文潔，韓書山，陳志，楊夢(mèng)婷，邵澤偉，王思偉，山鳳蓮

(1.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院 a.臨床醫(yī)學(xué)院，b.法醫(yī)學(xué)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，山東濟(jì)寧 272013；2.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室，江蘇鎮(zhèn)江 212000；3.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)一科，山東濟(jì)寧 272029)

性別決定區(qū)域Y盒(SOX9)是SOX基因家族中的一員，在譜系限制、終末分化和干細(xì)胞特性維持中作為干細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用，同時(shí)其對(duì)于維持各類腫瘤干細(xì)胞的增殖、自我更新和致瘤性亦具有重要的作用。研究表明，SOX9在胃癌進(jìn)展過程中發(fā)揮重要的作用，并可影響患者生存率，因此，SOX9有望成為胃癌早期診斷和預(yù)后評(píng)估的標(biāo)志物[1-2]。本研究擬通過檢測(cè)SOX9基因在胃癌組織中的表達(dá)變化，分析其生物學(xué)功能，并探討其在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中的可能作用機(jī)制及臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象 收集2018年11月至2019年6月于濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院就診的胃癌患者27例。其中男15例，女12例，年齡39～75歲，中位年齡56歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)影像學(xué)檢查、組織學(xué)檢查(腹腔鏡、手術(shù)等切取組織經(jīng)病理學(xué)確診)診斷為胃癌的患者。(2)所有納入患者術(shù)前均未接受化療及放療等，且所有病例均未患其他腫瘤或風(fēng)濕性疾病、甲狀腺功能亢進(jìn)等免疫相關(guān)性疾病及治療史，在本次研究前3個(gè)月內(nèi)未使用激素類或免疫抑制類藥物[3]。

1.2細(xì)胞系、主要試劑及儀器 人胃癌細(xì)胞系HGC-27細(xì)胞系購自中科院上海細(xì)胞庫；胎牛血清(上海依科塞公司)；DMEM/high 完全培養(yǎng)基(美國Corning公司)；Trizol試劑(美國Invitrogen 公司)；慢病毒LV3NC(序列5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′)、LV3-homo SOX9-1(序列5′-GCATCCTTCAATTTCTGTATA-3′)、LV3-homo SOX9-2(序列5′-ACTTCTGAACGAGAGCGAGAA-3′)購自上海漢恒科技公司；PrimeScript RT Master Mix 試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒(大連TaKaRa公司)；兔(鼠)抗人SOX9、SOX2、Oct-4、Nanog、E-cadherin和GAPDH抗體(美國CST公司)；HRP標(biāo)記的羊抗兔(鼠)IgG二抗(美國Abcam公司)。CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(美國Gene公司)；NanoDrop One分光光度計(jì)(美國Thermo公司)；CFX96熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)及組織采集 取生長狀態(tài)良好的HGC-27細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM/high完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)溫育。組織標(biāo)本留取自胃癌患者術(shù)中切取的癌組織和距離癌組織5 cm以上的癌旁組織(經(jīng)病理組織學(xué)檢查無癌變)。所有標(biāo)本在離體30 min內(nèi)分裝于不同凍存管中，置于液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR) 取患者癌組織和癌旁組織各50～100 mg，經(jīng)2.5 g/L胰蛋白酶消化并收集HGC-27細(xì)胞，采用異硫氰酸胍-酚氯仿法，按Trizol試劑說明書提取組織及細(xì)胞的總RNA。利用NanoDrop One分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度和純度，取吸光度(A260/280 nm) 值在1.8～2.0間的樣本，置于-80 ℃保存以用于后續(xù)試驗(yàn)。按照PrimeScript RT Master Mix 試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，樣本置于-20 ℃?zhèn)溆?。目的基因及?nèi)參引物序列見表1，由廣州市銳博生物公司使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)并合成引物。以cDNA為模板，按照SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒及CFX96熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行PCR反應(yīng)?？偡磻?yīng)體系為20 μL，包括2×SYBR Green Ⅰ Master Mix (ROX) 10 μL，上、下游引物(5 mmol/L)各0.5 μL，cDNA 樣本1 μL，RNase-free ddH2O 8 μL。循環(huán)參數(shù):95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)，84 ℃時(shí)采集熒光信號(hào)。以β-actin為內(nèi)參照，結(jié)果用2-ΔΔCt法計(jì)算。計(jì)算公式:ΔΔCt=[(樣本Ct目的基因-樣本Ct內(nèi)參基因)-(對(duì)照組Ct目的基因-對(duì)照組Ct內(nèi)參基因)]，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 SOX9及β-actin基因引物序列及產(chǎn)物片段大小

