杜小梅 呂建寧 李雯

肺癌是最常見的癌癥形式，也是全世界癌癥相關(guān)性死亡的主要原因[1]。非小細(xì)胞肺癌是肺癌最常見的腫瘤類型，約占肺癌患者總數(shù)的85%左右[2]。目前，有關(guān)非小細(xì)胞肺癌的早期診斷和治療仍是我國乃至世界迫切需要解決的一個(gè)難題。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類可參與腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、凋亡等多個(gè)層面調(diào)控的不編碼蛋白質(zhì)的RNA[3-4]。最近有研究通過芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)lncRNA EXOC7在肺癌、肝癌、宮頸癌等多種惡性腫瘤腫表達(dá)異常[5-7]，但尚未有研究加以進(jìn)一步驗(yàn)證。因此，本研究采用實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR)方法檢測(cè)了lncRNA EXOC7在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)情況，并進(jìn)一步分析了其表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

資料與方法

一、臨床資料

本研究納入2015年1月至2018年5月收治的75例非小細(xì)胞肺癌患者，其中男性43例，女性32例，年齡38～84歲，中位年齡59歲。所有患者均經(jīng)病理學(xué)確診為原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌，入組前未接受任何放化療等治療，均接受手術(shù)治療，將術(shù)中取出的新鮮非小細(xì)胞肺癌組織的二分之一及對(duì)應(yīng)癌旁組織放入液氮冷凍處理，并于-80℃保存待測(cè)，另外二分之一的癌組織放入福爾馬林中保存，制作成蠟塊待用。

二、qRT-PCR法檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌組織及癌旁組織中l(wèi)ncRNA EXOC7的表達(dá)

將50 mg左右組織樣本進(jìn)行超聲勻漿，參照Trizol試劑盒(Thermo Fisher公司)操作說明書提取組織總RNA，DEPC水溶解，應(yīng)用Nanodrop 2000超微量分光光度計(jì)(Thermo Fisher公司)檢測(cè)總RNA的純度及濃度。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司)操作說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系為20 μL：總RNA 1 μL、PrimeScript RTase 1 μL、dNTP Mixture 1 μL、5×PrimeScript Buffer 0.5 μL、5×PrimeScript Buffer 4 μL、Oligo dT Primer 1 μL，DEPC水補(bǔ)至20μL。反應(yīng)條件：25 ℃ 10 min，37℃ 40 min，90℃ 5 min，產(chǎn)物置于4℃保存待用。根據(jù) Genebank數(shù)據(jù)庫中l(wèi)ncRNA EXOC7參考序列設(shè)計(jì)用于實(shí)時(shí)定量 PCR 的引物，并以GAPDH 作為內(nèi)參。lncRNA EXOC7引物序列：上游引物5′-CTGGGATCAGAGAGCAAAGG-3′，下游引物5′-CTGTAGAAAGGCCCCG-3′；GAPDH 引物序列：上游引物5′-CTCAGACACCATGGGGAAGGTGA-3′，下游引物5′-ATGATCTT2GAGGCTGTTGTCATA-3′。參照實(shí)時(shí)定量 PCR試劑盒(Takara公司)操作說明書進(jìn)行操作，反應(yīng)體系為25 μL：cDNA模板 2 μL、上下游引物各 1 μL、2×SYBR Premix Ex Taq 12.5 μL，滅菌蒸餾水補(bǔ)至25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 1 min預(yù)變性，95℃ 20s，55℃ 30s，72℃ 30s，35個(gè)循環(huán)。采用2-△△CT方法計(jì)算目的基因的表達(dá)水平，每組取三個(gè)復(fù)孔均值，目的基因相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCt值(目的基因)- 2-ΔΔCt值(GAPDH)。

三、隨訪

隨訪起點(diǎn)為手術(shù)日期，隨訪截止2019年5月 31 日，患者的隨訪時(shí)間為12～40個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為28個(gè)月，隨訪主要為電話隨訪和門診隨訪兩種方式，隨訪內(nèi)容包括一般情況、臨床癥狀及影像學(xué)檢查。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、lncRNA EXOC7在非小細(xì)胞肺癌及癌旁組織中的表達(dá)

非小細(xì)胞肺癌組織中l(wèi)ncRNA EXOC7的相對(duì)表達(dá)水平(7.88±1.04)明顯高于癌旁組織(1.33±0.79)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(見圖1)。

圖1 lncRNA EXOC7在非小細(xì)胞肺癌及癌旁組織中的表達(dá)

二、非小細(xì)胞肺癌組織中l(wèi)ncRNA EXOC7的表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

