闞麗娟，陳大洋，莫紅梅，張秀明

(深圳市羅湖醫(yī)院集團(tuán)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室&深圳大學(xué)第三附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，深圳518001)

國(guó)際病毒分類委員會(huì)將新型冠狀病毒命名為急性呼吸綜合征冠狀病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)。由SARS-CoV-2導(dǎo)致的新型冠狀病毒肺炎被世界衛(wèi)生組織(WHO)正式命名為COVID-19(coronavirus disease 19)。國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第7版)》中將核酸檢測(cè)列為確診指標(biāo)之一[1]。臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，某些疑似患者CT影像檢查結(jié)果具有病毒性肺炎特征，但SARS-CoV-2 RNA檢測(cè)多次甚至始終未檢出，使臨床對(duì)核酸檢測(cè)的質(zhì)量和意義提出質(zhì)疑。本文結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室在核酸檢測(cè)過(guò)程中遇到的一些實(shí)際問(wèn)題，對(duì)影響核酸檢測(cè)的因素進(jìn)行探討和分析，并提出改善核酸檢測(cè)質(zhì)量的具體措施。

1 標(biāo)本采集

研究證實(shí)，呼吸道標(biāo)本SARS-CoV-2 RNA檢出率由高到低為：肺組織>支氣管肺泡灌洗液>抽吸痰或鼻咽吸取物>鼻咽拭子或口咽拭子>鼻拭子[2]。最新的報(bào)告指出，血液[3]、唾液[4-5]、糞便、尿液中均可檢出病毒核酸，甚至有較高的檢出率，但缺乏大樣本多中心的臨床驗(yàn)證。雖然COVID-19患者下呼吸道具有更高的病毒載量，病毒檢出率也更高，但該類樣本獲取困難，且傳播風(fēng)險(xiǎn)高，除重癥患者外臨床難以常規(guī)實(shí)施。因此，目前口咽拭子和鼻咽拭子仍是常用的樣本類型，但這類樣本的病毒核酸檢出率與拭子材質(zhì)、采集方法、樣本采集量和采樣時(shí)機(jī)等因素密切相關(guān)。

采樣時(shí)，應(yīng)選擇質(zhì)量好的無(wú)菌植絨拭子[6]。這類拭子易采集到更多的口咽和鼻咽分泌物，且置于樣本保存液中細(xì)胞更易于洗脫，能最大程度地增加樣本的采集釋放量；而普通棉拭子與細(xì)胞的吸附力較強(qiáng)，難以洗脫，易造成部分細(xì)胞的丟失，降低采集釋放量，因此不建議使用。

鼻咽拭子的采集及保存方法應(yīng)規(guī)范[6]。此外，鼻咽拭子病毒核酸檢出率與機(jī)體病毒感染進(jìn)程密切相關(guān)，而目前SARS-CoV-2的自身特點(diǎn)和病程轉(zhuǎn)歸尚未完全闡明，采樣的最佳時(shí)機(jī)無(wú)法確定，即便按照目前已發(fā)布的標(biāo)準(zhǔn)采樣流程實(shí)施，也不能確保樣本采集自病毒載量最高的時(shí)期，因此建議在疾病病程中多次、多部位取樣，以提高檢出率。