1.3.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)期生長的HGC-27細(xì)胞以8×104/孔的密度接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞融合度達(dá)60%～70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，用PBS洗滌板內(nèi)細(xì)胞，按照慢病毒轉(zhuǎn)染說明書稀釋各組慢病毒原液至終濃度為1×108TU/mL后，取1 μL加入對(duì)應(yīng)孔內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分為：Sh-ctrl組(加入慢病毒LV3NC轉(zhuǎn)染)、Sh-9-1組(加入慢病毒LV3-homoSOX9-1轉(zhuǎn)染),Sh-9-2組(加入慢病毒LV3-homoSOX9-2轉(zhuǎn)染)。病毒轉(zhuǎn)染8～12 h后更換培養(yǎng)液并加入嘌呤霉素(1 μg/mL)篩選細(xì)胞，轉(zhuǎn)染72 h后于共聚焦熒光顯微鏡下拍照并計(jì)數(shù)熒光細(xì)胞/白光細(xì)胞比例以驗(yàn)證敲減效率。

1.3.4western blot 剪取患者新鮮癌組織和癌旁組織組織20～40 mg搗碎，加入預(yù)冷的PMSF：RIPA裂解液(1∶250稀釋)至EP管中，冰浴下經(jīng)超聲勻漿器充分勻漿后冰浴10 min，移至新EP管中，經(jīng)4 ℃、12 000×g離心10 min后取上清置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。?xì)胞總蛋白提取：取1.3.3中轉(zhuǎn)染72 h后的細(xì)胞經(jīng)反復(fù)震蕩裂解后，將蛋白質(zhì)樣品按30 μg總蛋白質(zhì)量加入每孔，經(jīng)12%聚丙烯酰胺凝膠電泳(積層膠采用80 V電壓，分離膠采用100 V電壓)。電泳結(jié)束后將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移(在350 mA恒流條件下轉(zhuǎn)2 h)至PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將膜置于50 g/L脫脂奶粉中封閉1～2 h，TBS/T洗膜10 min，分別加入兔(鼠)抗人SOX9、SOX2、Oct-4、Nanog、E-cadherin和兔抗人GAPDH抗體(1∶800稀釋)，4 ℃溫育過夜。TBS/T洗膜3次×10 min，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔(鼠) IgG二抗(1∶5 000稀釋)室溫溫育1～2 h，TBS/T洗膜3次，每次10 min；洗滌后加入曝光液進(jìn)行發(fā)光顯色，利用化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行成像分析，采用Image J軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度掃描及結(jié)果判讀。