不同性別、年齡、病理類型、組織分化程度的非小細(xì)胞肺癌患者組織中l(wèi)ncRNA EXOC7的表達(dá)無明顯差異性(P>0.05)，但不同TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況與非小細(xì)胞肺癌患者組織中l(wèi)ncRNA EXOC7的表達(dá)存在顯著差異性(P<0.05)(見表1)。

表1 非小細(xì)胞肺癌組織中l(wèi)ncRNA EXOC7的表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

三、非小細(xì)胞肺癌組織中l(wèi)ncRNA EXOC7的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

根據(jù)75例非小細(xì)胞肺癌患者癌組織中l(wèi)ncRNA EXOC7的表達(dá)水平，將其分為高表達(dá)組(≥7.88)和低表達(dá)組(<7.88)，其中高表達(dá)組29例，占36.11%，低表達(dá)組46例，占63.89%。高表達(dá)組無進(jìn)展生存期[(10.09±1.93)個(gè)月]明顯短于低表達(dá)組[(19.77±2.16)個(gè)月]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見圖2)。高表達(dá)組總生存期[(14.82±2.05)個(gè)月]明顯短于低表達(dá)組[(26.18±2.87)個(gè)月]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見圖3)。

討 論

非小細(xì)胞肺癌是一種嚴(yán)重危害人們健康的惡性腫瘤，國內(nèi)外的發(fā)病率和死亡率均位居前列，盡管醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域發(fā)展迅猛，但非小細(xì)胞肺癌的總體療效仍不盡如人意[8-9]。因此，深入探究非小細(xì)胞肺癌的分子生物學(xué)特點(diǎn)及其可能的發(fā)病機(jī)制，對(duì)于探尋新的治療靶點(diǎn)意義重大。

圖2 lncRNA EXOC7表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者無進(jìn)展生存期的關(guān)系

圖3 lncRNA EXOC7表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者總生存期的關(guān)系

由于lncRNA是一類不編碼蛋白質(zhì)的RNA，在發(fā)現(xiàn)初期并未獲得足夠重視，然而，隨著研究的不斷深入，科研人員們開始發(fā)現(xiàn)lncRNA可在表觀遺傳學(xué)、基因組轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后水平等多個(gè)層面上調(diào)控基因的表達(dá)[10-11]。值得注意的是，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)lncRNA在腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、凋亡等多個(gè)方面發(fā)揮重要的調(diào)控作用[12-14]。盡管目前在非小細(xì)胞肺癌中發(fā)現(xiàn)了多種lncRNA[15-16]，但迄今為止，lncRNA與非小細(xì)胞肺癌的關(guān)系尚不明確。最近有研究通過芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)lncRNA EXOC7在包括非小細(xì)胞肺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤腫表達(dá)異常[17]，但尚未有研究加以進(jìn)一步驗(yàn)證。因此，我們猜想lncRNA EXOC7有可能成為非小細(xì)胞肺癌治療的新的突破口。

本研究結(jié)果顯示，非小細(xì)胞肺癌組織中l(wèi)ncRNA EXOC7的相對(duì)表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，表明lncRNA EXOC7在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)上調(diào)。我們進(jìn)一步分析了lncRNA EXOC7表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者臨床病理特征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同性別、年齡、病理類型、組織分化程度的非小細(xì)胞肺癌患者組織中l(wèi)ncRNA EXOC7的表達(dá)無明顯差異性(P>0.05)，但不同TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況與非小細(xì)胞肺癌患者組織中l(wèi)ncRNA EXOC7的表達(dá)存在顯著差異性(P<0.05)，表明lncRNA EXOC7的表達(dá)與的發(fā)生及轉(zhuǎn)移有關(guān)，其可能在非小細(xì)胞肺癌中發(fā)揮促癌作用。

本研究進(jìn)一步分析了lncRNA EXOC7表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)lncRNA EXOC7高表達(dá)組無進(jìn)展生存期明顯短于低表達(dá)組，并且總生存期也明顯短于低表達(dá)組，表明lncRNA EXOC7高表達(dá)，可能與非小細(xì)胞肺癌患者的不良預(yù)后有關(guān)。

綜上所述，lncRNA EXOC7在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)上調(diào)，其可能作為一種促癌因子參與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生及發(fā)展過程，并與患者的不良預(yù)后有關(guān)。但有關(guān)lncRNA EXOC7調(diào)節(jié)非小細(xì)胞肺癌患者發(fā)生發(fā)展的具體作用機(jī)制仍需今后進(jìn)一步深入探討。