(1 中國人民解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心病理科，北京 100853；2 航空總醫(yī)院病理科)

卵巢粒層細(xì)胞瘤(GCT)是一種較常見的卵巢性索-間質(zhì)瘤，發(fā)病率約占卵巢惡性腫瘤的2%～5%[1]。根據(jù)2014年WHO發(fā)布的《WHO女性生殖器官腫瘤分類》，卵巢GCT被分為成年型GCT(AGCT)以及幼年型GCT(JGCT)兩類，其中以AGCT最為多見，約占95%以上。AGCT的發(fā)病機(jī)制仍不清楚[2-3]，特別是與部分卵巢卵泡膜-纖維瘤的鑒別診斷比較困難，是目前臨床病理學(xué)診斷的難點(diǎn)之一。目前研究發(fā)現(xiàn)，翼狀螺旋/叉頭轉(zhuǎn)錄因子2 (FOXL2)通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄及蛋白的表達(dá)，參與GCT的發(fā)生、發(fā)展過程[4-6]，F(xiàn)OXL2基因突變成為AGCT研究的重點(diǎn)方向。本研究通過比較AGCT和卵泡膜-纖維瘤的FOXL2基因突變情況，為兩種腫瘤的診斷及鑒別診斷提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料來源

收集2012年1月—2018年12月中國人民解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心及航空總醫(yī)院病理科同期診斷為卵巢AGCT及卵泡膜-纖維瘤患者的標(biāo)本各26例。AGCT患者(研究組)年齡28～76歲，平均52.7歲；主要癥狀為月經(jīng)紊亂及絕經(jīng)后陰道不規(guī)則流血，其次為腹痛或盆腔包塊。其中7例為復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移病例，已轉(zhuǎn)移至盆腔、肝臟、肺、直腸等部位。卵泡膜-纖維瘤患者(對照組)年齡27～75歲，平均46.6歲；5例患者因腹部膨大、下腹痛、不規(guī)則陰道流血就診，其余均因體檢時(shí)超聲檢查發(fā)現(xiàn)卵巢占位而進(jìn)行手術(shù)。

1.2 組織形態(tài)學(xué)觀察

所有標(biāo)本均經(jīng)3.7%中性甲醛溶液固定，規(guī)范取材后轉(zhuǎn)移至脫水機(jī)中脫水，然后透明、浸蠟、石蠟包埋，4 μm厚切片，蘇木精-伊紅(HE)染色后于顯微鏡下觀察。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測

免疫組織化學(xué)檢測采用EnVision二步法。石蠟組織樣本4 μm厚切片，經(jīng)二甲苯及梯度乙醇脫蠟至水，以體積分?jǐn)?shù)0.03過氧化氫溶液去除內(nèi)源性過氧化物酶，采用pH 7.0 EDTA緩沖液高壓熱修復(fù)抗原2 min。所用一抗包括CD99、抑制素(Inhi-bin-a)、鈣網(wǎng)膜蛋白(Calretinin)、波形蛋白(Vimentin)、CD56等，二抗為PV-6000通用型試劑盒，均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，設(shè)立陰性及陽性對照，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。

1.4 基因組DNA制備及基因測序

每個(gè)石蠟包埋標(biāo)本均切取8～10個(gè)5 μm厚的石蠟卷，采用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(德國凱捷公司)提取基因組DNA。采用PCR方法擴(kuò)增FOXL2基因的1號外顯子，針對其突變的PCR上游引物序列為：5′-CCAGTACATCATCGCGAAG-TTCCCG-3′，下游引物序列5′-CTCCGGCCCCGA-AGAGCC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為269 bp。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94℃ 變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，總共35個(gè)循環(huán)；末次循環(huán)72 ℃延伸10 min。收集PCR產(chǎn)物4 ℃下保存。擴(kuò)增產(chǎn)物于20 g/L的瓊脂糖凝膠上電泳，確定特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，最后對DNA產(chǎn)物純化回收并進(jìn)行Sanger測序(北京擎科生物科技有限公司)，測序儀型號3730XL。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 病理形態(tài)學(xué)及免疫組化檢查結(jié)果

