王楊燕，汪自然，馬筱玲

(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院檢驗(yàn)科，合肥230001)

5-氨基酮戊酸合酶(5-aminolevulinate synthase 1,ALAS) 是血紅素生成過程中的一個(gè)重要的限速酶。在線粒體中，甘氨酸和琥珀酰輔酶A在ALAS作用下生成δ-氨基-γ-酮戊酸(δ-aminplevulinic acid,ALA)。ALAS包括ALAS1和ALAS2兩亞型。ALAS1(也稱為ALAS-N)在紅細(xì)胞和非紅細(xì)胞中廣泛表達(dá)，而ALAS2(也稱為ALAS-E)在紅細(xì)胞中呈特異性表達(dá)[1]。目前，ALAS1在肝癌發(fā)生發(fā)展中的具體作用仍不清楚。本研究通過癌癥基因圖譜 (The Cancer Genome Atlas，TCGA)公共數(shù)據(jù)庫分析ALAS1在肝癌中的表達(dá)及其臨床意義，以期為肝癌的靶向治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1數(shù)據(jù)資料收集 從TCGA數(shù)據(jù)庫(https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)中下載并預(yù)處理肝癌數(shù)據(jù)集中423例的mRNA表達(dá)RNASeqV2數(shù)據(jù)(數(shù)據(jù)時(shí)間為2006年1月1日至2017年12月31日，資料收集時(shí)間為2019年10月15日)。同時(shí)在TCGA數(shù)據(jù)庫中下載臨床資料數(shù)據(jù)和預(yù)后數(shù)據(jù)。

1.2數(shù)據(jù)整理和臨床病理特征相關(guān)性分析 篩選數(shù)據(jù)得到含有ALAS1mRNA表達(dá)量的正常肝組織樣本50例，肝癌組織樣本371例。對肝癌組織和正常肝組織的ALAS1表達(dá)量進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)并分析兩組間的表達(dá)差異。選取性別、年齡、T分期、N分期、M分期、AJCC分期作為肝癌臨床病理特征指標(biāo)，去除臨床病理特征缺失或者不完全的病例。根據(jù)ALAS1mRNA表達(dá)量的均值(12.39)進(jìn)行分組，以表達(dá)量高于均值的為高表達(dá)組(173例)，反之為低表達(dá)組(169例)。

1.3生存分析 選取數(shù)據(jù)集中包含預(yù)后隨訪數(shù)據(jù)的病例，使用KaPlan-Meier模型對ALAS1低表達(dá)組和高表達(dá)組之間的生存期差異進(jìn)行分析并進(jìn)行Log-rank檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4ALAS1相關(guān)基因篩選 登錄LinkedOmics數(shù)據(jù)庫(http://www.linkedomics.org/)首頁，選擇腫瘤類型為“肝癌”，靶點(diǎn)為“ALAS1”，數(shù)據(jù)集選擇TCGA數(shù)據(jù)集，分析與ALAS1表達(dá)呈正相關(guān)和負(fù)相關(guān)的基因。

1.5基因集富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA) 采用GSEA 4.0.1版軟件進(jìn)行分析。根據(jù)ALAS1mRNA的表達(dá)水平分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。進(jìn)一步利用GSEA網(wǎng)站MsigDB數(shù)據(jù)庫(http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb)中獲得c2.cp.kegg.v7.1.symbols.gmt數(shù)據(jù)集。采用缺省加權(quán)富集統(tǒng)計(jì)的方法進(jìn)行富集分析并設(shè)置隨機(jī)組合次數(shù)為1 000次。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，Graphpad Prism 7.0軟件繪圖。正態(tài)性檢驗(yàn)采用Kolmogorov-Smirnov法，兩組間數(shù)據(jù)比較使用非配對t檢驗(yàn)。ALAS1表達(dá)量與肝癌患者臨床病理特征的相關(guān)性分析使用χ2檢驗(yàn)及Fisher確切概率法，不同ALAS1表達(dá)量患者預(yù)后分析使用Kaplan-Meier和log-rank檢驗(yàn)法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在GSEA分析中以錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rates，F(xiàn)DR)<0.25的基因集作為顯著富集基因集。