2 病毒滅活和核酸提取

2.1病毒滅活 標(biāo)本滅活處理是生物安全防護(hù)的重要措施。根據(jù)現(xiàn)行的COVID-19診療指南，SARS-CoV-2經(jīng)56 ℃ 30 min或75%乙醇處理等會(huì)被滅活[1]。雖然目前實(shí)驗(yàn)室在檢測(cè)標(biāo)本前均會(huì)對(duì)標(biāo)本實(shí)施滅活處理，但不能明確標(biāo)本的滅活處理是否會(huì)對(duì)后續(xù)的檢測(cè)結(jié)果造成影響。陳培松等[7]對(duì)比滅活處理前后樣本的RT-PCR結(jié)果，發(fā)現(xiàn)56 ℃ 30 min或75%乙醇滅活處理對(duì)核酸檢測(cè)無(wú)明顯的影響。但段秀枝等[8]采用不滅活處理和56 ℃ 30 min水浴、56 ℃ 60 min干浴及60 ℃ 30 min干浴3種滅活處理方式對(duì)鼻咽拭子標(biāo)本進(jìn)行病毒滅活，然后用商品化SARS-CoV-2 RNA實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試劑進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明病毒滅活處理會(huì)使核酸降解，導(dǎo)致檢測(cè)循環(huán)閾值(Ct值)降低，低濃度樣本出現(xiàn)假陰性結(jié)果。病毒滅活處理是否影響核酸檢測(cè)結(jié)果，還需要不同類型病毒保存液的比對(duì)實(shí)驗(yàn)研究予以證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)室在初期未進(jìn)行病毒滅活處理，出于安全考慮，后改用滅活處理后再提取核酸，未觀察到滅活處理對(duì)檢測(cè)結(jié)果有明顯影響。

2.2核酸提取 目前SARS-CoV-2 RNA提取方法主要有直接裂解法、柱提法和磁珠法，其中以磁珠法最為常用；為保證人員安全、核酸提取純度和效率，建議采用基于磁珠吸附的半自動(dòng)或全自動(dòng)核酸提取方法。提取量的大小與初始病毒載量呈正相關(guān)，提取量越大，擴(kuò)增前病毒載量越大，假陰性率越低。適當(dāng)增加PCR體系中的核酸洗脫液加入量及擴(kuò)增反應(yīng)體積也可以增加初始病毒載量，提高檢測(cè)敏感性[2]，各實(shí)驗(yàn)室可開(kāi)展一定量的比對(duì)試驗(yàn)作為選擇依據(jù)。

3 試劑盒的選擇與性能驗(yàn)證

COVID-19暴發(fā)突然，各廠家開(kāi)發(fā)的核酸檢測(cè)試劑缺乏足夠的臨床樣本進(jìn)行完整的性能確認(rèn)，而臨床需求又迫在眉睫，因此，匆忙上陣的試劑盒質(zhì)量可能參差不齊，其穩(wěn)定性和可靠性有待進(jìn)一步確認(rèn)[9]。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)上市的5種核酸檢測(cè)試劑盒和未上市的2種試劑盒(7種試劑盒的性能特征見(jiàn)表1)的檢測(cè)結(jié)果一致性和檢出能力進(jìn)行了評(píng)估，選用本實(shí)驗(yàn)室初篩陽(yáng)性且經(jīng)深圳市羅湖區(qū)疾病預(yù)防控制中心復(fù)核確認(rèn)為陽(yáng)性的10例標(biāo)本，用7種試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果6種試劑的陽(yáng)性檢出率為100%，僅試劑盒D的陽(yáng)性檢出率為80%；另選一陽(yáng)性樣本核酸(B試劑檢測(cè)ORF1ab基因Ct值為34.83、N基因Ct值為32.91)進(jìn)行連續(xù)4倍稀釋，得到共5個(gè)濃度梯度，使用7種試劑盒對(duì)每個(gè)梯度重復(fù)檢測(cè)5次，計(jì)算各檢測(cè)靶標(biāo)陽(yáng)性檢出率，結(jié)果7種試劑對(duì)64倍稀釋和256倍稀釋樣本的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，對(duì)原始濃度樣本的檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，但對(duì)弱陽(yáng)性樣本(4倍稀釋和16倍稀釋樣本)的檢出能力存在差異。建議弱陽(yáng)性樣本應(yīng)至少用2個(gè)廠家的試劑復(fù)核檢驗(yàn)，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

表1 7種國(guó)產(chǎn)SARS-CoV-2核酸檢測(cè)試劑的主要特征

注：*，廠商未聲明內(nèi)標(biāo)具體成分。

4 試劑盒的批間差對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

為提升產(chǎn)品質(zhì)量，各試劑生產(chǎn)廠商不斷優(yōu)化檢測(cè)試劑盒組分，包括內(nèi)參、陽(yáng)性對(duì)照的選擇和擴(kuò)增反應(yīng)體系的優(yōu)化等，可能造成不同批號(hào)試劑間存在差異。本實(shí)驗(yàn)室在核酸檢測(cè)過(guò)程中發(fā)生了兩起不良事件，都與更換試劑批號(hào)有關(guān)。

