鄧文松，馬巧玲，張曉云，吳志華，洪麗梅

(1.中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第908醫(yī)院檢驗(yàn)科,江西鷹潭 335000；2.鷹潭市中心血站，江西鷹潭335000)

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，且治療后的復(fù)發(fā)率較高，給臨床診治及患者預(yù)后帶來(lái)較大的不利影響。微小RNA(microRNA，miR)是近年來(lái)受到廣泛關(guān)注的非編碼小分子RNA，在體內(nèi)參與多種生物學(xué)行為的調(diào)控，并被證實(shí)與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。miR-181a是一種具有促癌特性的微小RNA，研究證實(shí)，miR-181a在MM患者骨髓組織中呈顯著高表達(dá)趨勢(shì)[1-2]，提示miR-181a可能參與骨髓瘤的發(fā)生、發(fā)展。另有多項(xiàng)研究證實(shí)，在胃癌及骨肉瘤細(xì)胞中，miR-181a的促癌活性與靶向抑制抑癌基因Ras相關(guān)區(qū)域家族1A(ras association domain family 1，RASSF1A)的表達(dá)密切相關(guān)[3-4]，但miR-181a是否在MM患者骨髓中靶向RASSF1A并調(diào)控相應(yīng)的惡性生物學(xué)行為目前尚未明確。為探討miR-181a對(duì)多發(fā)性骨髓瘤惡性生物學(xué)特征的調(diào)節(jié)作用及可能的作用機(jī)制，本研究擬檢測(cè)骨髓瘤組織及正常骨髓組織中miR-181a表達(dá)的差異，并以多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系U266為研究對(duì)象分析miR-181a靶向RASSF1A促進(jìn)U266細(xì)胞增殖、侵襲的作用。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象 收集2014年2月至2018年12月在我院行骨髓穿刺并經(jīng)病理組織學(xué)診斷為MM患者40例，男23例，女17例，年齡(48.6±8.1)歲；納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合MM的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；(2)臨床及病理資料完整；(3)未接受過(guò)MM相關(guān)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)既往有惡性腫瘤病史；(2)合并其他血液系統(tǒng)疾病；(3)合并自身免疫性疾病、肝腎功能不全等。采集同期在我院接受骨髓穿刺并經(jīng)病理組織學(xué)證實(shí)為正常骨髓的受試者50例，男29例、女21例，年齡(47.2±9.2)歲，均排除合并嚴(yán)重肝腎功異常、血液系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病、惡性腫瘤等其他系統(tǒng)疾病。各研究對(duì)象均知情同意，本研究經(jīng)中國(guó)人民解放軍第一八四醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：XHEC-D-2018076)。MM患者與正常骨髓象受試者的性別、年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2主要試劑與儀器 U266細(xì)胞系購(gòu)自中科院上海細(xì)胞資源中心；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司)；MTS細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒、野生型及突變型RASSF1A3′UTR的熒光素酶報(bào)告及相應(yīng)的熒光素酶曝光基因檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Promega公司)；Lipofectamine 3000(美國(guó)Invitrogen公司)；結(jié)晶紫(美國(guó)Sigma公司)；miRNA提取試劑盒、miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、miRNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒(北京天根公司)；RIPA裂解液、BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒(北京索萊寶公司)；兔抗人RASSF1A、cyclinD1、RhoA多克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)；驢抗兔辣根過(guò)氧化物酶IgG二抗(北京奧維亞生物技術(shù)公司)。Bx53正置顯微鏡(日本Olmpus公司)；Elx800酶聯(lián)儀(美國(guó)Bio-Tek公司);Multiskan Sky分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo公司);CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司);Tanon-4100化學(xué)顯影儀(上海天能公司)；DR1900分光光度計(jì)(美國(guó)哈希公司)；GloMax 2020單管型發(fā)光檢測(cè)儀(北京原平皓生物公司)。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的U266細(xì)胞，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)90%時(shí)，用12.5 g/L胰蛋白酶消化傳代并繼續(xù)培養(yǎng)，取傳代后處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行分組處理。實(shí)驗(yàn)設(shè)為NC mimic組、miR-181a mimic組、NC inhibitor組、miR-181a inhibitor組，按照Lipofectamine 3000試劑盒說(shuō)明書(shū)將NC mimic(2 μL/mL)、miR-181a mimic、NC inhibitor(20 pmol/mL)、miR-181a inhibitor(20 pmol/mL)分別轉(zhuǎn)染進(jìn)入各組細(xì)胞，連續(xù)轉(zhuǎn)染24 h。每個(gè)樣本設(shè)5個(gè)復(fù)孔。

