羅莎莎，楊麗紅，謝海嘯，金艷慧，劉斯奇，張海月，王明山

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，浙江溫州325015)

遺傳性異常纖維蛋白原血癥(congenitaldysfibrinogenemia,CD)是一種纖維蛋白原基因缺陷致纖維蛋白原分子結(jié)構(gòu)和功能異常的遺傳性疾病，主要與FGA、FGB和FGG3種基因突變有關(guān)，多數(shù)為常染色體顯性遺傳，少數(shù)為常染色體隱性遺傳[1]。該病臨床表現(xiàn)高度異質(zhì)性,其中約55%患者無(wú)臨床表現(xiàn)，25%患者有出血癥狀，20%患者有血栓形成，少數(shù)患者表現(xiàn)為傷口愈合不良、反復(fù)流產(chǎn)等[2]。纖維蛋白原(fibrinogen,Fg)對(duì)于妊娠期胎囊的植入和胎盤(pán)形成至關(guān)重要，在妊娠期，F(xiàn)g通過(guò)支持細(xì)胞和滋養(yǎng)細(xì)胞播散，促進(jìn)母體和胎兒間的血管生成，從而維持胎盤(pán)的完整性[3]。因此，遺傳性異常纖維蛋白原血癥患者在妊娠期最常見(jiàn)的并發(fā)癥為復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、胎盤(pán)早剝、產(chǎn)后出血及血栓形成等[4]。本研究分析了1例遺傳性異常纖維蛋白原血癥家系的臨床表型和基因型，并深入探討突變基因與胎停育之間的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 先證者，女，33歲，漢族，7年前生育1男孩。現(xiàn)懷孕6周+5 d，此前3年內(nèi)有不明原因胎停育2次，第一次孕5周+6 d，第二次孕+3 d，2018年2月至我院門(mén)診要求進(jìn)行相關(guān)檢查。凝血常規(guī)檢查示凝血酶時(shí)間(thrombin time，TT)明顯延長(zhǎng)(34.4 s/17.0 s)，F(xiàn)g活性(Fg activity，F(xiàn)g:C)顯著降低(1.02 g/L)，血小板計(jì)數(shù)及肝腎功能指標(biāo)正常?；颊咦允黾韧陆?jīng)規(guī)律，無(wú)其他明顯自發(fā)出血癥狀，無(wú)血栓史，無(wú)肝腎功能異常史。否認(rèn)父母近親婚配及其家系成員出血史。采集先證者及其家系3代共6名成員的外周血標(biāo)本。

1.2主要儀器與試劑 STA-R全自動(dòng)血凝儀及原裝配套試劑(法國(guó)Stago公司);LX20PRO 全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó)Beckman公司);2720型PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI公司);凝膠電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司);凝膠成像系統(tǒng) (上海天能公司);Fg抗原(Fg antigen，F(xiàn)g:Ag)檢測(cè)試劑盒(浙江伊利康生物公司)；DNA提取試劑盒(上海荻碩貝肯生物公司)；PCR擴(kuò)增試劑盒(美國(guó)Promega公司)。

1.3標(biāo)本采集與處理 采集受試者治療前外周靜脈血2.7 mL，用0.109 mol/L枸櫞酸鈉1∶9抗凝；3 000 r/min離心15 min，上層乏血小板血漿用于各凝血指標(biāo)及Fg:Ag含量的檢測(cè)，2 h內(nèi)檢測(cè)完畢。下層血細(xì)胞用于提取基因組DNA及PCR擴(kuò)增測(cè)序，置于-40 ℃保存。

1.4實(shí)驗(yàn)室表型指標(biāo)檢測(cè) 采用凝固法，按照STA-R全自動(dòng)血凝儀及原裝配套試劑說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血漿凝血酶原時(shí)間(prothrombin time，PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(activated partial thromboplastin time，APTT)、TT、Fg:C；采用免疫比濁法檢測(cè)D二聚體(D-Dimer,D-D)和纖維蛋白(原)降解產(chǎn)物(fibrin degradation products，F(xiàn)DPs);采用免疫比濁法，按照LX20PRO全自動(dòng)生化分析儀及Fg抗原(Fg antigen，F(xiàn)g:Ag)檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)Fg:Ag含量。均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行結(jié)果判讀。

1.5全血基因組DNA提取 采用高鹽法，按照全血基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取先證者及其家系成員的外周血基因組DNA，用DU800核酸蛋白分析儀檢測(cè)基因組DNA產(chǎn)物的純度和濃度，取純度(A260/280 nm約1.9)和濃度為50 ng/μL的DNA產(chǎn)物，置-40 ℃保存。

