是粉紫色的。它是那么的優(yōu)雅，又是那樣的可愛；近看，粉紅色的花瓣中還有一點點惹人喜愛的嫩黃色。小小的花朵，玲瓏可愛，就像一只只粉紫色的小蝴蝶。

1.5 剔除標準

①入組后，發(fā)現(xiàn)同納入標準相?；蛲懦龢藴氏喾幕颊撸虎谘芯科陂g，有對試驗安全性或療效產(chǎn)生明顯干預性的因素存在者。

1.6 脫落標準

①研究過程中出現(xiàn)死亡或病情惡化的患者；②研究過程中拒絕繼續(xù)參與的患者；③發(fā)生嚴重副作用或不良事件的患者。。

2 治療方法

2.1 電針組

選取雙側豐隆穴。患者取仰臥位，充分暴露雙下肢，局部常規(guī)消毒后，將0.32mm*50mm 無菌針灸針（“健衛(wèi)仕”牌，型號S3210，購自中美合作泰成科技發(fā)展有限公司）垂直刺入皮膚，進針深度約40mm，平補平瀉法得氣。同時取兩側豐隆穴近心端0.5cm 左右位置，將輔助針垂直刺入，約15mm 左右深度。雙下肢皆連接韓氏穴位神經(jīng)儀（型號為LH202H，購自北京華衛(wèi)公司），負極連接豐隆穴，正極連接輔助針，直流電，等幅疏密波，頻率2/100HZ，8-12mA，使患者舒適耐受，留針30 分鐘。治療頻次為1 次/天，每周6 天不間斷針刺，共針刺8周。

表2 引物序列

2.2 藥物組

予以患者血脂康膠囊（批號為20171158，購自北京北大維信公司）口服，2 粒/次，2 次/天，共連續(xù)治療8周。

2.3 對照組

患者取仰臥位，充分暴露雙下肢，選取雙側豐隆穴與足三里穴連線中點作為針刺點，保持與皮膚垂直，快速進針，進針深度約40mm 左右。同時取該點近心端約0.5cm 左右位置，將輔助針垂直刺入此部位，保持15mm左右的深度。電針操作方法同電針組。

2.4 生活處方

電針組、藥物組、對照組三組患者皆行低脂飲食，調整生活方式，進行適度鍛煉，對可引發(fā)心血管病的因素加以有效控制，諸如限鹽、戒煙與限酒等。同時告知患者治療過程中忌行對研究結果存在干擾性的其他藥物與干預措施。

3 療效觀察

3.1 檢測指標

3.1.1 血脂檢測

3.1.2 血清巨噬細胞內JAK2、STAT3指標檢測

待完成治療，采集靜脈血，并移至肝素鈉試管內，充分混合。離心處理（期間轉速設定為2000 r/min）10min 后，再將上層血清5ml 移入EP 管內，存放在-80 ℃環(huán)境中，待用。對已解融的細胞懸液離心處理，隨后加入完全培養(yǎng)基中，接受重懸處理，最后置入CO2 培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。等細胞融合90%時，將舊培養(yǎng)基清理掉，PBS 洗滌1 遍，再將適量胰蛋白酶加入其中，1-5min 消化處理，之后對細胞行吹打處理，細胞得以懸浮。用處于對數(shù)生長期的細胞進行培養(yǎng)。向12 孔板（含1ml的1640培養(yǎng)基，但不含F(xiàn)BS）內鋪裝THP-1，經(jīng)隨機方式，歸入對照組、藥物組與電針組，各自添加不同病人的0.25ml血清，進行1d聯(lián)合培養(yǎng)。

借 助 RT-PCR 技 術 ，對 3 組 人 THP-1 源 m? 中STAT3、JAK2、TTP mRNA 含量展開測定。在 m? 總RNA 提取方面所借助的工具為Trizol RNA 試劑盒。借助分光光度法，對RNA 濃度展開測定，再根據(jù)逆轉錄說明書所示，用PrimeScript TM RT Master Mix 逆轉錄RNA。以GAPDH 為內參，測定引物的融解曲線并統(tǒng)計 Ct 值，對 3 組細胞 STAT3、JAK2、TTP mRNA 含量進行實時PCR定量分析。各需檢樣本皆設置3管平行管。以公式ΔCt=[Ct]-[Ct(GAPDH)], ΔΔCt=[ΔCt (實驗組)]-[ΔCt(對照組)]，采用2-ΔΔCT 法，計算實驗組目的基因相對于對照組原始拷貝數(shù)的倍數(shù)差異，即相對mRNA 水平表達量。引物序列見表2。