1.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-181a表達(dá)量

1.4.1RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 取MM患者骨髓組織及正常骨髓組織各約20～30 mg，另取轉(zhuǎn)染后的各組U266細(xì)胞1×106個(gè)，按照miRNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)分離組織或細(xì)胞中的miRNA，采用DR1900分光光度計(jì)檢測(cè)吸光度(A260/280 nm)在1.7～2.0的樣本用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。取2 μg miRNA并按照miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒說(shuō)明書(shū)將miRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，樣本置于-20 ℃保存。

1.4.2引物設(shè)計(jì)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR 采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，并送上海生工公司合成。miR-181a的正向引物序列：5′-TAGCTAGCTAGTCAGTGTC′-3′；β-actin正向引物序列：5′-TCGATCGATGCTAGCTAT′-3′，反向引物序列：5′-TAGCATAGCTAGCTAGCT-3′，退火溫度58 ℃、產(chǎn)物164 bp；按照miRNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)，PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括cDNA 2 μL，10 μmol/L正向引物0.4 μL，通用反向引物0.4 μL，PCR Mix 10 μL，去離子水7.2 μL。循環(huán)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃ 20 s，60 ℃ 34 s,共40個(gè)循環(huán)，在60 ℃時(shí)采用CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀配套軟件iQ5 V2.1.97進(jìn)行熒光采集及熔解曲線分析，根據(jù)循環(huán)閾值(Ct)，以β-actin為內(nèi)參照。按照2-ΔΔCt法計(jì)算miR-181a的表達(dá)量。

1.5MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力 取經(jīng)12.5 g/L胰蛋白酶消化后的各組U266細(xì)胞，用DMEM培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至1×106/mL，取200 μL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，按照1.3的方法分組并轉(zhuǎn)染24 h后，按照MTS細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行細(xì)胞增殖活力檢測(cè)，用Elx800酶聯(lián)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A450 nm)值。

1.6Transwell試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 取經(jīng)12.5 g/L胰蛋白酶消化后的U266細(xì)胞，用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基重懸，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至1×106mL，取200 μL細(xì)胞懸液接種于預(yù)涂基質(zhì)膠的Transwell上層小室，下層小室加入800 μL含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基，按照1.3的方法分組并轉(zhuǎn)染24 h后，取出小室，PBS漂洗2次后用棉簽擦去未穿膜細(xì)胞，經(jīng)4%多聚甲醛固定30 min后結(jié)晶紫染色10 min，在光學(xué)顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞的數(shù)目。

1.7熒光素酶報(bào)告基因的檢測(cè) 取經(jīng)12.5 g/L胰蛋白酶消化后的U266細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至1×106/mL，取500 μL接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，先將野生型及突變型的RASSF1A熒光素酶報(bào)告基因轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞，使報(bào)告基因的終濃度達(dá)1 μg/mL，按照1.3轉(zhuǎn)染步驟操作，轉(zhuǎn)染24 h后用2.5 g/L胰蛋白酶消化并以3 000 r/min離心10 min,收集細(xì)胞，按照熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒及GloMax 2020單管型發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光值和海腎熒光值。熒光素酶報(bào)告基因的熒光活性計(jì)算公式：螢火蟲(chóng)熒光值/海腎熒光值。

1.8蛋白質(zhì)提取及western blot

1.8.1蛋白質(zhì)提取 組織蛋白質(zhì)提取：取MM患者骨髓組織及正常骨髓組織20 mg，加入RIPA裂解液0.5 mL后進(jìn)行超聲勻漿處理；細(xì)胞蛋白質(zhì)提?。喝?×106個(gè)U266細(xì)胞接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，按照1.3的方法分組處理后，加入RIPA裂解液0.1 mL后用細(xì)胞刮刀裂解細(xì)胞。取裂解液，按照BCA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作測(cè)定總蛋白質(zhì)含量，然后加入1/4體積的5×SDS蛋白質(zhì)上樣緩沖液，100 ℃加熱變性10 min，分裝并置-80 ℃保存。

1.8.2western blot 配制10% SDS-PAGE分離膠，將上述蛋白質(zhì)樣品按30 μg總蛋白質(zhì)的量進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(積層膠采用80 V電壓，分離膠采用100 V電壓)，電泳結(jié)束后在350 mA恒流條件下2 h將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至NC膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將膜置于50 g/L脫脂牛奶中室溫封閉NC膜2 h，加入兔抗人RASSF1A、cyclinD1、RhoA多克隆抗體(1∶1 000稀釋)在4 ℃溫育過(guò)夜，加入 TBS/T在水平搖床上洗膜3次，每次5 min；加入驢抗兔辣根過(guò)氧化物酶IgG二抗(1∶2 000稀釋)溫育2 h，加入TBS/T在水平搖床上洗膜5次后，在Tanon-4100化學(xué)顯影儀掃描并曝光得到蛋白質(zhì)條帶，公式：目標(biāo)蛋白質(zhì)灰度值/β-actin灰度值。

