沈會(huì)芳，蒲小明，楊祁云，張景欣，孫大元，林壁潤(rùn)

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640）

【研究意義】香蕉細(xì)菌性軟腐病是系統(tǒng)性侵染病害，2009年在廣東省廣州市番禺區(qū)首次發(fā)現(xiàn)，主要為害粉蕉［1］。近年來(lái)，田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)該病已在廣東省廣州、東莞、中山、珠海、惠州、茂名、湛江、汕頭、揭陽(yáng)等地發(fā)生，其中廣州市番禺區(qū)、南沙區(qū)和中山、珠海、東莞市的粉蕉發(fā)病率平均為20%～30%，嚴(yán)重可達(dá)90%，給傳統(tǒng)的粉蕉種植業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失，使當(dāng)?shù)睾芏嘟掇r(nóng)不敢種植粉蕉。其后在廣西［2］、云南［3］均有報(bào)道，該病害在香蕉苗期至成株期均可發(fā)生，呈逐漸上升的趨勢(shì)，廣西部分蕉園發(fā)病率達(dá)20% ，病死率達(dá)70%。另外，病害調(diào)查表明海南、福建等香蕉種植省份已發(fā)現(xiàn)該病。為減少細(xì)菌性軟腐病給香蕉造成的損失，篩選病害高效防治藥劑勢(shì)在必行。

【前人研究進(jìn)展】香蕉細(xì)菌性軟腐病是近年新發(fā)現(xiàn)病害，國(guó)內(nèi)已明確其病原菌為Dickyea zeae［4］，侵染廣東香蕉細(xì)菌性軟腐病菌存在明顯的致病性分化和豐富的遺傳多樣性［5］，已建立了用于香蕉細(xì)菌性軟腐病發(fā)病植株和帶菌土壤的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法［6］。并對(duì)病菌致病機(jī)理進(jìn)行探索，黃寧等對(duì)與致病性密切相關(guān)的生物膜開(kāi)展研究，表明香蕉細(xì)菌性軟腐病菌能形成穩(wěn)固而清晰的生物被膜，其形成能力與環(huán)境條件密切相關(guān)［7-8］；解析了病菌基因組ORFs中的信號(hào)肽及分泌蛋白的可能功能，發(fā)現(xiàn)存在果膠酶、蛋白酶、纖維素酶等致病因子和一系列其他可能的致病因子［9］； 任小平等對(duì)病菌細(xì)胞壁降解酶pelD、pelE基因的克隆表達(dá)及活性分析，發(fā)現(xiàn)接種pelE 表達(dá)蛋白的粉蕉假莖和葉片出現(xiàn)了腐爛癥狀［10］，這些研究為病害的防治提供了理論指導(dǎo)。在病害防治方面，明確廣東香蕉主栽品種對(duì)軟腐病的抗性［11-12］，可為產(chǎn)區(qū)香蕉品種選擇提供參考。國(guó)內(nèi)細(xì)菌性軟腐病的防治主要依靠化學(xué)藥劑，如銅制劑、抗生素類(lèi)殺菌劑等。農(nóng)用硫酸鏈霉對(duì)芫荽軟腐病菌［13］、魔芋軟腐病［14］、胡蘿卜軟腐病菌［15］和高梁軟腐病［16］有一定防效，氧氯化銅可有效防治蝴蝶蘭軟腐?。?7］。Wey等發(fā)現(xiàn)30.3%如鉑美素可溶粉劑和68.8%多保鏈素可濕性粉劑可明顯抑制蝴蝶蘭軟腐病菌生長(zhǎng)，代森錳、嘉賜銅、代森錳鋅等化學(xué)藥劑也具有抑制效果［18］。對(duì)于香蕉細(xì)菌性軟腐病的藥劑篩選報(bào)道相對(duì)較少，陳遠(yuǎn)鳳等報(bào)道二氧化氯進(jìn)行水體消毒可有效預(yù)防香蕉軟腐病通過(guò)水源傳播，并可用于發(fā)病蕉穴土壤消毒［19］；蒲小明等的盆栽試驗(yàn)結(jié)果顯示，88%水合霉素可溶粉劑320 μg/mL和6%菌毒清可濕性粉劑160 μg/mL處理10 d后，對(duì)香蕉細(xì)菌性軟腐病的防效分別為78.03%和81.08%［20］，這些研究為科學(xué)防治軟腐病提供了依據(jù)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】在香蕉產(chǎn)區(qū)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，由于缺少有效防治藥劑，種植戶亂用農(nóng)藥現(xiàn)象明顯，但防治效果較差，無(wú)法控制病害的發(fā)展?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】為有效防治該病害，本研究對(duì)其防治藥劑進(jìn)行篩選，并提出其田間精準(zhǔn)使用技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株：香蕉細(xì)菌性軟腐病菌（Dickeya zeae），保存于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所［4］。供試香蕉品種：廣粉1號(hào)。供試培養(yǎng)基：肉汁凍培養(yǎng)液（NA）：牛肉浸膏3 g，酵母浸膏1 g，蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，蒸餾水1 000 mL，pH為6.8～7.0，121℃滅菌30 min后備用。

