孫秀漫，周楚娟，楊佳彬，杜淑雯，曾彩芳△

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，廣東 廣州511447；2.廣州醫(yī)科大學(xué)，廣東 廣州511436）

金蓮花顆粒為毛茛科金蓮花屬草本植物金蓮花的中藥制劑，淺棕黃色，味甜、微苦，臨床應(yīng)用廣，常用于治療風(fēng)熱邪毒襲肺，以及高熱引起的上呼吸道感染、扁桃體炎及咽炎。金蓮花顆粒收錄于2015年版《中國藥典（一部）》[1]，但其僅收載了金蓮花相關(guān)制劑的含量測(cè)定方法，未記載其指紋圖譜的分析方法。目前鮮有關(guān)于金蓮花顆粒指紋圖譜研究的文獻(xiàn)報(bào)道，主要集中在其臨床藥效研究[2-6]。為保證該藥的安全性和有效性，有必要建立其質(zhì)量控制方法。而化學(xué)成分復(fù)雜的中藥材，單一的活性成分不能成為有效評(píng)價(jià)中藥優(yōu)劣真?zhèn)蔚闹笜?biāo)，單一成分的質(zhì)量控制也難以體現(xiàn)整體質(zhì)量，指紋圖譜是目前較適合的質(zhì)量控制方法[7-9]。金蓮花顆粒、金蓮花膠囊均為金蓮花相關(guān)制劑，關(guān)于金蓮花藥材及金蓮花膠囊的指紋圖譜均有報(bào)道[10-13]。不同制劑工藝對(duì)金蓮花藥材有效成分影響不同，故本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法建立金蓮花顆粒特征圖譜，旨在為金蓮花顆粒的質(zhì)量控制及評(píng)估提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20A型高效液相色譜儀（日本島津公司），包括LC-20AT型四元泵、DGU-20A5R型在線真空脫氣機(jī)、SIL-20A型自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-10Asvp型柱溫箱、SPD-20A型紫外檢測(cè)器、LC-Solution色譜工作站；80-2型離心機(jī)（上海手術(shù)機(jī)械廠）；AUW220D型分析天平（日本島津公司，精度為十萬分之一）；Centrifuge 5424 R型離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；XW-80A型旋渦混合儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；GM-0.33A型津騰隔膜真空泵（天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；SB-3200DTN型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 試藥

甲醇、乙腈均為色譜純（德國默克股份兩合公司）；冰醋酸（分析純，天津市恒興化學(xué)試劑制劑有限公司）；金蓮花顆粒購自10個(gè)社會(huì)藥房（S1批號(hào)為1802062，S2批號(hào)為1801023，S3批號(hào)為1804106，S4批號(hào)為1801011，S5批號(hào)為1707163，S6批號(hào)為1804134，S7批號(hào)為1710210，S8批號(hào)為1804105，S9批號(hào)為1804128，S10批號(hào)為1805153，承德天原股份有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：AgilentC18柱（250mm×4.6mm，4.0μm）；檢測(cè)波長：254 nm；柱溫：30℃；流速：0.6 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相：乙腈（A）-1%HAc水系統(tǒng)（B），梯度洗脫（0～15 min時(shí)10%→17%A，15～25.01 min時(shí)17%→25%A，25.01～60 min時(shí)25%→46%A，60～64.99 min時(shí)46%→10%A）。

2.2 溶液制備

取不同批次的金蓮花顆粒2 g，精密稱定，置150 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3HPLC指紋圖譜的建立

精密度試驗(yàn)：吸取同一批（批號(hào)為1801011）樣品1份，依法制備溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，結(jié)果的RSD均小于2.0%（n=6）。采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A版）軟件進(jìn)行相似度計(jì)算，以第1次進(jìn)樣所得色譜圖為參照，其余5次進(jìn)樣所得色譜圖與之比較。結(jié)果顯示，所得特征圖譜與對(duì)照模式的相似度均大于0.99，表明試驗(yàn)精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為1801011）樣品6份，依法制備供試品溶液，測(cè)定其指紋圖譜，結(jié)果相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于2.0%（n=6）。采用同一軟件進(jìn)行相似度計(jì)算，以第1次進(jìn)樣所得色譜圖為參照，其余5次進(jìn)樣所得色譜圖與之比較。結(jié)果顯示6次所測(cè)得的特征圖譜與所得共有模式的相似度均大于0.99，表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：吸取同一供試品溶液（樣品批號(hào)為1801011）10 μL，分別于0，2，4，8，12，24 h時(shí)進(jìn)樣，測(cè)定各指標(biāo)成分峰面積，結(jié)果相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于2.0%（n=6）。采用同一軟件進(jìn)行相似度計(jì)算，以第1次進(jìn)樣所得色譜圖為參照，其余5次進(jìn)樣所得色譜圖與之比較。結(jié)果所得色譜圖整體特征相似，相似度均大于0.99，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