免疫印跡法（Western Blotting）：提取3組m?蛋白，同時借助BCA 蛋白濃度檢測試劑盒，完成對濃度的測定。對蛋白實施SDS-PAGE 電泳處理，再借助濕轉法將蛋白向PVDF 膜上轉移，接著在室溫中，于脫色搖床上由脫脂牛奶(5%)封閉1h。加入JAK2、TTP 與STAT3一抗，稀釋（1:1000），4℃下孵育過夜。待完成洗膜，加入山羊抗兔二抗（標記物為辣根過氧化物酶），稀釋（1:3000），再于室溫中，進行0.5h 的孵育處理，接著洗膜。待完成免疫作用，將膜取出，開始ECL 發(fā)光、顯影與定影處理。之后整理去色，再借助Alpha 處理系統(tǒng)，完成目標條帶光密度的分析。通過灰度值（目的條帶）/灰度值（ACTIN）計算各組目的條帶與內參條帶的光密度比值，來計算相對蛋白表達量。

3.2 療效評價標準

參照臨床藥物研究指導原則[15]。顯具體標準如下：1）顯效。待治療完成，血脂方面符合下述任1 條：TC 減少≥20%，HDL-C 增高≥0.26 mmol/L，TC-HDL-C/HDL-C 減少≥20%，TG 減少≥40%。2）有效。待結束治療，血脂方面符合下述任1 條：TC 減少處于10%至20% 范圍，TG 下降 20%～40%，HDL-C 上升 0.104～0.26 mmol/L，TC-HDL-C/HDL-C 下降 10%～20%；3）無效。不符合有效條件；4）惡化。待治療結束，血脂方面符合下述任 1 條，TC 增高≥10%，TG 上升≥10%，HDL-C 下降≥0.104 mmol/L，TC-HDL-C/HDL-C 增高≥10%?？傆行蕿椤帮@效”例數(shù)、“有效”例數(shù)之和在總例數(shù)中的占比。

3.3 統(tǒng)計方法

各項數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析均借助SPSS26.0。計量數(shù)據(jù)若呈正態(tài)分布，描述形式即為均數(shù)(`x)±標準差(s)。在比較3組間血脂水平，實施重復測量方差分析法；在比較蛋白與mRNA 水平，實施單因素方差分析法，同時采用LSD 兩兩對比；組內對比，采用配對t 檢驗。分析計數(shù)數(shù)據(jù)，采用卡方檢驗。若分析結果為P＜0.05，提示存在統(tǒng)計學意義。

4 結果

4.1 各組有效率

通過表3 可見，在總有效率方面，對照組、藥物組各為0%、86.6%，電針組總有效率為83.3%。兩組經(jīng)X2檢驗比較無明顯差異，電針治療與藥物治療效果相當。

表3 各組患者臨床療效比較［例（%）］

表4 各組患者治療前后血脂結果測定比較（mmol·L-1，）

表4 各組患者治療前后血脂結果測定比較（mmol·L-1，）

注：與同組治療前比較，*P ＜ 0.05；與對照組比較，#P ＜ 0.05

LDL 3.93±0.45 2.59±0.47*#1.34±0.62#3.89±0.29 2.56±0.36*#1.33±0.47#3.88±0.34 3.93±0.35-0.05±0.49組別電針組30例數(shù)藥物組30對照組30時間治療前治療后差值治療前治療后差值治療前治療后差值TC 6.11±0.61 5.14±0.51*#0.97±0.88#6.24±0.33 5.00±0.50*#1.24±0.58#6.01±0.59 6.06±0.66-0.05±0.39 TG 3.63±0.55 2.11±0.71*#1.52±0.50#3.65±0.43 1.91±0.55*#1.75±0.52#3.79±0.27 3.79±0.35-0.00±0.39 HDL 1.18±0.13 1.16±0.19 0.02±0.16 1.20±0.14 1.23±0.20-0.02±0.20 1.12±0.11 1.23±0.13-0.11±0.11