鏡下AGCT細(xì)胞生長方式多樣，常見為彌漫型、條索狀、緞帶狀和島狀結(jié)構(gòu)，可見粒層細(xì)胞圍繞小腔隙，形成微濾泡結(jié)構(gòu)(Call-Exner小體)，腔內(nèi)見嗜酸性分泌物；腫瘤細(xì)胞界限不清，胞漿稀少，細(xì)胞核圓形、卵圓形，可見核溝(圖1A)。對照組鏡下腫瘤細(xì)胞呈編織狀、旋渦狀排列，細(xì)胞以肥胖的短梭形細(xì)胞為主，胞核呈卵圓形，胞漿呈空泡狀，富含脂質(zhì)(圖1B)。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，Vimentin、Inhibin-a、Calretinin、CD56及CD99在AGCT中陽性表達(dá)率分別為100%(25/25)、88.0%(22/25)、92.8%(13/14)、62.5%(10/16)、40.0%(6/15)；在對照組中的陽性表達(dá)率分別為100%(24/24)、76.9%(20/26)、73.1%(19/26)、0(0/11)、0(0/10)，其中兩組Inhibin-a、Calretinin陽性表達(dá)率比較差異均無顯著性(P>0.05)。

2.2 基因測序結(jié)果

測序結(jié)果顯示，26例AGCT患者中19例檢測到FOXL2 c.C→ G雜合性突變(圖2A)，突變率為73.1%，對照組26例均未檢測到該基因突變(圖2B)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.089，P<0.05)。檢測FOXL2突變診斷AGCT的靈敏度為73.1%，特異度為100%。

3 討 論

AGCT是臨床常見的一種具有內(nèi)分泌功能的卵巢腫瘤，大多分泌雌激素，偶爾也會(huì)分泌雄激素，從而影響卵巢功能。其臨床表現(xiàn)缺乏特異性，主要表現(xiàn)為陰道不規(guī)則流血、月經(jīng)紊亂以及腹部包塊。AGCT呈低度惡性，預(yù)后通常較好，5年生存率可達(dá)90%以上，但也有晚期復(fù)發(fā)情況，其復(fù)發(fā)時(shí)間個(gè)體差異較大，文獻(xiàn)報(bào)道約2～37年[7-9]。如果腫瘤出現(xiàn)復(fù)發(fā)、自發(fā)破裂、盆腔內(nèi)蔓延或腫瘤累及卵巢外的組織器官等情況時(shí)均提示預(yù)后不良。

A：AGCT，B：卵泡膜-纖維瘤，HE染色，200倍

A：AGCT中FOXL2c.C→G雜合性突變(箭頭所示)；B：卵泡膜-纖維瘤中FOXL2野生型序列
圖2 兩種腫瘤中FOXL2基因突變情況

目前AGCT診斷主要依據(jù)的是其鏡下病理學(xué)特征，不同性索-間質(zhì)腫瘤間可能存在重疊的組織形態(tài)[10]，因此鑒別診斷有很大挑戰(zhàn)性，尤其是對于復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移病灶。AGCT屬于低度惡性腫瘤，有遠(yuǎn)期復(fù)發(fā)的臨床特征，而卵泡膜-纖維瘤是最常見的原發(fā)性卵巢實(shí)性腫瘤，絕大多數(shù)為良性，但兩者?；旌洗嬖诙倚螒B(tài)學(xué)有部分交叉，兩者鑒別常常是臨床病理工作的難點(diǎn)，尤其是彌漫型AGCT與富于細(xì)胞的卵泡膜瘤，腫瘤細(xì)胞均較密集，細(xì)胞呈圓形或卵圓形，光鏡下不易分辨。網(wǎng)織纖維染色可能有所幫助，卵泡膜-纖維瘤顯示網(wǎng)織纖維包繞著每個(gè)瘤細(xì)胞，而AGCT則呈巢狀，網(wǎng)織纖維包繞團(tuán)狀瘤細(xì)胞[11]，但由于技術(shù)因素，如試劑的選擇或操作不當(dāng)，常常導(dǎo)致網(wǎng)狀纖維染色不佳以致結(jié)果無法判讀。

