林秀華 葉嘉 張雷 周曉 賴國祥 陳雨燕

自基因芯片技術(shù)應(yīng)用于分枝桿菌的菌種鑒定后，逐漸成為臨床診斷結(jié)核病與非結(jié)核分枝桿菌病的一項(xiàng)新技術(shù)。與傳統(tǒng)方法相比，基因芯片技術(shù)具有快速、簡便、高靈敏度、高特異性、重復(fù)性好、通量高等優(yōu)勢[1-2]；胸腔積液IFN-γ水平已被證實(shí)在結(jié)核性胸膜炎患者中具有一定的診斷價(jià)值[3-4]。本研究探討胸腔積液中基因芯片技術(shù)檢測分枝桿菌和IFN-γ測定對結(jié)核性胸膜炎的診斷價(jià)值。

資料與方法

一、臨床資料

1 研究對象 選取2013年9月至2016年11月福建省福州肺科醫(yī)院及中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第900醫(yī)院收治的260例胸腔積液患者為研究對象，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。其中經(jīng)胸膜活檢、胸腔鏡活檢及實(shí)驗(yàn)室檢查確診為結(jié)核性胸腔積液者120例，非結(jié)核性胸腔積液140例。兩組年齡、性別等一般資料具有可比性(P>0.05)(見表1)。

表1 兩組患者一般資料比較(n,%)

2 診斷標(biāo)準(zhǔn) (1)結(jié)核性胸膜炎(TPE)符合中華醫(yī)學(xué)會結(jié)核病學(xué)分會頒布的《肺結(jié)核診斷和治療指南》[5]中有關(guān)結(jié)核性胸膜炎診斷標(biāo)準(zhǔn)，符合至少以下3條標(biāo)準(zhǔn)者：①有發(fā)熱、盜汗、乏力、消瘦等結(jié)核中毒癥狀及咳嗽、胸痛、胸悶、氣促等；②超聲、X線胸片或胸部CT證實(shí)有可抽取的胸腔積液；③胸水檢出抗酸桿菌；④胸膜活檢病理提示結(jié)核肉芽腫；⑤胸部影像學(xué)提示結(jié)核病灶；⑥抗結(jié)核治療2個月后癥狀改善，胸水較前吸收；⑦治療后隨訪半年無復(fù)發(fā)。(2)惡性胸腔積液組 影像學(xué)檢查提示有胸腔積液，胸膜活檢病理提示惡性病變，或者經(jīng)皮肺穿刺活檢或支氣管鏡檢查證實(shí)為肺癌，且胸水脫落細(xì)胞中可見惡性細(xì)胞(≥2次)。(3)類肺炎性胸腔積液組：患者有咳嗽、咳痰、發(fā)熱、胸痛等癥狀，影像學(xué)檢查可見肺部斑點(diǎn)、斑片、片狀實(shí)變影，邊界模糊，血白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞升高，胸水培養(yǎng)見細(xì)菌，抗感染治療后胸水明顯吸收。

3 排除標(biāo)準(zhǔn) ①嚴(yán)重心、肝、腎等臟器疾病者；②排除糖尿病、自身免疫性疾病等影響免疫功能的疾??；③并發(fā)其他特殊感染，如人類免疫缺陷病毒等；④治療前4周內(nèi)未使用激素及免疫抑制劑；⑤妊娠及哺乳期婦女；⑥伴有認(rèn)知功能障礙者。

二、方法

1 主要儀器及試劑 IFN-γ試劑盒(武漢基因美科技有限公司)、北京博奧生物有限公司生產(chǎn)的分枝桿菌菌種鑒定芯片及Lux ScanTM10K/B 微陣列芯片掃描儀等配套儀器。

2 標(biāo)本收集及指標(biāo)檢測 (1)以標(biāo)準(zhǔn)的胸腔穿刺術(shù)或胸腔閉式引流術(shù)，抽取新鮮胸腔積液10 mL，抽出后立即冰浴，4℃離心10 min，取上清液凍存于-80℃冰箱待檢。按照試劑盒說明書采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測受試者胸腔積液中IFN-γ濃度。(2)取胸腔穿刺術(shù)或胸腔閉式引流術(shù)時(shí)留存的胸腔積液標(biāo)本400μL，加入1.5 mL離心管中，加入等量的10%氫氧化鈉，震蕩混勻1～3 min，室溫靜置15 min。然后按基因芯片試劑盒說明書的操作流程順序進(jìn)行，包括核酸提取、PCR擴(kuò)增、芯片雜交、芯片洗滌、芯片掃描。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、各組患者胸腔積液中IFN-γ水平

