吳 鵬，史 銳，鄒長鑫，劉苗苗

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110000)

黑果腺肋花楸(Aroniamelanocarpa)，又稱野櫻莓、不老莓，屬于薔薇科腺肋花楸屬植物，果實為紫黑色圓形小漿果，富含蛋白質(zhì)、糖類、有機酸、微量元素、多酚類化合物等，其中黃酮，花青素、原花青素和酚酸等多酚類物質(zhì)發(fā)揮著最主要的生理活性[1]，具有極強的清除自由基的能力，此外還可以調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，有效預(yù)防和治療糖尿病、動脈粥樣硬化等[2-3]。

綠原酸屬于酚類化合物，具有抗菌、抗病毒、保肝利膽等多種藥理作用[4]，被稱為第七大營養(yǎng)素[5]。因綠原酸所具有的獨特生物活性，其已經(jīng)廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域[6-7]。但國內(nèi)對黑果腺肋花楸中綠原酸含量的相關(guān)研究較少，且關(guān)于其含量測定方法的介紹并不詳細。本實驗采用超聲法提取黑果腺肋花楸果實中的綠原酸，并在料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間、提取溫度單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用正交試驗優(yōu)化其提取工藝，為黑果腺肋花楸果實的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

黑果腺肋花楸果實(遼寧華嵿農(nóng)業(yè)科技有限公司)；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品(北京索萊寶試劑有限公司)；甲醇、無水乙醇、鹽酸均為國產(chǎn)分析純。

UV5100紫外可見-分光光度計；KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器；精密分析天平；FW100高速萬能粉碎機；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱。

2 實驗方法

2.1 原料前處理

于-80 ℃冰箱中取出黑果腺肋花楸果實，蒸餾水解凍過夜，45 ℃烘干，打粉過五號篩備用。

2.2 黑果腺肋花楸果實中綠原酸樣品制備

精密稱取黑果腺肋花楸果實粗粉1 g，精密加入25 mL 60%乙醇-鹽酸溶液，稱重，45 ℃條件下超聲提取60 min，放冷，加相應(yīng)溶劑補足重量，搖勻抽濾，得待測樣品粗提液。

2.3 黑果腺肋花楸果實中綠原酸含量測定

2.3.1 波長掃描 精密吸取一定量待測樣品提取液，采用紫外分光光度計在200～800 nm范圍內(nèi)進行全波長掃描，確定綠原酸的最大吸收波長為297 nm。

2.3.2 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制精密稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品0.003 g，采用甲醇-鹽酸溶液定容至100 mL容量瓶中，分別精密吸取0、0.06、0.12、0.18、0.24、0.30、0.36、0.42 mL母液定容至10 mL容量瓶。在波長297 nm處測定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度(A)值，以綠原酸質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3.3 綠原酸含量測定 移液槍吸取一定量待測液，用對應(yīng)溶劑定容至10 mL容量瓶，在297 nm處測定待測液吸光度，根據(jù)回歸方程求出提取液中的綠原酸質(zhì)量濃度(μg/mL)。

2.3.4 綠原酸提取率計算

綠原酸提取率=(V·C·D×10-6)/M×100%

(1)

式中V：提取液定容體積，mL；C：標(biāo)曲求得綠原酸濃度，μg/mL；D：提取液稀釋倍數(shù)；M：黑果腺肋花楸果實樣品質(zhì)量，g。

2.4 黑果腺肋花楸果實中綠原酸提取率的單因素考察

精密稱取1.0 g黑果腺肋花楸果實粉末，對提取溶劑、乙醇分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時間、料液比進行考察，按照“2.3.3”“2.3.4”項下方法計算綠原酸含量及提取率，確定最佳提取條件。

3 結(jié)果與分析

3.1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

線性回歸方程為y=0.08x-0.011(r=0.999 6)，其中x為綠原酸質(zhì)量濃度，y為吸光度值，由圖1可知綠原酸在1.8～12.6 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與其吸光度值具有良好的線性關(guān)系。

圖1綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2 單因素對黑果腺肋花楸果實中綠原酸提取率的影響

3.2.1 溶劑對綠原酸提取率的影響圖2顯示，與水提法相比，乙醇提取法對黑果腺肋花楸果實中綠原酸提取率影響顯著，綠原酸提取率從0.448%提高到0.592%。這是由于綠原酸在酸性介質(zhì)中表現(xiàn)出較強的穩(wěn)定性，然而酸性過高會導(dǎo)致其他雜質(zhì)有機鹽被酸化溶出，故本實驗在2種溶劑中分別加入0.2 mol/L鹽酸溶液。此外，初期對不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶劑進行比較，發(fā)現(xiàn)不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇對綠原酸提取率較大影響。因此需要進一步對不同乙醇體積分?jǐn)?shù)進行考察。

