胡聽(tīng)聽(tīng)，郭浩，秦丹卿，杜麗，尹愛(ài)華

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬省婦兒醫(yī)院醫(yī)學(xué)遺傳中心婦幼代謝與遺傳病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 511440)

血紅蛋白病包括異常血紅蛋白病和地中海貧血。異常血紅蛋白病是一種血液中結(jié)構(gòu)異常的血紅蛋白部分或全部取代正常血紅蛋白，引起血液系統(tǒng)或其他系統(tǒng)異常的疾病[1]。研究證實(shí)，大多數(shù)結(jié)構(gòu)異常的血紅蛋白是由于血紅蛋白相關(guān)基因發(fā)生突變(如插入、缺失、替換、移碼突變等)[2]。目前發(fā)現(xiàn)的異常血紅蛋白有多種(http://globin.bx.psu.edu/)，但只有極少部分可引起臨床癥狀。地中海貧血是由于血紅蛋白基因點(diǎn)突變或缺失引起血紅蛋白合成相對(duì)不足，是一種遺傳性溶血性貧血[3]。有學(xué)者證實(shí)，如果異常血紅蛋白合并地中海貧血，有可能使患者的臨床癥狀加重[4]，并且無(wú)癥狀的血紅蛋白病可能隨著年齡增長(zhǎng)而導(dǎo)致癥狀加重[5]。我國(guó)南方地區(qū)地中海貧血發(fā)病率高、影響大，廣東和廣西地區(qū)尤其高發(fā)[6]，有必要對(duì)每一種異常血紅蛋白進(jìn)行仔細(xì)研究，闡明其分子機(jī)制和臨床表現(xiàn)。地中海貧血相關(guān)研究和報(bào)道較多，而異常血紅蛋白病報(bào)道相對(duì)較少，故本研究擬對(duì)2015年至2019年我院發(fā)現(xiàn)的9例攜帶有異常血紅蛋白Hb J-Bangkok的患者進(jìn)行臨床血液學(xué)和分子診斷學(xué)研究。報(bào)道如下。

1 病歷資料與方法

1.1病歷資料 收集2015年1月至2019年12月于我院門(mén)診及住院就診的血液病患者9例，男4例，女性5例，年齡21～45歲，中位年齡32.67歲，均行血紅蛋白電泳篩查呈異常血紅蛋白J帶，且經(jīng)基因測(cè)序確診其攜帶有β珠蛋白基因c.170 G>A 雜合突變(codon 56 GGC>GAC)?；颊呔栽V沒(méi)有經(jīng)歷過(guò)輸血治療或者骨髓移植。本研究通過(guò)廣州醫(yī)科大學(xué)附屬省婦兒醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，編號(hào)：廣東省婦幼保健院醫(yī)倫第[202001008]號(hào)，所有研究對(duì)象均知情同意。

1.2主要儀器與試劑 XS-1000i全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀及配套檢測(cè)試劑盒(日本Sysmex公司)；Capillar 2全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀及配套檢測(cè)試劑盒(法國(guó)Sebia公司)；地中海貧血(α/β)基因檢測(cè)試劑盒(PCR-流式熒光雜交法，中山大學(xué)達(dá)安基因公司)；Luminex MagPix多功能液相懸浮芯片系統(tǒng)(美國(guó)Luminex Corporation公司)；MN外周血全基因組柱提法試劑盒(MN Genomic DNA from blood，德國(guó)Macherey-Nagel GmbH &Co.KG公司)；NanodropND-1000紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Scientific公司)；ABI 3500XL一代測(cè)序儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)

1.3標(biāo)本采集 采集各患者就診時(shí)的外周靜脈血(無(wú)需空腹)4～5 mL，EDTA-K2抗凝,分為兩管，一管進(jìn)行外周血血常規(guī)及血紅蛋白電泳檢測(cè)，另一管進(jìn)行基因檢測(cè)。采集后的標(biāo)本室溫保存并立即送檢。

1.4血細(xì)胞參數(shù)分析 取各患者EDTA-K2抗凝外周血標(biāo)本2 mL，采用XS-1000i全自動(dòng)細(xì)胞分析儀及配套檢測(cè)試劑盒檢測(cè)患者血細(xì)胞參數(shù)，包括Hb(男：130～175 g/L，女：115～150 g/L)、MCV(參考范圍：82～100 fL)、MCH(參考范圍：27～34 pg)等，采用Sebia Capillar2全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀及配套檢測(cè)試劑盒分析患者血液血紅蛋白組分，包括HbA(參考范圍：94.50%～97.35%)、HbA2(參考范圍：2.7%～3.5%)、HbF(參考范圍：0%～2.50%)、HbJ(參考范圍：0%)等。以上實(shí)驗(yàn)均按照儀器和試劑說(shuō)明書(shū)操作。