圖110 批次金蓮花顆粒高效液相色譜特征圖譜重疊圖

2.4 指紋圖譜的建立及相似度分析

取10批次金蓮花顆粒，依法平行制備供試品溶液10份，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，得10批次的金蓮花顆粒HPLC特征圖譜重疊圖，詳見圖1。按中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004 A版）中進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，以S1樣品的指紋圖譜為參照譜圖，對(duì)照?qǐng)D譜的生成采用中位數(shù)法，時(shí)間窗寬度為0.1，生成金蓮花顆粒特征圖譜共有模式，詳見圖2。相似度為0.994～0.999，詳見表1，表明金蓮花顆粒不同批次質(zhì)量較穩(wěn)定。從10批次金蓮花顆粒樣品分析結(jié)果顯示，根據(jù)特征峰的峰形、峰數(shù)、保留時(shí)間等共標(biāo)示出21個(gè)特征共有峰，其中峰2、峰4為2個(gè)最強(qiáng)峰，其次為峰6、峰7、峰17。根據(jù)所得10批次金蓮花顆粒樣品的HPLC特征圖譜，得出21個(gè)特征峰的絕對(duì)保留時(shí)間及絕對(duì)峰面積，以峰2為參照峰（S），分別計(jì)算各特征共有峰的相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積，以及各特征共有峰的平均相對(duì)保留時(shí)間及平均相對(duì)峰面積。結(jié)果表2。

圖2 金蓮花顆粒高效液相色譜特征圖譜共有模式圖

表110 批次金蓮花顆粒相似度

表210 批金蓮花顆粒高效液相色譜特征圖譜共有峰分析結(jié)果（±s，n=10）

表210 批金蓮花顆粒高效液相色譜特征圖譜共有峰分析結(jié)果（±s，n=10）

峰號(hào)峰號(hào)1 2（s）3 4 5 6 7 8 9 1 0 11平均相對(duì)保留時(shí)間（min）0.813±0.007 5 1.000 1.072±0.002 4 1.157±0.005 2 1.303±0.009 2 1.393±0.010 9 1.503±0.016 7 1.526±0.013 1 1.709±0.040 1 1.879±0.071 4 2.002±0.013 9平均相對(duì)峰面積0.101±0.017 4 1.000 0.080±0.030 3 1.957±0.241 5 0.080±0.014 9 0.280±0.026 0 0.216±0.018 8 0.052±0.013 3 0.069±0.015 6 0.043±0.015 2 0.090±0.008 6 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21平均相對(duì)保留時(shí)間（min）2.156±0.013 1 2.303±0.035 4 2.325±0.040 3 2.344±0.041 8 2.477±0.044 6 2.603±0.041 1 2.652±0.048 1 2.734±0.049 7 2.970±0.054 8 3.187±0.059 2平均相對(duì)峰面積0.105±0.009 2 0.034±0.004 0 0.040±0.005 8 0.046±0.010 6 0.031±0.004 5 0.091±0.026 2 0.044±0.006 0 0.069±0.006 9 0.058±0.009 1 0.099±0.010 8

3 討論

根據(jù)金蓮花化學(xué)成分相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，選擇了4組流動(dòng)相，分為是甲醇-醋酸（0.1%～0.5%）、乙腈-醋酸（0.1%～0.5%）、甲醇-水和乙腈-水，按不同比例，分別進(jìn)行梯度和等度洗脫。結(jié)果乙腈-醋酸（0.1%）系統(tǒng)梯度洗脫，各色譜峰分離度好，保留時(shí)間適中，故選擇乙腈-醋酸（0.1%）系統(tǒng)梯度洗脫為流動(dòng)相。

對(duì)比了254，340，274 nm 3個(gè)波長下金蓮花顆粒的HPLC色譜圖。在340 nm波長下的出峰數(shù)較少，254 mm與274 nm波長下HPLC色譜圖相似，與254 nm波長相比，274 nm波長處峰響應(yīng)度較低，254 nm波長下檢測(cè)的各色譜峰分離度好，出現(xiàn)的色譜峰多，基線平穩(wěn)，故選取254 nm作為指紋圖譜檢測(cè)波長。同時(shí)對(duì)柱溫（25，30，40℃）和流速（0.6，0.7，0.8，1.0 mL/min）進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，當(dāng)柱溫為30℃，流速為0.6 mL/min時(shí)，各色譜峰分離度好，保留時(shí)間適中。

收集的金蓮花顆粒樣品來自同一個(gè)廠家的不同包裝，對(duì)不同批次金蓮花顆粒進(jìn)行了指紋圖譜研究，并建立了金蓮花顆粒特征圖譜，共標(biāo)定了21個(gè)共有指紋峰，10批次金蓮花顆粒相似度為0.994～0.999，表明金蓮花顆粒不同包裝、不同批次間質(zhì)量較穩(wěn)定。

通過查閱金蓮花藥材及其制劑的文獻(xiàn)[13-15]可見，本研究中金蓮花顆粒指紋圖譜2～7號(hào)峰、11～12號(hào)峰與13～19號(hào)峰峰群與文獻(xiàn)[11]報(bào)道的金蓮花膠囊指紋圖譜相似，表明2個(gè)制劑指紋圖譜有相似性，這與2個(gè)制劑主要都是用金蓮花藥材制成有關(guān)。對(duì)比金蓮花藥材混合對(duì)照品圖譜及本研究中所得的金蓮花顆粒特征圖譜，推測(cè)本研究中共有模式圖中峰2為葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷，峰4為葒草苷，峰7為牡荊苷。

綜上所述，本研究中建立了金蓮花顆粒指紋圖譜，且該方法穩(wěn)定、重復(fù)性好，可為該藥的質(zhì)量控制提供參考。