2 結(jié)果

2.1各組miR-181a及RASSF1A、cyclinD1、RhoA表達(dá)的比較 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，MM患者骨髓組織中miR-181a的表達(dá)水平為1.31±0.28，明顯高于正常骨髓組織(0.67±0.09)(P<0.05)；western blot結(jié)果表明，cyclinD1、RhoA蛋白的表達(dá)量明顯高于正常骨髓組織，而RASSF1A蛋白的表達(dá)量明顯低于正常骨髓組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)圖1、表1。經(jīng)Pearson檢驗(yàn)，MM骨髓組織中miR-181a的表達(dá)量與RASSF1A的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.351，P<0.05)，而與cyclinD1、RhoA的表達(dá)量呈正相關(guān)(r分別為0.318，0.408，P<0.05)。

注：1～5為正常骨髓組織，6～10為MM骨髓組織。

表1 MM骨髓與正常骨髓中miR-181a及RASSF1A、cyclinD1、RhoA表達(dá)的比較

參數(shù)MM骨髓(n=40)正常骨髓(n=50)tPmiR-181a1.31±0.280.67±0.0913.880<0.001RASSF1A0.85±0.191.44±0.3111.108<0.001cyclinD10.65±0.130.34±0.0812.779<0.001RhoA0.95±0.210.60±0.149.049<0.001

2.2轉(zhuǎn)染后U266細(xì)胞miR-181a的表達(dá)量 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染24 h后，NC mimic組、miR-181a mimic組U266細(xì)胞中miR-181a的表達(dá)量分別為0.61±0.09和12.66±2.23，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.798,P<0.001)。而NC inhibitor組、miR-181a inhibitor組U266細(xì)胞中miR-181a的表達(dá)量分別為0.56±0.08和0.31±0.06，兩組間差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.590,P<0.001)。

2.3轉(zhuǎn)染后各組U266細(xì)胞的增殖活力 MTS法檢測(cè)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染后24 h，NC mimic組、miR-181a mimic組U266細(xì)胞的A450 nm值分別為0.51±0.07和0.86±0.17，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.257,P<0.05)；NC inhibitor組、miR-181a inhibitor組U266細(xì)胞的A450 nm值分別為0.55±0.08和0.32±0.07，兩組間差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.838,P<0.05)。

2.4轉(zhuǎn)染后各組U266細(xì)胞的侵襲數(shù)目 Transwell試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染后24 h，NC mimic組、miR-181a mimic組U266細(xì)胞的侵襲數(shù)目分別為(10.29±2.12)個(gè)、(38.59±7.41)個(gè)，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.210,P<0.05)；而NC inhibitor組、miR-181a inhibitor組U266細(xì)胞的侵襲數(shù)目分別為(11.41±2.76)個(gè)、(7.28±1.24)個(gè)，兩組間差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.052,P<0.05)。見(jiàn)圖2。

2.5miR-181a對(duì)RASSF1A及下游增殖、侵襲基因的調(diào)節(jié)作用 western blot結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染24 h后，miR-181a mimic組U266細(xì)胞中RASSF1A蛋白表達(dá)量明顯低于NC mimic組(t=5.438，P<0.05)，而cyclinD1、RhoA蛋白表達(dá)量明顯高于NC mimic組(t分別為3.917，3.654，P<0.05)；此外，miR-181a inhibitor組U266細(xì)胞中RASSF1A蛋白的表達(dá)量明顯高于NC inhibitor組(t=3.464，P<0.05)，cyclinD1、RhoA蛋白表達(dá)量明顯低于NC inhibitor組(t分別為6.277，9.295，P<0.05)。見(jiàn)圖3、表2。

圖3 轉(zhuǎn)染mimic(A)、inhibitor(B)后U266細(xì)胞中RASSF1A、cyclinD1、RhoA蛋白的表達(dá)

蛋白質(zhì)NCmimicmiR-181amimicNCinhibitormiR-181ainhibitorRASSF1A1.54±0.260.81±0.151.25±0.211.83±0.31cyclinD10.55±0.070.84±0.150.71±0.120.32±0.07RhoA0.62±0.120.97±0.170.66±0.100.39±0.06

2.6miR-181a靶向RASSF1A3′UTR的驗(yàn)證 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)表明，miR-181a mimic組野生型RASSF1A3′UTR熒光素酶報(bào)告基因的熒光活性值分別為0.291±0.062和0.173±0.035，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.315，P<0.05)；而NC mimic組、miR-181a mimic組突變型RASSF1A3′UTR分別為0.289±0.051和0.295±0.042，兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.182，P>0.05)。此外，miR-181a inhibitor組野生型RASSF1A3′UTR熒光素酶報(bào)告基因的熒光活性值分別為0.273±0.057和0.399±0.067，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.203，P<0.05)；而NC inhibitor組、miR-181a inhibitor組突變型RASSF1A3′UTR分別為0.280±0.055和0.291±0.067，兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.284，P>0.05)。