1.5外周血DNA提取 取各患者2～3 mL外周血，按照MN外周血全基因組柱提法試劑盒說(shuō)明書(shū)操作提取外周血DNA。使用NanodropND-1000紫外分光光度計(jì)進(jìn)行DNA濃度和純度測(cè)定。取濃度為20～100 ng/μL，吸光度(A260/280 nm)為1.8～2.2的樣本用于后續(xù)試驗(yàn)，樣本置于-20 ℃保存。

1.6常規(guī)地中海貧血基因檢測(cè) 按照地中海貧血(α/β)基因檢測(cè)試劑盒(PCR-流式熒光雜交法)及Luminex MagPix多功能液相懸浮芯片系統(tǒng)說(shuō)明書(shū)操作對(duì)包括α-珠蛋白基因3種缺失(--SEA、-α3.7和-α4.2)、3種突變(WS122、QS125和CS142)，β-珠蛋白基因17種突變(包括CD41-42、IVS-Ⅱ-654、CD17、-28、CD26、CD71-72、CD43、-29、Int、CD14-15、CD27-28、-32、-30、IVS-Ⅰ-1、IVS-Ⅰ-5、CD31和Cap)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果判讀參照試劑盒說(shuō)明書(shū)及參考文獻(xiàn)[7]進(jìn)行。

1.7α/β-珠蛋白基因測(cè)序 根據(jù)GenBank中β-珠蛋白基因(HBB)的序列號(hào)(NG_000007.3)，使用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)3對(duì)引物擴(kuò)增β-珠蛋白基因3個(gè)外顯子(引物序列見(jiàn)表1)，引物由英濰捷基(上海)公司合成；PCR擴(kuò)增體系為50 μL，包括TaKaRa LA Taq體系：LA Taq酶0.5 μL，10×LA Taq Buffer Ⅱ(Mg2+Plus)5 μL，dNTP Mixture 8 μL，引物各1 μL，基因組DNA 50 ng，滅菌水28 μL。PCR循環(huán)參數(shù)：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。取PCR產(chǎn)物送往英濰捷基(上海)貿(mào)易公司進(jìn)行基因測(cè)序，所用儀器為ABI 3500XL一代測(cè)序儀，采用Sequence Scanner軟件將所測(cè)序列片段[NG_000007.3 REGION:complement(5225344..5227106)]與HBB標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)。

表1 β-珠蛋白基因測(cè)序引物序列

2 結(jié)果

2.1毛細(xì)管電泳和血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果 9例患者均檢出β珠蛋白基因c.170 G>A突變(codon 56 GGC>GAC)，為異常血紅蛋白Hb J-Bangkok，其紅細(xì)胞參數(shù)Hb、MCV和MCH正?；蜉p度異常；結(jié)果見(jiàn)圖1和表2。

注：A，患者1的血紅蛋白電泳結(jié)果(雜合Hb J-Bangkok)；B，患者9的血紅蛋白電泳結(jié)果(純合Hb J-Bangkok)；橫坐標(biāo)，各組分血紅蛋白電泳時(shí)間；縱坐標(biāo)，血紅蛋白相對(duì)含量。

圖1 血紅蛋白毛細(xì)管電泳結(jié)果

表2 9例異常血紅蛋白Hb J-Bangkok 血細(xì)胞參數(shù)和血紅蛋白電泳結(jié)果

注：RDW，紅細(xì)胞分布寬度；HETE，雜合子(heterozygote)；HOMO，純合子(homozygote)。

2.2常規(guī)地中海貧血基因檢測(cè)結(jié)果 9 例患者的DNA經(jīng)過(guò)液相芯片檢測(cè)，其中8例常規(guī)地中海貧血基因檢測(cè)結(jié)果均為陰性，另1例男性患者的基因型為αQSα/αα，為Hb J-Bangkok合并α-地中海貧血。

2.3α/β-珠蛋白基因測(cè)序結(jié)果 9例樣本測(cè)序結(jié)果顯示β珠蛋白基因c.170 G>A 突變(codon 56 GGC>GAC)，其中1例女性為c.170 G>A 純合突變(homo codon 56 GGC>GAC)，為異常血紅蛋白Hb J-Bangkok。測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖2。