1.3.5Transwell遷移試驗(yàn) 取轉(zhuǎn)染72 h后的HGC-27細(xì)胞，經(jīng)2.5 g/L胰蛋白酶消化后，用無血清DMEM/high Glucose Hyclone培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，細(xì)胞濃度調(diào)整為1×105/mL。取200 μL細(xì)胞懸液垂直加入Transwell遷移板上室，下室加入500 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)液。遷移板置于CO2培養(yǎng)箱溫育12～18 h后取出小室，PBS洗滌2次，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，結(jié)晶紫染色15 min，PBS洗滌后，擦凈小室內(nèi)未遷移細(xì)胞，晾干后于熒光顯微鏡下選取多個(gè)視野觀察并拍照，計(jì)數(shù)細(xì)胞遷移數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6平板克隆試驗(yàn) 取轉(zhuǎn)染72 h后的HGC-27細(xì)胞接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，調(diào)整細(xì)胞密度為3 000個(gè)/孔，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱溫育，動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞生長情況，每3～5 d更換1次培養(yǎng)液，當(dāng)出現(xiàn)肉眼可見的細(xì)胞克隆形成時(shí)終止培養(yǎng)，培養(yǎng)周期約7～10 d。棄去板內(nèi)培養(yǎng)液并用PBS洗滌2次后，4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，結(jié)晶紫染色15 min。PBS洗滌，晾干后于10倍光鏡下計(jì)數(shù)克隆細(xì)胞數(shù)>100個(gè)的細(xì)胞團(tuán)個(gè)數(shù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1SOX9基因及蛋白質(zhì)在胃癌組織中的表達(dá) qRT-PCR結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，胃癌患者腫瘤組織中SOX9基因的表達(dá)水平顯著上升(t=2.115，P=0.040)。western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,胃癌組織SOX9蛋白的表達(dá)水平較癌旁組織明顯升高。見圖1。

注：A，western blot檢測(cè)胃癌組織標(biāo)本SOX9蛋白表達(dá);B,SOX9蛋白相對(duì)表達(dá)量(灰度分析);N1～N4為4例癌旁組織標(biāo)本；T1～T4對(duì)應(yīng)的胃癌組織標(biāo)本，**，P<0.01；NS，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 胃癌患者組織中SOX9蛋白的表達(dá)水平

2.2SOX9敲減抑制HGC-27細(xì)胞增殖 經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染72 h后，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果顯示，本次轉(zhuǎn)染效率在80%以上(圖2A)，進(jìn)一步行qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，與陰性對(duì)照組(Sh-ctrl)SOX9表達(dá)水平(0.99±0.03)相比，Sh-SOX9-1組(0.69±0.10)(t=5.212，P=0.007)、Sh-SOX9-2組(0.59±0.20)(t=3.579,P=0.023)明顯下降(F=8.335,P=0.019)。平板克隆試驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組(Sh-ctrl)克隆細(xì)胞形成團(tuán)數(shù)[(74.33±3.21)個(gè)]相比，Sh-SOX9-1組[(65.67±3.05)個(gè),t=3.385,P<0.01]、Sh-SOX9-1組[(1.00±1.00)個(gè),t=37.73,P<0.01]均明顯減少(F=699.3，P<0.01)。見圖2B。

注：A，慢病毒轉(zhuǎn)染72 h后熒光顯微鏡下轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證；B，SOX9敲減后HGC-27細(xì)胞平板克隆形成能力；C，SOX9敲減后克隆計(jì)數(shù)；*，P<0.05；##，P<0.01。

圖2SOX9敲減抑制HGC-27細(xì)胞增殖

2.3SOX9敲減抑制HGC-27細(xì)胞遷移 Transwell遷移試驗(yàn)結(jié)果表明,與Sh-ctrl組[(972.7±36.69)個(gè)]相比，Sh-SOX9-1組[(323.3±22.12)個(gè),t=29.93，P<0.01]和Sh-SOX9-2組[(39.67±6.11)個(gè),t=43.44，P<0.01]遷移細(xì)胞數(shù)量均明顯減低(F=1 166，P<0.01),結(jié)果見圖3。

注：A，SOX9敲減后HGC-27細(xì)胞遷移(×10)；B，SOX9敲減后細(xì)胞遷移計(jì)數(shù)；*，P<0.01。

2.4SOX9敲減對(duì)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記和分化標(biāo)記表達(dá)的影響 qRT-PCR(圖4A)和western blot(圖4B)結(jié)果均顯示，SOX9敲減下調(diào)HGC-27細(xì)胞中干性基因OCT4、Nanog和SOX2及蛋白質(zhì)的表達(dá)，而上調(diào)細(xì)胞上皮分化相關(guān)基因CK18和MUC1及蛋白質(zhì)的表達(dá)。

