耿逸云，謝晉燁，王偉佳

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)珠海校區(qū)，廣東珠海 519000；2.中山市人民醫(yī)院檢驗科，廣東中山 528400)

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，甾醇類新藥(代號：NSC67657)可通過β連環(huán)蛋白相關(guān)蛋白1(ICAT)與β連環(huán)蛋白(β-catenin)的結(jié)合，從而抑制人早幼粒細(xì)胞系HL-60的細(xì)胞增殖，并促進(jìn)其向單核細(xì)胞分化[1]。1,25-二羥基維生素D3 [1,25-(OH)2-hydroxyvitamin D3，1,25-(OH)2D3]是一種脂溶性維生素，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，1,25-(OH)2D3可以抵抗腫瘤增殖，并誘導(dǎo)白血病、乳腺癌和結(jié)腸癌等細(xì)胞分化[2-4]。但1,25-(OH)2D3是否通過ICAT/β-catenin及其下游轉(zhuǎn)錄因子T細(xì)胞因子1(T-cell factor 1，TCF1)發(fā)揮誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞單核系分化的作用目前尚不明確。本研究旨在探討β-catenin信號通路在1,25-(OH)2D3誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞單核系分化中的作用，以期明確介導(dǎo)HL-60細(xì)胞單核系分化的關(guān)鍵分子。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞系、主要試劑及儀器 人髓系白血病細(xì)胞系HL-60購自上海細(xì)胞庫生命科學(xué)研究所；1,25-(OH)2D3(美國Sigma公司)；細(xì)胞培養(yǎng)基IM-DM、胎牛血清(美國Gibco公司)；細(xì)胞周期試劑盒(美國BD公司)；兔抗人c-Myc、cyclin D1、p-pRB、p-β-catenin抗體、兔抗人pRB、TCF1、β-catenin抗體及辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(美國CST公司)；兔抗人ICAT抗體(美國Abcam公司)；CD14-FITC流式抗體及對照抗體(美國BD公司)；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚DAPI核熒光染料、異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的驢抗兔二抗(美國Thermo Fisher公司)；細(xì)胞蛋白抽提純化試劑盒(上海生工公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天公司)。BX-63正置顯微鏡(日本Olympus公司)；二氧化碳恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；L500-A臺式低速離心機(jī)(湖南湘儀實驗室儀器公司);CytoFLEX S流式細(xì)胞儀(美國Beckman Coulter公司);ChemicDoc Touch化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司);Sunrise酶聯(lián)儀(奧地利Tecan公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) HL-60細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基(含100 U/mL青霉素與100 μg/mL鏈霉素)中，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天傳代1次。取對數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5×104/mL，以每孔2 mL的體積將HL-60接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，分別以加入2 μL和20 μL 1,25-(OH)2D3儲存液(100 μmol/L)作為0.1 μmol/L和1 μmol/L 1,25-(OH)2D3實驗組，以加入2 μL的95%乙醇作為對照組。每組設(shè)3個復(fù)孔。

1.3最適藥物濃度及作用時間篩選

1.3.1最適藥物濃度的篩選 分別收集0.1 μmol/L和1 μmol/L 1,25-(OH)2D3實驗組及對照組培養(yǎng)72 h的細(xì)胞，150×g離心5 min，PBS洗滌3次，使用含1%胎牛血清的PBS重懸，配置成1×106/mL細(xì)胞懸液。分別取500 μL單細(xì)胞懸液，加入5 μL CD14-FITC(1∶100稀釋)流式抗體，室溫避光溫育40 min，使用CytoFlex S流式細(xì)胞儀于488 nm通道檢測1×104個細(xì)胞。采用FlowJo 7.6軟件進(jìn)行分析，以CD14陽性的細(xì)胞比例作為1,25-(OH)2D3誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化效率的檢測指標(biāo)。公式：CD14+(%)=CD14陽性細(xì)胞數(shù)/10 000×100%，以檢測1,25-(OH)2D3誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞單核系分化的最適濃度。