4.1內(nèi)標(biāo)改變 實(shí)驗(yàn)室使用A品牌試劑進(jìn)行核酸擴(kuò)增時(shí)，同一批樣本用舊批號(hào)試劑檢測(cè)，內(nèi)標(biāo)檢測(cè)通道(CY5)呈典型S型擴(kuò)增曲線，陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增曲線(圖1A)；更換新批號(hào)后，除陽(yáng)性對(duì)照外，其余樣本均無(wú)內(nèi)標(biāo)檢測(cè)通道(CY5)的擴(kuò)增曲線(圖1B)。出現(xiàn)新批號(hào)試劑整批樣本無(wú)內(nèi)標(biāo)曲線的情況后，本實(shí)驗(yàn)室除采用舊批號(hào)試劑比對(duì)外，還將該批樣本的提取核酸用另一品牌試劑檢測(cè)，排除了樣本采樣不合格和核酸提取失敗的原因。聯(lián)系廠商技術(shù)工程師和研發(fā)人員分析原因，發(fā)現(xiàn)該新批號(hào)試劑為廠商在不斷優(yōu)化產(chǎn)品的過(guò)程中生產(chǎn)的測(cè)試批次。該批號(hào)的試劑改變了內(nèi)標(biāo)及其引物序列片段，內(nèi)標(biāo)不再是“臨床樣本中上皮細(xì)胞固有的人源RNA基因片段”而是“外加RNA片段”，故按原說(shuō)明書(shū)操作后內(nèi)標(biāo)檢測(cè)通道(CY5)無(wú)擴(kuò)增曲線。同時(shí)廠商改變了與之配套的陽(yáng)性對(duì)照中的內(nèi)標(biāo)序列，使其在擴(kuò)增過(guò)程中能夠最大化地與內(nèi)標(biāo)引物結(jié)合。因此，陽(yáng)性對(duì)照的擴(kuò)增結(jié)果顯示內(nèi)標(biāo)檢測(cè)通道(CY5)的擴(kuò)增曲線正常。新批次試劑尚處于試驗(yàn)調(diào)試階段，廠商誤將其當(dāng)成品發(fā)出，造成此批試劑的實(shí)驗(yàn)室質(zhì)檢未通過(guò)。

注：a，樣本和陽(yáng)性對(duì)照；b，陰性對(duì)照；c，陽(yáng)性對(duì)照；d，樣本和陰性對(duì)照。

4.2假陽(yáng)性反應(yīng)曲線 本實(shí)驗(yàn)室在核酸檢測(cè)初期使用B品牌試劑，該試劑檢測(cè)靶標(biāo)為ORF1ab基因和N基因，經(jīng)性能驗(yàn)證和臨床測(cè)試滿足預(yù)期用途。更換試劑批號(hào)時(shí)，同一天進(jìn)行了4批次共204例樣本的檢測(cè)，ORF1ab基因出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)曲線的有42例，N基因出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)曲線的有68例，ORF1ab基因和N基因檢測(cè)通道同時(shí)出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)曲線的有24例，見(jiàn)圖2。4批次的12個(gè)陰性對(duì)照(試劑盒自帶)中，1個(gè)出現(xiàn)ORF1ab基因陽(yáng)性反應(yīng)，3個(gè)出現(xiàn)N基因陽(yáng)性反應(yīng)。連續(xù)實(shí)驗(yàn)批次出現(xiàn)陽(yáng)性率異常增高，實(shí)驗(yàn)室最初考慮為實(shí)驗(yàn)室內(nèi)污染，隨即停止操作，采取一系列措施查找污染源。