注：A，患者9異常血紅蛋白Hb J-Bangkok(箭頭所示為HBB:c.170 G>A,codon 56 GGC>GAC,HOMO)；B，患者1異常血紅蛋白Hb J-Bangkok(箭頭所示為HBB:c.170 G>A,codon 56 GGC>GAC,HETE)。

圖2 異常血紅蛋白J-Bangkok測(cè)序結(jié)果

3 討論

臨床上常用反相高效液相色譜(RP-HPLC)和賽比亞毛細(xì)管電泳(Sebia capillary)方法分析并發(fā)現(xiàn)特異性的異常血紅蛋白，根據(jù)電泳時(shí)異常帶出現(xiàn)的位置對(duì)異常血紅蛋白進(jìn)行分組[8-9]。Hb J-Bangkok在血紅蛋白電泳時(shí)見(jiàn)于J組，是一種快速的異常血紅蛋白。由于同一電泳區(qū)帶內(nèi)可包含多種血紅蛋白，單純的電泳不能區(qū)分其具體的類型，仍需要通過(guò)珠蛋白基因序列分析來(lái)鑒定。地中海貧血是一組遺傳性溶血性貧血疾病，輕癥患者一般無(wú)明顯臨床癥狀，中度或重度患者需要終身輸血治療或者胎死宮內(nèi)。由于異常血紅蛋白與地中海貧血臨床表現(xiàn)相似，通過(guò)常規(guī)血液學(xué)分析難以區(qū)分，故需要使用基因序列分析[10]。有報(bào)道顯示異常血紅蛋白合并地中海貧血時(shí)可加重患者的臨床癥狀[4,11]，也有報(bào)道認(rèn)為異常血紅蛋白合并地中海貧血表現(xiàn)為單純的地中海貧血癥狀[12]，故而多種因素引起的臨床貧血癥狀需要綜合分析。

目前,在我國(guó)所發(fā)現(xiàn)的異常血紅蛋白中，最為常見(jiàn)的是血紅蛋白分子外部氨基酸發(fā)生替代，Hb J-Bangkok即為其中一種。它是由于β血紅蛋白基因點(diǎn)突變導(dǎo)致所編碼的血紅蛋白β鏈56位氨基酸發(fā)生改變，由天門(mén)冬氨酸取代了正常的甘氨酸。這種改變并不影響血紅蛋白分子的功能和穩(wěn)定，且攜帶氧氣的能力也未降低，因而推測(cè)單純的Hb J-Bangkok沒(méi)有貧血等血液學(xué)的改變。本研究檢測(cè)的7例單純的Hb J-Bangkok攜帶者中，5例血液學(xué)參數(shù)均正常，無(wú)貧血等臨床表現(xiàn)，這與上述推測(cè)的結(jié)論相同[4]，也與先前文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相似[13]。與以上5例攜帶者不同的是其他2例女性攜帶者有輕度貧血的癥狀，其中病例1提示為明顯降低的血清鐵蛋白(FER：3.42 ng/mL)，診斷為缺鐵性貧血[14]。另一病例為有雙胎的孕婦，考慮有生理性貧血的可能。本研究發(fā)現(xiàn)1例HBB:c.170 G>A 純合突變的病例，血紅蛋白電泳顯示高達(dá)97.3%的Hb J，而無(wú)成人正常的血紅蛋白HbA?；颊咧挥休p度降低的血紅蛋白量,其他相關(guān)血液學(xué)指標(biāo)均正常，表明純合的Hb J Bangkok的患者也僅有輕度貧血的臨床表現(xiàn)。此例純合的Hb J-Bangkok病例為國(guó)內(nèi)首次報(bào)道。此外還有1例男性患者為輕度α地貧(αQSα/αα)合并Hb J-Bangkok，其相關(guān)血液學(xué)指標(biāo)與輕度α地貧相似，顯示合并Hb J-Bangkok時(shí)并不顯著影響輕度α地貧患者的血液學(xué)表現(xiàn)。

綜上所述，本研究對(duì)異常血紅蛋白Hb J Bangkok血液學(xué)特征的分析，有助于增強(qiáng)和提高我們對(duì)常見(jiàn)異常血紅蛋白的認(rèn)識(shí)和重視，對(duì)遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷也可以具有參考價(jià)值。然而，本研究中缺少Hb J-Bangkok合并β地貧的病例的總結(jié)和分析，相關(guān)病例的報(bào)道和文獻(xiàn)也較少，故而無(wú)法對(duì)Hb J-Bangkok對(duì)地貧的影響做一個(gè)全面的分析。今后我們將繼續(xù)收集病例，完善資料，進(jìn)行更深入的相關(guān)研究。