4.2 各組患者血脂水平變化

4.2.1 治療后各組患者血脂水平比較

基線期各組患者在血清TC、TG、LDL-C 與HDL-C水平比較上，P＞0.05，未見顯著差異。在組內比較方面，藥物組、電針組治療后的TC、TG 與LDL-C 水平較治療前均顯著下調（P＜0.05），且兩組下降水平未見顯著差異（P＞0.05）。治療后藥物組和電針組血脂水平較對照組有顯著差異（P＜0.05）。對于對照組而言，血脂水平各項指標無顯著差異（P＞0.05）（表4）。

4.2.2 隨訪期各組患者血脂水平比較

由可見，隨訪期間，電針組治療后1 月、2 月與6月時的LDL、TC 與TG 水平較治療后未見顯著差異；藥物組治療后2 月、治療后6 月TC、TG、LDL 與治療后比較差異有統(tǒng)計學意義，分別相較于對照組仍有明顯差異。結果表明治療后2 月、治療后6 月藥物組TC、TG、LDL 升高，血脂水平出現(xiàn)反彈，而電針組未見反彈。藥物組和電針組治療前后及隨訪HDL 變化差異無統(tǒng)計學意義，說明兩組對HDL的無明顯調整作用。對照組干預前后各項指標比較無統(tǒng)計學意義（表5）。

4.3 各組巨噬細胞JAK2mRNA、STAT3 mRNA、TTPmRNA表達水平比較

治療后藥物組和電針組患者JAK2mRNA、STAT3mRNA、TTPmRNA 表達均明顯高于對照組；電針組 JAK2mRNA、STAT3mRNA、TTPmRNA 表達無明顯差異。電針組相比于藥物組未見明顯差異圖2。

表5 各組患者隨訪血脂結果測定比較（mmol L-1，）

表5 各組患者隨訪血脂結果測定比較（mmol L-1，）

注：與同組治療后比較，*P ＜ 0.05；與對照組比較，#P ＜ 0.05

LDL 2.59±0.47#2.61±0.47#2.55±0.43#2.66±0.48#2.56±0.36#2.64±0.42#3.11±0.39*#3.29±0.38*#3.93±0.35 4.07±0.32 3.89±0.57 3.92±0.53組別例數(shù)電針組30藥物組30對照組30時間治療后治療后1月治療后2月治療后6月治療后治療后1月治療后2月治療后6月治療后治療后1月治療后2月治療后6月TC 5.14±0.51#5.04±0.31#5.02±0.19#5.08±0.16#5.00±0.50#5.32±0.43#5.77±0.43*#5.83±0.37*#6.06±0.66 6.04±0.51 6.28±0.44 6.34±0.41 TG 2.11±0.71#2.09±0.63#1.95±0.65#2.11±0.64#1.91±0.55#2.14±0.46#2.73±0.49*#2.88±0.56*#3.79±0.35 3.88±0.43 3.96±0.32 3.90±0.26 HDL 1.16±0.19 1.17±0.20 1.12±0.20 1.11±0.19 1.23±0.201.29±0.16 1.21±0.20 1.18±0.22 1.23±0.13 1.21±0.28 1.26±0.26 1.24±0.30

圖2 巨噬細胞與對照組、藥物組及電針組人血清共培養(yǎng)實時定量聚合酶鏈反應的JAK2mRNA、STAT3 mRNA、TTPmRNA表達量比較（，30例患者/組）

圖3 各組巨噬細胞JAK2、STAT3、TTP蛋白表達

4.4 各組巨噬細胞JAK2、STAT3、TTP 蛋白表達水平比較

圖4 巨噬細胞與對照組、藥物組及電針組人血清巨噬細胞共培養(yǎng)的JAK2、STAT3、TTP蛋白相對表達量比較（，30例患者/組）

通過圖 3、4 可見，在治療后 STAT3、JAK2 與 TTP的蛋白表達水平上，相較對照組，藥物組和電針組均顯著升高（P＜0.05）；且電針組和藥物組未見顯著差異（P＞0.05）。