注：a，陽(yáng)性對(duì)照；b，樣本。

圖2 B品牌試劑成批出現(xiàn)假陽(yáng)性曲線

我們用無(wú)RNase水放置在樣本處理間不同區(qū)域和生物安全柜內(nèi)暴露2 h，上機(jī)擴(kuò)增無(wú)反應(yīng)曲線，由此可基本排除實(shí)驗(yàn)室內(nèi)環(huán)境污染。同時(shí)，我們將實(shí)驗(yàn)中陽(yáng)性反應(yīng)曲線的樣本核酸，分別采取用舊批號(hào)試劑、另一品牌試劑、原樣本送疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室3種方式再次檢測(cè)，并與原實(shí)驗(yàn)結(jié)果比對(duì)。結(jié)果顯示，樣本均為陰性。表明新批號(hào)試劑檢測(cè)的204例樣本中，ORF1ab基因假陽(yáng)性率達(dá)20%，N基因假陽(yáng)性率達(dá)33%。經(jīng)與廠商技術(shù)工程師交流，發(fā)現(xiàn)廠商在更換批號(hào)時(shí)“優(yōu)化了試劑性能，尤其提高了N基因的反應(yīng)靈敏度”，這和N基因假陽(yáng)性率高于ORF1ab基因假陽(yáng)性率相符合，且該新批號(hào)試劑在其他檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室也出現(xiàn)了同樣的假陽(yáng)性情況。所以，嚴(yán)格的試劑質(zhì)檢和批間比對(duì)不容忽視。

5 質(zhì)量控制

5.1質(zhì)控品的選擇與使用 實(shí)驗(yàn)室最初可選擇試劑盒中的陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品進(jìn)行質(zhì)量控制。每批檢測(cè)至少1個(gè)陽(yáng)性質(zhì)控品、3個(gè)陰性質(zhì)控品，陰性質(zhì)控品應(yīng)隨機(jī)放置。后期在條件允許的情況下，實(shí)驗(yàn)室可將陽(yáng)性標(biāo)本滅活后用陰性樣本稀釋制成弱陽(yáng)性質(zhì)控品使用，以監(jiān)控提取過(guò)程和擴(kuò)增過(guò)程的有效性。

5.2實(shí)驗(yàn)室內(nèi)污染控制 前述非特異性擴(kuò)增的案例雖然最終證實(shí)不是室內(nèi)污染，但防污染至關(guān)重要。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)按照《新型冠狀病毒核酸檢測(cè)專家共識(shí)》和《2019新型冠狀病毒肺炎臨床實(shí)驗(yàn)室生物安全防護(hù)專家共識(shí)》操作和安全防護(hù)，防止實(shí)驗(yàn)室內(nèi)污染和假陽(yáng)性結(jié)果。建議每天實(shí)驗(yàn)結(jié)束后配制3～5份無(wú)菌無(wú)RNase水分別放置于標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)和生物安全柜內(nèi)，暴露1 h以上，和樣本一起上機(jī)擴(kuò)增，用于實(shí)驗(yàn)室污染的監(jiān)控。

5.3室間質(zhì)量評(píng)價(jià)(external quality assessment,EQA) 最近，衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心計(jì)劃采用自研的無(wú)生物傳染危險(xiǎn)性的噬菌體病毒樣顆粒樣本開(kāi)展SARS-CoV-2核酸檢測(cè)EQA，在評(píng)價(jià)各實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果可比性或準(zhǔn)確性的同時(shí)，還將有助于評(píng)價(jià)各實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)特異性和分析敏感性。

6 總結(jié)

影響SARS-CoV-2核酸檢出率的因素涉及分析前、中、后的各個(gè)環(huán)節(jié)，需做好每一環(huán)節(jié)的質(zhì)量把控。首先廠商應(yīng)通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)體系、提高引物特異性、完善質(zhì)控試劑等開(kāi)發(fā)出更可靠的檢測(cè)方法；其次實(shí)驗(yàn)室應(yīng)規(guī)范操作、充分驗(yàn)證其有效性，嚴(yán)格室內(nèi)質(zhì)量控制，積極參加EQA，以避免或減少假陰性；此外，臨床和實(shí)驗(yàn)室應(yīng)密切配合，對(duì)標(biāo)本采集、保存與運(yùn)輸?shù)确治銮耙蛩剡M(jìn)行嚴(yán)格質(zhì)量控制。