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，Inhibin-a、Calretinin、CD99、CD56等對AGCT診斷的靈敏度和特異度并不高[12]，雖然有助于確定這些腫瘤的細(xì)胞譜系，但不能區(qū)分不同腫瘤的類型。正如本組病例所示，性索-間質(zhì)標(biāo)志物Inhibin-a、Calretinin在兩組病例中均有較高的表達(dá)，而Vimentin、CD99、CD56缺乏特異性，在多種腫瘤中均有表達(dá)，Vimentin在所有的間葉性腫瘤均表達(dá)，CD99、CD56在神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、淋巴瘤中均表達(dá)。

FOXL2屬于FOXL超家族成員，存在于卵巢、子宮內(nèi)膜、垂體和發(fā)育的眼瞼中，F(xiàn)OXL2是首個(gè)確定的維持卵巢正常功能的常染色體基因，是哺乳動(dòng)物卵巢發(fā)育的最早標(biāo)記物，具有維持人類卵巢功能作用，被認(rèn)為是脊椎動(dòng)物卵巢分化性別二態(tài)性標(biāo)志物[13-14]。FOXL2基因可調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄及其蛋白質(zhì)表達(dá)，卵巢粒層細(xì)胞在增殖分化、卵巢發(fā)育及功能維持方面發(fā)揮著重要作用[15-16]。研究發(fā)現(xiàn)FOXL2是AGCT相對敏感并且具有較高特異度的診斷指標(biāo)[17-18]，這一檢測或許有助于病理醫(yī)師更準(zhǔn)確地對該病進(jìn)行診斷。本研究探討了26例AGCT患者的臨床病理特征及FOXL2基因突變情況。目前，國外文獻(xiàn)報(bào)道的AGCT患者中FOXL2c．402C→G雜合性突變率多在90%以上[19-21]。相比而言，本組資料中AGCT的突變率較低，為73.1%，可能因?yàn)闃颖玖肯鄬^少，存在部分偏差，因此尚需開展大樣本資料做進(jìn)一步探討。本組26例卵泡膜-纖維瘤均未見該基因突變，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。進(jìn)一步證明了FOXL2基因檢測具有較高的特異度和靈敏度，對AGCT診斷及鑒別診斷具有較大的價(jià)值。多項(xiàng)研究表明，單一體細(xì)胞FOXL2突變幾乎只發(fā)生在AGCT，而卵巢的上皮性腫瘤和其他性索-間質(zhì)腫瘤(除個(gè)別支持-間質(zhì)細(xì)胞瘤之外)均未發(fā)現(xiàn)該基因突變[22-26]。JAMIESON等[21]的研究結(jié)果顯示，56例AGCT有52例(93%)攜帶FOXL2突變，4例為野生型，對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)再評價(jià)，發(fā)現(xiàn)這4例為誤診病例，不是AGCT。FASHEDEMI等[27]報(bào)道一組向高級別轉(zhuǎn)化的AGCT患者，腫瘤部分區(qū)域顯示了高級別腫瘤成分，檢測出FOXL2基因突變，可以斷定為AGCT向高級別轉(zhuǎn)化，而不是混合其他類型高級別腫瘤的成分。還有研究顯示隨著臨床分期的增高，AGCT組織中FOXL2基因的表達(dá)水平也升高，提示FOXL2在AGCT復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移過程中也具有重要的意義[28-30]。

綜上，卵巢AGCT依靠組織學(xué)及免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果進(jìn)行診斷有一定的局限性，F(xiàn)OXL2基因突變在AGCT診斷及鑒別診斷中具有很高的價(jià)值，推薦輔助基因突變檢測，以期提高AGCT病理診斷的準(zhǔn)確性，為臨床治療該病提供可靠依據(jù)。