5 討論

祖國醫(yī)學中，自黃帝內經(jīng)便有對高脂血癥相關敘述，如《素問·通評虛實論》中:“凡治消痹、仆擊、偏枯萎厥，氣滿發(fā)膩，甘肥貴人，則膏粱之族也?！逼渑c脾虛痰濁關系最為密切，病機總屬本虛標實[16][17]。目前血脂異常指南多推薦口服降脂藥物治療，如中成藥物血脂康，由發(fā)酵而成的紅曲精制而成，具有消食、活血、除濕的功用，臨床研究證實可降低高脂血癥患者TC、TG、LDL-C，且升高HDL-C 作用優(yōu)于他汀類藥物[8][18]。但部分患者對該類藥物不耐受，存在肝腎功能損害、胃腸道反應等不良反應?！队颀埜琛酚性疲骸疤刀嘁讼蜇S隆尋”，豐隆穴為足陽明胃經(jīng)絡穴，別走足太陰脾經(jīng)，溝通脾胃經(jīng)氣，具有健脾、化痰、利濕之功，為治痰之要穴，自《靈樞》以來歷代醫(yī)家多選用豐隆穴治療痰濁病證。目前臨床研究已表明針刺治療高脂血癥療效明確，具有潛在優(yōu)勢，文獻研究分析以電針豐隆穴使用頻次最高[19-22]。故本研究以電針豐隆穴為干預措施，與口服血脂康及非經(jīng)非穴針刺相比較，探究電針豐隆穴治療高脂血癥的有效性。

當處于高血脂狀態(tài)時，在各種生長因子、趨化因子，氧化 LDL（ox-LDL）介導下，單核細胞會向 m? 分化，進而吞噬在內皮下積滯的脂質，導致若干相關炎性、免疫活動的發(fā)生，進而形成動脈粥樣硬化。m? 膜轉運蛋白ABCA1 調控胞內磷脂和膽固醇與細胞表面的Apo AI結合，促進脂質的流出，較少胞內脂質負荷，并激活下游JAK2/STAT3 通路。JAK2/STAT3 發(fā)揮前饋機制，增強ABCA1 與ApoAI 的活性結合，且直接調控ABCA1 的基因表達[24-25]。同時JAK2/STAT3 促進炎性因子的降解，發(fā)揮抗炎作用[26-27]。TTP 作為JAK2/STAT3 的下游信號，通過降解炎性因子mRNA 的富腺嘌呤、尿嘧啶區(qū)域，進而調控炎性因子蛋白的表達。已有研究證實，上調JAK2/STAT3/TTP 通路，可顯著降低炎性因子（如TNF-α、IL-6、MCP-1）的產(chǎn)生[4,28]。故而，信號途徑JAK2/STAT3/TTP 能夠增強脂質逆轉運效率，并減輕炎性反應，達到防止動脈粥樣硬化的作用。

通過此項研究證實，電針豐隆穴可顯著降低患者血脂，顯著下調TC、TG 與LDL-C 水平，同時可獲得較為穩(wěn)定的長期療效，相較藥物療法體現(xiàn)出明顯優(yōu)勢。此療法同時可使 m? 內 TTP、JAK2 與 STAT3 三者蛋白、mRNA 表達量大幅上調，具有一定的防治動脈粥樣硬化的作用。其降脂療效可能與通過調控信號途徑JAK2/STAT3，增強膽固醇逆轉運效率相關。此研究以及既往已有研究結果皆顯示，同藥物降脂比較，針刺豐隆穴療效更穩(wěn)定，同時不會引發(fā)肝酶上升等不良作用，具備有效性與安全性[7][29]。但針刺療法存在一定時間、經(jīng)濟成本，本次試驗中患者需每日行針刺治療，因此為保持患者依從性，試驗過程中采取以下措施：首先，試驗前向患者宣傳前期研究已證實針刺降血脂療效，且有研究表明療效與患者依從性明確相關，使患者對針刺療效產(chǎn)生認可[30]；再者，試驗前做好充分的知情同意，使受試者主動表態(tài)服從實驗，要求進入試驗；除此之外，試驗過程中設有專門診室，保證研究人員固定，對每位患者建立完整的檔案信息，并與患者保持良好的醫(yī)患溝通，獲得受試者充分信任，在試驗過程中若患者提出相關疑問或出現(xiàn)焦慮心理，充分解釋并鼓勵繼續(xù)堅持。但本試驗受試者樣本數(shù)較少，結果可能存在一定偏移，且僅對JAK2/STAT3/TTP 信號通路進行了初步研究。今后需開展更多的大樣本臨床研究，且對其上游信號以及下游炎性因子的作用值得進一步探討。但此項研究所涉及樣本量有限，結果有偏移風險，同時僅較為表淺地分析了信號途徑JAK2/STAT3/TTP。未來應進行更為廣泛的大規(guī)模臨床實驗，同時更為深入的挖掘其上游信號與下游炎癥介質的影響。