1.3.2作用時間的篩選 分別使用0.1 μmol/L 1,25-(OH)2D3處理HL-60細(xì)胞24、48、72和96 h，收集細(xì)胞，重懸為1×106/mL細(xì)胞懸液，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD14陽性細(xì)胞比例，以確定1,25-(OH)2D3誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞單核系分化的最佳作用時間。

1.4流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞周期 收集0.1 μmol/L 1,25-(OH)2D3實驗組和對照組處理72 h后的細(xì)胞，重懸為1×106/mL的單細(xì)胞懸液，PBS洗滌3次，250 μL PBS重懸細(xì)胞，將細(xì)胞逐滴加入-20 ℃預(yù)冷的75%乙醇(750 μL)中，置于-20 ℃固定過夜。150×g離心10 min，棄上清，按照細(xì)胞周期檢測試劑盒說明書操作，加入50 μL PI/RNase染液重懸細(xì)胞，避光溫育15 min，2 h內(nèi)經(jīng)CytoFlex S流式細(xì)胞儀檢測，激發(fā)波長561 nm。使用FlowJo7.6軟件進(jìn)行作圖分析。公式：G0/G1期細(xì)胞比例=G0/G1期細(xì)胞數(shù)/10 000×100%，M期細(xì)胞比例=M期細(xì)胞數(shù)/10 000×100%，S期細(xì)胞比例=S期細(xì)胞數(shù)/10 000×100%。

1.5CCK-8試驗檢測細(xì)胞活力 分別取0.1 μmol/L 1,25-(OH)2D3實驗組和對照組細(xì)胞，重懸為5×104/mL的單細(xì)胞懸液，以每孔200 μL的體積接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每組設(shè)5個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，加入20 μL CCK-8溶液，37 ℃溫育1 h，使用Sunrise酶聯(lián)儀于450 nm波長檢測吸光度(A450 nm)值，并計算細(xì)胞活力。細(xì)胞活力(%)=(實驗組A值-對照組A值)/對照組A值×100%。

1.6瑞氏染色檢測單核細(xì)胞 收集0.1 μmol/L 1,25-(OH)2D3處理72 h后的HL-60細(xì)胞，重懸為1×106/mL的單細(xì)胞懸液，取10 μL均勻進(jìn)行細(xì)胞涂片，采用瑞氏染色法染色玻片，靜置10 min，流水沖洗，干燥后在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。公式：單核細(xì)胞比例(%)=單核細(xì)胞數(shù)/100×100%。

1.7western blot檢測 收集0.1 μmol/L 1,25-(OH)2D3實驗組和對照組處理72 h后的HL-60細(xì)胞，重懸為1×106/mL的單細(xì)胞懸液，PBS洗滌3次，150×g離心5 min，沉淀加入200 μL RIPA細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，按照細(xì)胞蛋白抽提純化試劑盒收集核蛋白，使用BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒檢測蛋白質(zhì)濃度。取60 μg蛋白質(zhì)進(jìn)行10% SDS-PAGE凝膠電泳，將凝膠上的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移(300 mA恒流180 min)至PVDF膜上，用70 g/L脫脂牛奶封閉90 min，加入兔抗人c-Myc、cyclin D1、p-pRB、p-β-catenin抗體，兔抗人pRB、TCF1、β-catenin、ICAT抗體(均為1∶1 000稀釋)4 ℃振搖過夜。PBS洗膜3次，每次10 min，后加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(1∶3 000稀釋)4 ℃溫育4 h。采用化學(xué)發(fā)光法顯色，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行密度分析。公式：校準(zhǔn)灰度值比值=(1,25-(OH)2D3組灰度值/1,25-(OH)2D3組β-actin灰度值)/(對照組灰度值/對照組β-actin灰度值)。