1.6纖維蛋白原基因檢測(cè) 根據(jù)FGA、FGB、FGG基因在GenBank中的參考序列號(hào)(分別為M64982、M64983和M10014)，利用Primer Primer 6.0TM軟件結(jié)合參考文獻(xiàn)[5]設(shè)計(jì)覆蓋Fg基因所有外顯子及其側(cè)翼序列的引物，引物由上海桑尼公司合成，引物序列見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系為50 μL，包括Taq PCR MasterMix(含染料)25 μL，雙蒸水18 μL,DNA模板3 μL，10 μmol/L上、下游引物各2 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s,55 ℃或56 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，紫外光下觀察為單一明亮條帶。送上海桑尼生物公司(測(cè)序儀為ABI PRISM 3730)進(jìn)行正、反向測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用Chromas和DNAMAN軟件進(jìn)行分析，并與NCBI中公布的FGA、FGB、FGG基因在GenBank中的參考序列進(jìn)行比對(duì)，尋找基因突變位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)突變基因后，通過(guò)反向測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。明確先證者基因突變位點(diǎn)后，再擴(kuò)增家系其他成員的相應(yīng)區(qū)域并進(jìn)行測(cè)序分析。

2 結(jié)果

2.1先證者及家系成員血漿實(shí)驗(yàn)室表型指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 先證者血漿PT、APTT、D-D和FDPs檢測(cè)結(jié)果正常，TT顯著延長(zhǎng)為34.4 s/17.0 s，F(xiàn)g:C降低至1.02 g/L，F(xiàn)g:Ag在參考范圍內(nèi)(2.0～4.0 g/L)。先證者母親、弟弟及兒子的檢測(cè)結(jié)果與先證者相似。先證者父親和丈夫的所有上述檢測(cè)結(jié)果均在參考范圍內(nèi)。見(jiàn)表2。

表1 FGA、FGB、FGG基因的引物序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度

表2 先證者及家系成員的臨床表型檢測(cè)結(jié)果

2.2基因檢測(cè)結(jié)果FGA、FGB和FGG基因外顯子和側(cè)翼序列測(cè)序結(jié)果顯示，先證者FGG基因第8外顯子存在g.7476G>A雜合錯(cuò)義突變，導(dǎo)致第275位的精氨酸(Arg)被組氨酸(His)取代(p.γArg275His)；FGB基因第8外顯子存在g.7652G>A雜合多態(tài)性，導(dǎo)致第478位的精氨酸(Arg)被賴氨酸(Lys)取代(p.BβArg478Lys)。家系成員中，先證者的母親、弟弟和兒子均存在g.7476G>A雜合錯(cuò)義突變，先證者的父親為g.7652G>A雜合多態(tài)性。見(jiàn)圖1、2。

注：，先證者；，Arg478Lys多態(tài)性;,Arg275His雜合突變；，Arg275His雜合突變和Arg478Lys多態(tài)性。

圖1 遺傳性異常纖維蛋白原血癥家系圖

注：A，F(xiàn)GG基因第8外顯子g.7476G>A雜合錯(cuò)義突變；B，F(xiàn)GG基因第8外顯子野生型；C，F(xiàn)GB基因第8外顯子g.7652G>A雜合多態(tài)性；D，F(xiàn)GB基因第8外顯子野生型。

圖2 該先證者Fg基因測(cè)序結(jié)果

3 討論

Fg由簇集于4q31染色體約50 000 bp內(nèi)的3 個(gè)獨(dú)立基因(FGA、FGB、FGG)所編碼的3條肽鏈 (Aα、Bβ、γ)組成的六聚體，相對(duì)分子質(zhì)量約為340 000，是血漿中含量最高的凝血因子。Fg主要在肝細(xì)胞中合成，少部分在上皮細(xì)胞中合成，其主要生理功能為進(jìn)入血液循環(huán)后參與凝血和調(diào)節(jié)纖溶，因此Fg異常往往導(dǎo)致各種出凝血疾病。遺傳性纖維蛋白原異?；颊咴谌焉锲谧畛Ｒ?jiàn)的并發(fā)癥為反復(fù)自然流產(chǎn)、胎盤(pán)早剝等。Frenkel等[6]曾報(bào)道2例遺傳性低纖維蛋白原血癥孕婦在分娩時(shí)均發(fā)生胎盤(pán)早剝。本研究發(fā)現(xiàn)先證者FGG基因第8號(hào)外顯子存在p.γArg275His雜合錯(cuò)義突變和p.BβArg 478 Lys雜合多態(tài)性。γArg275位于D-D接觸面，D-D結(jié)合是形成纖維蛋白網(wǎng)架結(jié)構(gòu)所必須。γ鏈275Arg被His替換，會(huì)引起D-D連接區(qū)域結(jié)構(gòu)的改變，進(jìn)而影響纖維蛋白單體聚合，導(dǎo)致異常纖維蛋白原血癥。Arg478Lys是纖維蛋白原FGB基因較常見(jiàn)的多態(tài)性之一，BβArg478Lys位置靠近以下區(qū)域：預(yù)測(cè)的β鏈聚合點(diǎn)，β鏈的鈣離子結(jié)合部位以及β鏈和α鏈羧基端結(jié)合部位，這3個(gè)區(qū)域是纖維蛋白原聚集的重要部位。