供試藥劑：復(fù)合亞氯酸鈉粉（ClO2含量4.8%），新鄉(xiāng)市康大消毒劑有限公司；硫酸鏈霉素，72%可濕性粉劑（1 600萬(wàn)單位），成都普惠生物工程有限公司；青霉素鉀（400萬(wàn)單位），河北遠(yuǎn)征藥業(yè)有限公司；春雷霉素，2%水劑，江門(mén)植保有限公司；中生菌素，3%可濕性粉劑，福建凱力生物制品有限公司；王銅（氧氯化銅），30%懸浮劑，廣東大豐植?？萍加邢薰?；春雷霉素·王銅，47%可濕性粉劑（春雷霉素有效成分為2%、王銅為45%）；噻菌銅，20%懸浮劑，浙江龍灣化工有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同藥劑對(duì)香蕉細(xì)菌性軟腐病菌的最小抑制濃度 試驗(yàn)于2019年4月在廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，將病菌接種于NA培養(yǎng)液，于30 ℃轉(zhuǎn)速150 r/min的搖床培養(yǎng)24 h，制成病原菌液。首先在無(wú)菌條件下向玻璃試管內(nèi)分別加入4.8 mL NA培養(yǎng)液。供試藥劑用無(wú)菌水梯度稀釋至試驗(yàn)所需濃度，取藥液0.1 mL加入含NA培養(yǎng)液的試管，再加入病原菌液0.1 mL，混勻，使藥劑有效成分濃度分別為400、200、100、50、25、12.50、6.25、3.12、1.56、0.78、0.39、0.20、0.10、0（CK）μg/mL，每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5 支試管。在30 ℃轉(zhuǎn)速150 r/min的搖床培養(yǎng)24 h后，觀察無(wú)病菌生長(zhǎng)的最低藥劑濃度，即為該藥劑對(duì)病菌的最小抑菌濃度（MIC）。

1.2.2 采用離體葉片法測(cè)定藥劑對(duì)香蕉細(xì)菌性軟腐病的防治效果 試驗(yàn)于2019年6月在廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，將病菌接種于NA培養(yǎng)液中，在32 ℃轉(zhuǎn)速150 r/min的搖床培養(yǎng)24 h后，用無(wú)菌水配制成106～107CFU/mL的細(xì)菌懸浮液。剪取香蕉苗期植株（植株3～5片葉）中部葉片，大小基本一致，將葉片及葉柄傷口用70%酒精擦拭一遍，自然晾干。藥劑均用無(wú)菌水梯度稀釋成0（CK）、100、200、400 μg/mL，將香蕉葉片置于不同濃度藥液中浸泡1 min，取出自然晾干，在葉片中央用無(wú)菌大頭針密集輕刺10次，在針刺處滴0.2 mL細(xì)菌懸浮液，每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10片葉，放入磁盤(pán)中保濕密封，30 ℃培養(yǎng)。當(dāng)葉片出現(xiàn)黑色病斑時(shí)，每24 h按病害葉片分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)觀察記錄病害發(fā)生情況，處理后120 h計(jì)算病情指數(shù)和防治效果。

香蕉葉片軟腐病分級(jí)調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)：針刺處無(wú)黑色病斑；1級(jí)：針刺處見(jiàn)黑色病斑，病斑不擴(kuò)散至針刺范圍外0.2 cm；2級(jí)：黑色病斑擴(kuò)散至針刺范圍0.2 cm，總病斑面積≤10%葉片面積；3級(jí)：10%葉片面積＜病斑總面積≤25%葉片面積；4級(jí)：25%葉片面積＜病斑總面積≤50%葉片面積；5級(jí)：病斑總面積＞50%葉片面積。

1.2.3 3種藥劑對(duì)香蕉細(xì)菌性軟腐病的盆栽防治效果 試驗(yàn)于2019年9月在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大豐試驗(yàn)基地進(jìn)行，選擇對(duì)離體葉片病害防治效果較好的王銅、春雷霉素·王銅、噻菌銅進(jìn)行盆栽防治試驗(yàn)。盆栽試驗(yàn)采用先接種病原菌后淋施藥劑和先淋施藥劑后接種病原菌兩種方法進(jìn)行。