1.8免疫熒光檢測β-catenin蛋白的表達(dá)與定位 分別收集0.1 μmol/L 1,25-(OH)2D3實驗組和對照組處理72 h后的HL-60細(xì)胞，重懸為1×106/mL的單細(xì)胞懸液，4%多聚甲醛固定15 min，15%小牛血清封閉，PBS洗滌3次后，加入兔抗人β-catenin抗體(1∶200稀釋)4 ℃振蕩溫育過夜。再次洗滌后，加入FITC標(biāo)記的驢抗兔二抗(1∶200稀釋)37 ℃(避光)溫育1 h，加入DAPI染料(5 mg/mL，1∶10 000稀釋)復(fù)染15 min，PBS洗滌3次，晾干后加抗淬滅劑后蓋玻片封片。在激光共聚焦顯微鏡鏡下觀察β-catenin(綠色標(biāo)記)的熒光強(qiáng)度并拍照。公式：校準(zhǔn)熒光值強(qiáng)度比值=(1,25-(OH)2D3組熒光值/1,25-(OH)2D3組area值)/(對照組熒光值/對照組area值)。

2 結(jié)果

2.1最適藥物濃度和誘導(dǎo)時間的確定 流式細(xì)胞技術(shù)檢測結(jié)果表明，0.1 μmol/L 1,25-(OH)2D3誘導(dǎo)72 h時CD14+%最高，為最適藥物濃度，見表1。使用0.1 μmol/L 1,25-(OH)2D3作用細(xì)胞72 h時的細(xì)胞分化效率最高，為最適誘導(dǎo)時間，見表2。

表1 不同濃度1,25-(OH)2D3誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞單核系CD14+(%)值的比較

濃度(μmol/L)均值標(biāo)準(zhǔn)差tP01.631.020.196.933.8433.990.00091.094.701.0599.150.0001

表2 不同時間0.1 μmol/L 1,25-(OH)2D3誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞單核系CD14+(%)值分化的比較

時間(h)均值標(biāo)準(zhǔn)差tP01.601.06247.573.362.400.1384854.7310.957.830.0167292.137.3318.830.0039688.836.6020.130.003

2.21,25-(OH)2D3抑制HL-60細(xì)胞增殖及細(xì)胞活力結(jié)果 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，1,25-(OH)2D3作用HL-60細(xì)胞后，G0/G1期細(xì)胞數(shù)比例較對照組明顯升高[(65.2±5.3)% vs(49.4±2.2)%]，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.769，P=0.009)。CCK-8試驗結(jié)果顯示，實驗組細(xì)胞增殖抑制率較對照組顯著升高[(51.4±10.5)% vs(5.36±12.7)%]，兩組間差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.84，P=0.008)。

2.31,25-(OH)2D3誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞單核系分化結(jié)果 瑞氏染色結(jié)果表明，與對照組 [成熟單核細(xì)胞比例(0.8±0.2)%]相比，0.1 μmol/L 1,25-(OH)2D3處理72 h后，成熟單核細(xì)胞比例為(61.2±13.6)%，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.49，P=0.001)。

2.41,25-(OH)2D3下調(diào)c-Myc、cyclin D1蛋白的表達(dá)水平 western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，1,25-(OH)2D3下調(diào)HL-60細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白c-Myc(t=54.64，P=0.001 9)和cyclin D1的表達(dá)水平(t=29.24，P=0.001 2)，并降低p-pRB/pRB比值(t=150.6，P<0.001)，見圖1。

圖1 細(xì)胞分化前后HL-60細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)

2.51,25-(OH)2D3下調(diào)核內(nèi)β-catenin蛋白的表達(dá)水平 與對照組相比，1,25-(OH)2D3作用HL-60細(xì)胞后，其ICAT蛋白表達(dá)上調(diào)(t=9.917，P=0.01)，TCF1蛋白表達(dá)下調(diào)(t=54.54，P=0.0003)；細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白的表達(dá)水平無明顯變化(P>0.99)，但其在核內(nèi)表達(dá)下降(t=9.77，P=0.01)；p-β-catenin/β-catenin表達(dá)水平無明顯變化(t=2.511，P=0.129)，見圖2。

圖2 β-catenin相關(guān)蛋白的差異表達(dá)