蔣麗婭等[7]對(duì)1例遺傳性異常纖維蛋白原血癥患者的FGG基因突變分析發(fā)現(xiàn)，p.γArg275His錯(cuò)義突變是導(dǎo)致異常纖維蛋白原血癥的主要原因。此外，在已報(bào)道的γArg275His病例中約27%患者有血栓形成，該突變將導(dǎo)致纖維蛋白肽釋放，纖維蛋白單體聚合，纖維蛋白交聯(lián)或纖維蛋白溶解的改變，可引起出血或血栓形成性疾病。Ajjan等[8]對(duì)p.BβArg 478Lys多態(tài)性研究發(fā)現(xiàn)，Lys478的纖維蛋白溶解率明顯低于Arg 478，提示Lys 478纖維蛋白具有纖維薄、孔小的特點(diǎn)，表現(xiàn)出較強(qiáng)的硬度，對(duì)纖溶功能有較強(qiáng)的抵抗力，形成的纖維蛋白不容易降解，增加血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)。本研究中的先證者同時(shí)存在p.γArg275His雜合錯(cuò)義突變和p.BβArg478Lys雜合多態(tài)性，其所發(fā)生的胎停育現(xiàn)象推測(cè)與p.γArg275His雜合錯(cuò)義突變和p.BβArg478Lys雜合多態(tài)性有關(guān)。

研究顯示，纖維蛋白原FGG基因敲除小鼠妊娠不能維持至足月[9]，表明纖維蛋白原對(duì)妊娠的重要性。妊娠期間纖維蛋白凝塊結(jié)構(gòu)改變均會(huì)造成不良妊娠[10]。受精卵著床后子宮螺旋動(dòng)脈開(kāi)始不斷被滋養(yǎng)細(xì)胞侵蝕，導(dǎo)致管腔擴(kuò)大，為滿足妊娠時(shí)期的血氧供應(yīng)，子宮動(dòng)脈血流阻力進(jìn)行性降低[11-12]。在早孕時(shí)期，若子宮動(dòng)脈血流灌注不足，即可能導(dǎo)致自然流產(chǎn)、胎兒生長(zhǎng)受限、胎盤(pán)早剝、子癇前期、胚胎停育等不良妊娠結(jié)局[13]，如果子宮動(dòng)脈血流灌注在早期能夠得到糾正，妊娠結(jié)局就會(huì)顯著改善。因此，母體中纖維蛋白原含量和功能是否正常對(duì)妊娠至關(guān)重要。該先證者Fg:Ag含量正常，但Fg:C降低，為Ⅱ型Fg缺陷癥患者，即異常纖維蛋白原血癥。由于Fg結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，妊娠導(dǎo)致生理性高凝狀態(tài)所產(chǎn)生的纖維蛋白不易被纖溶酶溶解，子宮螺旋動(dòng)脈血流阻力進(jìn)行性升高，供應(yīng)胎兒的血流減少，氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)無(wú)法滿足胎兒生長(zhǎng)發(fā)育的需要，從而可能導(dǎo)致胎停。

綜上所述，本研究分析了p.γArg275His雜合錯(cuò)義突變和p.BβArg478Lys雜合多態(tài)性導(dǎo)致該先證者胎停育的可能機(jī)制。對(duì)于臨床上出現(xiàn)胎停育的婦女進(jìn)行易栓癥的篩查和基因突變分析，查找原因，對(duì)癥治療，是預(yù)防再次出現(xiàn)胎停育的有效措施。但由于這只是1個(gè)家系先證者的臨床表現(xiàn)，還有待于分析更多的病例以期為臨床提供依據(jù)。