（1）先接種病原菌后淋施藥劑：選擇生長(zhǎng)期一致的粉蕉幼苗（4～5片葉），將幼苗主根和須根均用消毒剪刀剪短，再重新種植在盆中，在每株香蕉根部土壤中灌入10 mL濃度為106～107CFU/mL病菌懸浮液，置于30 ℃溫室培養(yǎng)3 d后，將王銅、春雷霉素·王銅、噻菌銅按說(shuō)明書(shū)推薦使用濃度稀釋，取10 mL藥液淋施在香蕉根部土壤，繼續(xù)在30 ℃溫室內(nèi)培養(yǎng)，以淋施清水為對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)24株香蕉幼苗。施藥后每24 h按植株病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)觀察記錄病害發(fā)生情況，計(jì)算病情指數(shù)及防治效果。

（2）先淋施藥劑后接種病原菌：按上述方法先淋施藥劑24 h后，再接種病菌，保濕培養(yǎng)，每24 h觀察記錄病害發(fā)生情況，計(jì)算病情指數(shù)及防治效果。

香蕉植株軟腐病病情分級(jí)調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)：植株無(wú)癥狀；1級(jí)：植株心葉出現(xiàn)褐變癥狀，假莖出現(xiàn)褐變；2級(jí)：植株心葉完全褐變，葉片萎焉，假莖褐變；3級(jí)：植株心葉褐變枯死，上端葉片褐變黃化，假莖嚴(yán)重褐變；4級(jí)：植株凋萎死亡。

采用DPS軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用鄧肯氏新復(fù)極差多重比較法（DMRT）進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同藥劑對(duì)香蕉細(xì)菌性軟腐病菌的最小抑菌濃度

8種藥劑對(duì)香蕉細(xì)菌性軟腐病菌的最小抑菌濃度差異較大，結(jié)果見(jiàn)表1。從表1可以看出，硫酸鏈霉素、青霉素鉀和中生菌素對(duì)病原菌的抑制能力較強(qiáng)，最小抑菌濃度分別為0.20、3.12、6.25 μg/mL。春雷霉素和二氧化氯的最小抑制濃度均為100 μg/mL，王銅和春雷霉素·王銅為200 μg/mL，噻菌銅為400 μg/mL?？梢?jiàn)，香蕉細(xì)菌性軟腐病菌對(duì)硫酸鏈霉素、青霉素鉀和中生菌素敏感，對(duì)王銅和噻菌銅不敏感。

2.2 采用離體葉片法測(cè)定不同藥劑對(duì)香蕉細(xì)菌性軟腐病的防治效果

采用離體葉片法測(cè)試藥劑對(duì)香蕉細(xì)菌性軟腐病的防治效果，結(jié)果見(jiàn)表2，從表2可以看出，王銅對(duì)香蕉細(xì)菌性軟腐病的防治效果最好，有效成分為100、200、400 μg/mL時(shí)，防治效果分別為72.09%、83.72%和97.67%。其次是噻菌銅和硫酸鏈霉素，有效成分為400 μg/mL時(shí)，防治效果分別達(dá)96.34%和95.12%；春雷霉素·王銅有效成分為400 μg/mL時(shí)，防治效果為85.88%。青霉素鉀、春雷霉素、中生菌素和二氧化氯防治效果相對(duì)較差，有效成分為400 μg/mL時(shí)，防治效果均低于80%。

表1 不同藥劑對(duì)香蕉細(xì)菌性軟腐病菌的生物活性Table 1 Bioactivity of different bactericides to bacterial soft rot of banana

表2 不同藥劑對(duì)香蕉離體葉片軟腐病的防治效果Table 1 Control effects of different bactericides t on soft rot of banana detached leaves

2.3 3種藥劑對(duì)香蕉細(xì)菌性軟腐病的盆栽防治效果

由于農(nóng)用硫酸鏈霉素不再用于植物細(xì)菌病害的防治，因此，選擇王銅、噻菌銅和春雷霉素·王銅進(jìn)行盆栽試驗(yàn)。

先接種病菌再淋施藥劑的病害防治結(jié)果見(jiàn)表3，按說(shuō)明書(shū)推薦使用濃度施藥，30%王銅懸浮劑和20%噻菌銅懸浮劑對(duì)病害防治效果較好，藥后12 d防治效果分別為79.37%和80.15；47%春雷霉素·王銅可濕性粉劑防治效果稍差，藥后12 d防治效果為71.70%。表明30%王銅懸浮劑和20%噻菌銅懸浮劑在病害發(fā)生后有較好的防治效果。先施藥后接種病菌的病害防治效果見(jiàn)表4，在推薦使用濃度，藥后12 d，30%王銅懸浮劑和20%噻菌銅懸浮劑對(duì)病害的防治效果均在85%以上，47%春雷霉素·王銅可濕性粉劑藥后12 d的防治效果為84.52%?？梢?jiàn)，3種藥劑尤其是30%王銅懸浮劑和20%噻菌銅懸浮劑對(duì)香蕉植株有較好的保護(hù)作用。