2.61,25-(OH)2D3抑制β-catenin入核 1,25-(OH)2D3作用HL-60細(xì)胞后，β-catenin(綠色標(biāo)記)熒光強(qiáng)度減弱(t=16.15，P=0.003 8)。見圖3。

圖3 激光共聚焦顯微鏡下觀察β-catenin的表達(dá)和定位

3 討論

1,25-(OH)2D3是一種可以誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞單核系分化的高效誘導(dǎo)劑[5]，常被用于患者完全緩解后維持治療的唯一藥物，可有效延長高危AML患者生存期、降低復(fù)發(fā)率[6]。1,25-(OH)2D3誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞單核系分化的機(jī)制目前已有多項報道，如其可以直接與維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)結(jié)合[7]，或通過上調(diào)CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(C/EBP) β的表達(dá)使HL-60細(xì)胞單核系分化[2]。但Wnt/β-catenin信號通路是否參與調(diào)控1,25-(OH)2D3誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞單核系分化的過程目前尚未見報道。Wnt/β-catenin信號通路是本課題組前期研究時采用比較蛋白組學(xué)技術(shù)在甾醇類新藥NSC67657誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞單核系分化中篩選獲得[8]，故而本研究擬對其在1,25-(OH)2D3誘導(dǎo)細(xì)胞單核系分化中進(jìn)行驗證。

本研究采用流式細(xì)胞技術(shù)及細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)檢測并分析細(xì)胞的分化方向，結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.1 μmol/L的1,25-(OH)2D3作用后的HL-60細(xì)胞后，其CD14陽性率升高，單核細(xì)胞比例升高(P<0.01)，提示1,25-(OH)2D3能夠誘導(dǎo)其向單核系分化。進(jìn)一步通過細(xì)胞增殖試驗及weatern blot檢測后發(fā)現(xiàn)，0.1 μmol/L 1,25-(OH)2D3實驗組細(xì)胞增殖抑制率較對照組顯著升高(P<0.01)，且細(xì)胞增殖相關(guān)c-Myc，cyclin D1，TCF1蛋白的表達(dá)水平和pRB蛋白的磷酸化水平顯著下降。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白ICAT表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞核內(nèi)β-catenin蛋白表達(dá)減少，但是細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白及β-catenin蛋白的磷酸化水平未見明顯變化，提示W(wǎng)nt/β-catenin信號通路參與了1,25-(OH)2D3誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞單核系分化的進(jìn)程，與本課題組前期研究結(jié)論較為一致[1]。

Wnt/β-catenin信號通路的異常激活是腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制之一，β-catenin的過表達(dá)是此通路激活的主要表現(xiàn)[9-11]。研究表明，磷脂酶D1(PLD1)抑制劑作用于結(jié)腸癌細(xì)胞，上調(diào)ICAT蛋白表達(dá)，下調(diào)β-catenin/TCF4蛋白表達(dá)，抑制c-Myc蛋白的表達(dá)[12]。另有學(xué)者證實，白藜蘆醇可使胃癌細(xì)胞中β-catenin/TCF4蛋白表達(dá)下調(diào)，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖與侵襲[13]。而敲除TCF1能抑制白血病細(xì)胞在裸鼠中的存活和擴(kuò)增[14-15]。以上研究提示，Wnt/β-catenin信號通路可能是腫瘤治療，尤其是白血病化療的新靶點。

目前臨床用于AML治療有效的靶向藥物較少，且缺乏早期診斷、化療耐藥監(jiān)測的標(biāo)志物。本研究證實1,25-(OH)2D3通過抑制Wnt/β-catenin信號通路，抑制HL-60細(xì)胞增殖并促進(jìn)其單核系分化，為AML的誘導(dǎo)分化和精準(zhǔn)治療提供了思路，但1,25-(OH)2D3是否通過ICAT抑制Wnt/β-catenin信號通路目前尚未確認(rèn)，其在早期診斷和化療耐藥中的地位仍需進(jìn)一步探討，也是我們今后工作的研究重點。