2 結(jié)果

2.1肝癌組織與正常肝組織中ALAS1的表達(dá)差異 采用Kolmogorov-Smirnov法對肝癌組織和正常肝組織的ALAS1表達(dá)量進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，結(jié)果表明肝癌組織(P=0.05)和正常肝組織(P>0.10)中ALAS1mRNA表達(dá)量均符合正態(tài)分布。進(jìn)一步進(jìn)行非配對t檢驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝癌組織中ALAS1mRNA表達(dá)水平(12.39±1.20)顯著低于正常肝組織(13.93±0.72)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.87,P<0.01)。

2.2ALAS1表達(dá)與肝癌患者臨床病理特征相關(guān)性 篩選后共獲得具有完整臨床病理特征數(shù)據(jù)的肝癌病例342例，其中ALAS1低表達(dá)組169例，ALAS1高表達(dá)組173例。ALAS1的表達(dá)水平與性別(P<0.01)、T分期(P=0.01)以及AJCC分期(P=0.01)顯著相關(guān)，而與年齡、N分期和M分期無相關(guān)性。見表1。

表1 ALAS1表達(dá)水平與肝癌患者臨床病理特征相關(guān)性分析

2.3ALAS1表達(dá)肝癌患者預(yù)后相關(guān)性ALAS1表達(dá)水平與肝癌患者預(yù)后相關(guān)(Log-rankχ2=4.48，P=0.03)。此外，低表達(dá)ALAS1患者的中位生存期(1 372 d)顯著低于高表達(dá)患者(2 456 d)。見圖1。

圖1 ALAS1表達(dá)肝癌患者預(yù)后相關(guān)性

2.4ALAS1相關(guān)基因分析 使用LinkedOmics數(shù)據(jù)庫對ALAS1進(jìn)行相關(guān)分析，以P<0.01為界限，共檢索到2 433個(gè)正相關(guān)基因，6 109個(gè)負(fù)相關(guān)基因(圖2A)。肝癌中ALAS1的表達(dá)與POR(r=0.70)、SORD(r=0.68)、AQP9(r=0.67)基因呈顯著正相關(guān)，與PKM2(r=-0.65)、VEGFB(r=-0.60)、PLCB3(r=-0.60)基因呈顯著負(fù)相關(guān)，見圖2B、2C。

注：A，與ALAS1相關(guān)的基因分布散點(diǎn)圖；B，與ALAS1呈正相關(guān)基因(前50位)熱圖；C，與ALAS1呈負(fù)相關(guān)基因(前50位)熱圖。

圖2ALAS1相關(guān)基因分析

2.5ALAS1的功能富集分析 GESA富集分析結(jié)果表明，ALAS1低表達(dá)樣本顯著富集到細(xì)胞周期(FDR=0.03,P<0.01)、T細(xì)胞受體信號通路(FDR=0.06,P<0.01)、GnRH信號通路(FDR=0.06,P<0.01)以及趨化因子信號通路(FDR=0.154,P<0.01)等基因集。見圖3。

3 討論

雖然肝癌的診斷和治療技術(shù)有了持續(xù)進(jìn)展，但肝癌的發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明。因此，尋找新的靶點(diǎn)對于肝癌的診斷和治療有著重要的意義。TCGA組學(xué)數(shù)據(jù)庫具有樣本量大，數(shù)據(jù)信息豐富完整，隨訪時(shí)間長等優(yōu)點(diǎn)，得到的結(jié)論較為可靠，有利于充分認(rèn)識基因在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用[2-5]。通過生物醫(yī)學(xué)大數(shù)據(jù)分析，可以為進(jìn)一步研究基因在腫瘤的功能和調(diào)控機(jī)制提供依據(jù)。