1 各組患者胸腔積液中的IFN-γ水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中結(jié)核性胸膜炎組患者胸腔積液中IFN-γ水平明顯高于其他2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(見表2)。

表2 各組患者胸腔積液中IFN-γ水平

2 胸腔積液中IFN-γ對結(jié)核性胸膜炎的診斷價(jià)值 胸腔積液中IFN-γ的ROC曲線(見圖1)。以58.0pb/ng·L-1為最佳臨界值，ROC曲線下面積(area under curve, AUC)為0.98，敏感度為78.2%，特異度為94.4%。

二、各組患者胸腔積液中基因芯片法測分枝桿菌結(jié)果

應(yīng)用基因芯片法檢測各組患者胸腔積液中分枝桿菌，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.351,P=0.309)(見表3)。

圖1 胸腔積液中IFN-γ的ROC曲線

表3 基因芯片法測各組胸腔積液中分枝桿菌結(jié)果(例)

討 論

分析胸腔積液中IFN-γ對結(jié)核性胸膜炎的診斷價(jià)值時(shí)發(fā)現(xiàn)：胸水IFN-γ 診斷結(jié)核性胸膜炎的ROC曲線下面積為0.98，敏感度為78.2%，特異度為94.4%，提示胸腔積液中IFN-γ的濃度是結(jié)核性胸膜炎與其他原因引起的胸腔積液鑒別時(shí)的一個有用的指標(biāo)。但綜合國內(nèi)外研究[13]可以發(fā)現(xiàn)各研究中胸腔積液的IFN-γ濃度差別較大，導(dǎo)致其敏感性、特異性也有差異，可能與疾病所處的病程及嚴(yán)重程度不同有關(guān)，因?yàn)橥环N疾病的不同階段產(chǎn)生的細(xì)胞因子濃度可能不同；也可能與選取的對照組人群不同有關(guān)。另外，不同研究對象對結(jié)核分枝桿菌的免疫應(yīng)答可能也存在個體差異。故仍需積極探索、尋找其他簡便、安全、敏感、特異性高、重復(fù)性好的免疫生物學(xué)標(biāo)記物，以期在臨床上開展聯(lián)合檢測，提高敏感度及特異性，爭取早期診斷，從而改善患者預(yù)后。

基因芯片法的基本原理是首先將檢測菌的DNA/RNA提取出來，對樣品中的靶基因進(jìn)行擴(kuò)增和熒光標(biāo)記，將靶基因與芯片上的探針進(jìn)行反向斑點(diǎn)雜交反應(yīng)，最后芯片掃描成像，用配套軟件進(jìn)行判讀。根據(jù)探針在芯片上的特定位置排布，推斷出相應(yīng)被測細(xì)菌的相關(guān)信息，具有靈敏度高、特異性好、快速簡便、可重復(fù)性強(qiáng)、高通量等優(yōu)點(diǎn)，為結(jié)核性胸膜炎的早期快速診斷提供了一種新的思路。但本研究結(jié)果顯示，結(jié)核性胸膜炎組患者應(yīng)用基因芯片法檢測胸腔積液分枝桿菌與惡性胸腔積液組及類肺炎性胸腔積組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，筆者推測可能跟結(jié)核性胸膜炎的發(fā)病主要為遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)及局部免疫應(yīng)答有關(guān)，與臨床上結(jié)核性胸腔積液涂片找抗酸桿菌、結(jié)核菌培養(yǎng)及結(jié)核桿菌DNA多為陰性一致，確切機(jī)制有待于將來更大樣本量更深入的研究。根據(jù)目前的研究結(jié)果，筆者不建議將基因芯片法行胸腔積液分枝桿菌菌種鑒定應(yīng)用于結(jié)核性胸膜炎的診斷中。

綜上所述，胸腔積液中IFN-γ檢測可作為鑒別結(jié)核性胸膜炎的一種免疫生物學(xué)標(biāo)志物，但基因芯片法行胸腔積液分枝桿菌菌種鑒定對結(jié)核性胸膜炎的診斷價(jià)值尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。