表3 3種藥劑先接種病菌后施藥處理對(duì)蕉細(xì)菌性軟腐病的防治效果Table 3 Control effects of three bactericides on soft rot of banana by spraying after inoculating pathogen

表4 3種藥劑先施藥后接種病菌處理對(duì)香蕉細(xì)菌性軟腐病的防治效果Table 4 Control effects of three bactericides on soft rot of banana by spraying before inoculating pathogen

3 討論

香蕉細(xì)菌性軟腐病為近年傳入我國(guó)的新病害，發(fā)展迅速，為害嚴(yán)重，篩選高效防治藥劑成為病害防治的當(dāng)務(wù)之急。國(guó)內(nèi)迄今僅蒲小明等［20］報(bào)道了病害防治藥劑的篩選，推薦使用水合霉素和菌毒清，但調(diào)查發(fā)現(xiàn)水合霉素不是常用藥劑，農(nóng)資店很難購(gòu)買(mǎi)，菌毒清可用于病株土壤消毒，大田防治效果較差。

本研究結(jié)果表明，抗生素類(lèi)藥劑（如硫酸鏈霉素、青霉素鉀和中生菌素）對(duì)病原菌的抑制能力較強(qiáng)，而廣譜殺菌劑王銅和噻菌銅對(duì)病原菌的抑制效果較差，蒲小明等的研究也證明了這一結(jié)果，但尤毅等認(rèn)為因藥劑作用方式不同，有的藥劑并非直接作用于病原細(xì)菌，在抑菌方面表現(xiàn)較差，但可能在大田有較好的防治效果［21］。為真實(shí)反映藥劑對(duì)病害的防治效果，本研究采用離體葉片法對(duì)供試藥劑進(jìn)行病害防治試驗(yàn)復(fù)篩，結(jié)果表明王銅、噻菌銅和硫酸鏈霉素對(duì)離體葉片病害的防治效果較好，有效成分為400 μg/mL時(shí)，防治效果均在95%以上；其次是春雷霉素·王銅，有效成分為400 μg/mL時(shí)，防治效果為85.88%。2016年，最后一個(gè)農(nóng)用硫酸鏈霉素登記證件到期，不再續(xù)展，意味著農(nóng)用硫酸鏈霉素不再用于植物細(xì)菌性病害防治，因此，本研究選擇王銅、噻菌銅和春雷霉素·王銅制劑進(jìn)行盆栽防治試驗(yàn)，結(jié)果表明30%王銅懸浮劑和20%噻菌銅懸浮劑對(duì)病害有較好防治效果，可用于田間香蕉軟腐病的防治。

在細(xì)菌病害防治中，銅制劑直接殺滅細(xì)菌的作用有限，主要起保護(hù)作用［22］，本研究也顯示王銅和噻菌銅對(duì)香蕉細(xì)菌性軟腐病菌的直接抑制活性較低，但離體葉片試驗(yàn)中卻能有效控制病害的發(fā)生發(fā)展。盆栽試驗(yàn)中，在先噴藥劑后接種和先接種后噴藥劑兩種處理下，王銅和噻菌銅對(duì)軟腐病害的防治效果均較好，其中在病害發(fā)生前淋施藥劑的防治效果尤為突出，因此建議在氣溫及濕度相對(duì)較高時(shí)，可淋施王銅或噻菌銅預(yù)防香蕉軟腐病發(fā)生。病害發(fā)生后，也可淋施兩種藥劑防治病害，減少損失。

4 結(jié)論

香蕉細(xì)菌性軟腐病為系統(tǒng)性病害，為害嚴(yán)重，防治困難。本試驗(yàn)篩選獲得30%王銅懸浮劑600倍液和20%噻菌銅懸浮劑500倍液，藥后12 d對(duì)香蕉細(xì)菌性軟腐病的防治效果分別達(dá)79.37%和80.15%，因此推薦王銅和噻菌銅作為香蕉細(xì)菌性軟腐病的防治藥劑,在氣溫及濕度較高時(shí)，按說(shuō)明書(shū)推薦使用濃度，可在香蕉根部淋施藥劑預(yù)防軟腐病的發(fā)生，病害發(fā)生后，也可淋施上述兩種藥劑防治病害。