ALAS1是血紅素合成過程中的一種重要的限速酶，目前的研究主要集中在ALAS1在血紅素合成中的調(diào)控作用。研究表明，在腫瘤細(xì)胞中，血紅素的合成能力明顯高于正常細(xì)胞[6]。在非紅細(xì)胞中，血紅素的生物合成受到嚴(yán)格的負(fù)反饋機(jī)制控制，過度的血紅素合成通過降低轉(zhuǎn)錄和翻譯、破壞mRNA的穩(wěn)定、抑制前體蛋白線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)等途徑抑制ALAS1的表達(dá)[7]。Chen等[8]報(bào)道青蒿琥酯和組蛋白去乙酰化酶抑制劑能夠促進(jìn)ALAS1的表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用。因此，探究ALAS1在肝癌中的作用和具體調(diào)控機(jī)制對于肝癌的靶向治療意義重大。

本研究首先下載TCGA數(shù)據(jù)庫中肝癌RNASeq數(shù)據(jù)集、病例臨床數(shù)據(jù)和預(yù)后數(shù)據(jù)。通過對肝癌組織和正常肝組織中ALAS1表達(dá)量比較分析發(fā)現(xiàn)，ALAS1在肝癌組織中明顯低表達(dá)，提示ALAS1可能是肝癌中的一個(gè)重要的抑癌基因。進(jìn)一步分析ALAS1與肝癌患者臨床特征的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ALAS1表達(dá)水平與性別、T分期以及AJCC分期顯著相關(guān)，而與年齡、N分期和M分期無相關(guān)性。同時(shí)，生存曲線分析表明，低表達(dá)ALAS1的肝癌患者明顯預(yù)后不良。以上結(jié)果表明ALAS1基因低表達(dá)可能是肝癌預(yù)后的一種不利因素。為了進(jìn)一步探索ALAS1在肝癌中可能的作用機(jī)制，我們通過LinkedOmics數(shù)據(jù)庫分析ALAS1密切相關(guān)的基因，結(jié)果顯示ALAS1與POR、SORD、AQP9基因呈顯著正相關(guān)，與PKM2、VEGFB、PLCB3基因呈顯著負(fù)相關(guān)，提示以上分子可能是ALAS1潛在的上、下游分子。GSEA分析首先運(yùn)用預(yù)定義的基因集，將基因按照在兩組樣本中的表達(dá)差異程度進(jìn)行排序，而后檢驗(yàn)預(yù)定義的基因集是否富集在排序表的頂端或者底部，是當(dāng)下研究基因表達(dá)差異富集信號通路的理想生物信息學(xué)方法。本研究利用GSEA方法預(yù)測ALAS1可能的調(diào)控信號通路，發(fā)現(xiàn)ALAS1低表達(dá)樣本顯著富集到細(xì)胞周期、T細(xì)胞受體信號通路、GnRH信號通路以及趨化因子信號通路等基因集，推測ALAS1低表達(dá)可能通過調(diào)控細(xì)胞周期、免疫調(diào)節(jié)以及趨化因子信號通路等促進(jìn)肝癌的進(jìn)展。

ALAS1在肝癌中的作用及機(jī)制目前仍不清楚，本研究主要通過TCGA數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)分析ALAS1在肝癌中的表達(dá)及臨床意義，證實(shí)ALAS1基因可能為肝癌臨床預(yù)后評估的指標(biāo)以及靶向治療的新靶點(diǎn)，并且初步探討ALAS1在肝癌中的可能分子機(jī)制與信號通路。但本研究也存在一些不足，比如TCGA數(shù)據(jù)庫中為RNASeq數(shù)據(jù)，可能無法完全代表ALAS1蛋白的表達(dá)水平，以及研究數(shù)據(jù)部分分組樣本量較少，可能造成統(tǒng)計(jì)學(xué)偏差。后期我們將圍繞ALAS1進(jìn)一步研究驗(yàn)證其分子機(jī)制與信號通路，為肝癌的靶向治療提供新的思路。