注：A，SOX9敲減上調(diào)CK18、MUC1基因mRNA的表達(dá)，下調(diào)SOX2、Nanog和OCT4基因mRNA的表達(dá)；B，SOX9敲減后western blot 檢測(cè) Sh-ctrl 組、Sh-9-1組和Sh-9-2組E-Caderin、SOX2、Nanog和OCT4蛋白的表達(dá)；*，P<0.05，#，P<0.01；NS，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4SOX9敲減后經(jīng)qRT-PCR和western blot檢測(cè)基因及蛋白質(zhì)的結(jié)果

3 討論

大量研究證實(shí)，SOX9基因在甲狀腺、前列腺、乳腺、結(jié)腸直腸、腎細(xì)胞癌和膀胱癌等多種癌癥中過量表達(dá)，且與不良預(yù)后相關(guān)[2，4-5]。本研究證實(shí)了SOX9基因在胃癌患者腫瘤組織中顯著高表達(dá)。為了進(jìn)一步分析其在胃癌轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)中的作用，本研究利用慢病毒載體敲減胃癌細(xì)胞系中SOX9基因(為避免敲減SOX9基因時(shí)脫靶，特設(shè)計(jì)2種片段即：Sh-SOX9-1和Sh-SOX9-1)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)SOX9敲減處理的細(xì)胞中SOX9基因及相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)水平明顯降低；此外，本研究檢測(cè)該細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的增殖及遷移能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)SOX9敲減后，細(xì)胞遷移力顯著受抑制，這表明SOX9參與了胃癌的發(fā)生，且SOX9高表達(dá)與胃癌腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，SOX9的表達(dá)水平與胃癌、胰腺癌等耐藥性有關(guān)，表現(xiàn)出低整體存活率、低無疾病進(jìn)展存活率等[6-7]，還可因腫瘤所處階段、組織部位和侵略性的不同，SOX9的表達(dá)水平和位置(細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核)存在一定差異[5]，故而推測(cè)SOX9具有成為腫瘤生物標(biāo)志物的潛在應(yīng)用價(jià)值。在臨床上SOX9相關(guān)的生物標(biāo)志物的檢測(cè)可能有助于不同類型癌癥的診斷、預(yù)后和治療，但該分子實(shí)際的臨床應(yīng)用還需擴(kuò)大樣本量全面分析。

目前SOX9在腫瘤中的生物學(xué)作用機(jī)制尚不清楚。SOX9作為機(jī)體發(fā)育過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，參與體內(nèi)眾多復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，同時(shí)其也作為干細(xì)胞維持干性的相關(guān)因子在維持腫瘤干細(xì)胞的增殖、自我更新和致瘤性中發(fā)揮重要作用[8]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，SOX9過表達(dá)可激活Wnt/β-連環(huán)蛋白途徑，參與人肺癌細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)節(jié)[9]。另有研究證實(shí)，β-catenin-STAT3通路相關(guān)蛋白在胃癌患者組織中的表達(dá)水平亦顯著升高[10]。因此，我們推測(cè)SOX9可能通過激活Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路影響細(xì)胞增殖和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，從而發(fā)揮其生物學(xué)功能。本研究檢測(cè)了經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染敲減SOX9后的胃癌細(xì)胞系內(nèi)腫瘤干細(xì)胞及EMT相關(guān)基因表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲減SOX9明顯下調(diào)HGC-27細(xì)胞中OCT4、Nanog和SOX2基因及蛋白質(zhì)的表達(dá)，使得細(xì)胞干性減弱；同時(shí)還上調(diào)了胃癌細(xì)胞分化相關(guān)的CK18和MUC1基因及促進(jìn)上皮標(biāo)志物E-cadherin蛋白的表達(dá)，使其表現(xiàn)出與分化相關(guān)的特性。表明SOX9可以調(diào)控胃癌細(xì)胞干性及其分化，也更進(jìn)一步地提示了胃癌的發(fā)生與腫瘤干細(xì)胞出現(xiàn)及EMT過程密切相關(guān)[11]。