3 討論

近年來(lái)，miR-181a在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用受到越來(lái)越多關(guān)注。多項(xiàng)研究[6-8]證實(shí)，肝癌、胃癌、結(jié)直腸癌、宮頸癌等惡性腫瘤病灶內(nèi)miR-181a的表達(dá)均升高。劉仁濤等[2]研究報(bào)道，miR-181a在MM骨髓組織中的表達(dá)水平(112.68±16.53)明顯高于正常對(duì)照組(75.94±10.02)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。在本實(shí)驗(yàn)中，miR-181a在MM骨髓組織中的表達(dá)水平為1.31±0.28，亦明顯高于正常骨髓組織(0.67±0.09)，與劉仁濤等[2]的報(bào)道結(jié)果較為一致。結(jié)合已知的miR-181a靶向抑制多種抑癌基因并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲的效應(yīng)分析報(bào)道[3-4]，我們推測(cè)骨髓中高表達(dá)的miR-181a可能通過(guò)促進(jìn)MM細(xì)胞的增殖、侵襲參與疾病的發(fā)生、發(fā)展。

本研究進(jìn)一步在離體細(xì)胞中驗(yàn)證了miR-181a對(duì)MM細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的調(diào)節(jié)作用。Sun等[9]研究證實(shí)，miR-181a靶向SRC激酶信號(hào)抑制劑(SRCIN1)促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的血管新生。Le等[10]研究證實(shí)，miR-181a靶向視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因1(RB1)促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染miR-181a mimic后U266細(xì)胞中miR-181a的表達(dá)水平明顯增加，而轉(zhuǎn)染miR-181a inhibitor后細(xì)胞中miR-181a的表達(dá)水平明顯減少。在轉(zhuǎn)染后對(duì)細(xì)胞增殖和侵襲的觀察結(jié)果顯示，miR-181a mimic能夠促進(jìn)MM細(xì)胞的增殖和侵襲，miR-181a inhibitor能夠抑制MM細(xì)胞的增殖和侵襲，表明miR-181a參與MM增殖和侵襲的調(diào)控。

miR-181a已經(jīng)被證實(shí)能夠靶向RASSF1A基因mRNA的3′UTR，抑制RASSF1A基因的表達(dá)[3-4]。RASSF1A作為重要的抑癌基因，能夠通過(guò)抑制下游cyclinD1的表達(dá)以抑制細(xì)胞增殖，并抑制下游RhoA的表達(dá)以抑制細(xì)胞侵襲；當(dāng)RASSF1A基因的表達(dá)被miR-181a抑制時(shí)，相應(yīng)的抑癌作用也被削弱，進(jìn)而參與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程[11-12]。在MM骨髓中，RASSF1A基因已經(jīng)被證實(shí)呈顯著低表達(dá)的趨勢(shì)[2]。在本研究中，MM骨髓中RASSF1A的表達(dá)明顯減少，而下游cyclinD1、RhoA的表達(dá)明顯增多，表明RASSF1A介導(dǎo)的抑癌作用在MM中受到抑制。本實(shí)驗(yàn)還在U266細(xì)胞中觀察到miR-181a mimic能夠減少RASSF1A的表達(dá)，增加cyclinD1及RhoA的表達(dá)，miR-181a inhibitor能夠增加RASSF1A的表達(dá)，減少cyclinD1及RhoA的表達(dá)，并且miR-181a mimic能夠使RASSF1A3′UTR熒光素酶報(bào)告基因的熒光活性降低。以上結(jié)果表明miR-181a能夠在MM中靶向抑制RASSF1A的表達(dá)，進(jìn)而使下游cyclinD1及RhoA表達(dá)增加并促進(jìn)細(xì)胞的增殖和侵襲。

綜上所述，miR-181a能夠促進(jìn)MM細(xì)胞的增殖、侵襲并靶向抑制RASSF1A的表達(dá)；本研究存在以下不足之處：首先，收集的臨床樣本數(shù)量較少，今后需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，明確miR-181a在MM骨髓中的表達(dá)，并隨訪其與病情轉(zhuǎn)歸、預(yù)后的相關(guān)性；其次，雖然通過(guò)離體細(xì)胞證實(shí)了miR-181a促進(jìn)MM細(xì)胞增殖和侵襲的作用，但缺乏活體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，今后仍需進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及人體實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證miR-181a在MM發(fā)生、發(fā)展中的作用。