圖2不同提取溶劑對綠原酸得率的影響

3.2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對綠原酸提取率的影響 圖3顯示，乙醇體積分?jǐn)?shù)越高，綠原酸提取率越高，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時，綠原酸提取率達到最大，為0.938%，而后出現(xiàn)下降現(xiàn)象。這是由于綠原酸的極性偏大，高濃度的乙醇不易使其溶解，致使過多脂溶性雜質(zhì)溶出，影響綠原酸提取率。

圖3乙醇體積分?jǐn)?shù)對綠原酸提取率的影響

3.2.3 料液比對黑果腺肋花楸果實中綠原酸提取率的影響 圖4顯示，隨著料液比的增加，綠原酸提取率逐漸從0.837%提高至0.908%，在1∶45(g/mL)達到最大，而后隨著料液比的增加，綠原酸提取率下降至0.769%。這是由于在一定范圍內(nèi)溶劑越多，樣品與原料接觸更充分，傳質(zhì)作用越強，綠原酸提取率增大，但溶劑過多會致使醇溶性蛋白等雜質(zhì)溶出，影響綠原酸提取率。

3.2.4 提取溫度對綠原酸提取率的影響圖5顯示，隨著溫度的升高，綠原酸提取率逐漸升高，在55 ℃時達到最大，為1.064%。當(dāng)溫度達到60 ℃時，綠原酸提取率有所下降。因這是由于溫度升高會發(fā)生分子的熱運動現(xiàn)象，分子的動能增加，可促進分子運動與物質(zhì)交換。但溫度過高會致使綠原酸部分分解，影響綠原酸提取率。

圖4料液比對綠原酸提取率的影響

圖5提取溫度對綠原酸提取率的影響

3.2.5 提取時間對綠原酸提取率的影響圖6顯示，隨著提取時間的延長，黑果腺肋花楸果實中綠原酸提取率從0.890%逐漸提高到0.981%，但提取時間達到75 min后，提取率有所下降。這是由于超聲時間短，綠原酸未完全溶出，而超聲時間過長，脂溶性雜質(zhì)溶出增多，可吸附些許綠原酸，此外還可能發(fā)生熱效應(yīng)，致使部分綠原酸分解，影響提取率。

圖6提取時間對綠原酸提取率的影響

3.3 黑果腺肋花楸果實中綠原酸提取工藝條件的優(yōu)化

3.3.1 提取各因素水平的建立 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，確定乙醇濃度、溫度、料液比及超聲時間為主要的影響因素，每個因素設(shè)置3個水平。以黑果腺肋花楸綠原酸提取率為指標(biāo)，采用L9(34)正交試驗篩選最佳的提取工藝，設(shè)計的正交試驗各因素水平范圍見表1。

表1 正交試驗各因素水平設(shè)計

3.3.2 正交試驗結(jié)果與分析 按照上述設(shè)計的因素水平依次進行測定，結(jié)果見表2。

表2 正交試驗設(shè)計及結(jié)果

正交試驗結(jié)果表中R值顯示，影響黑果腺肋花楸果實中綠原酸提取率的因素順序為乙醇分?jǐn)?shù)>提取溫度>提取時間>料液比。K值顯示，提取最優(yōu)組合為A2B1C1D2，即乙醇分?jǐn)?shù)60%，料液比1∶40(g/mL)，提取溫度55 ℃，提取時間60 min。進行3次驗證性實驗，測得綠原酸平均含量為12.13 mg/g，平均提取率為1.187%，RSD為0.07%，與正交表內(nèi)結(jié)果相比，可確定此工藝為最優(yōu)提取工藝，且重復(fù)性好，穩(wěn)定性高。

4 結(jié)論

本實驗確定的黑果腺肋花楸果實中綠原酸的最佳提取工藝為乙醇分?jǐn)?shù)60%，料液比1∶40(g/mL)，提取溫度55 ℃，提取時間60 min，在此提取工藝下進行3次驗證性實驗，測得綠原酸平均含量為12.13 mg/g，平均提取率為1.187%，相較王鵬等[8]報道的綠原酸含量有明顯升高。本研究結(jié)果表明，以60%乙醇加酸性介質(zhì)為溶劑，運用超聲法提取能有效提高黑果腺肋花楸果實中綠原酸的提取率，為黑果腺肋花楸的進一步研究與開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。