吳 琴，鄭傳奎，李文兵，胡昌江，張彩虹

(四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司，四川 成都 611900)

胡蘆巴，又名蕓香草、香豆草，為一年生豆科草本植物，為豆科植物胡蘆巴Trigonellafoenum-graecumL.的干燥成熟種子，喜陰、耐寒，在我國(guó)分布于東北、西南及河北、陜西、甘肅、新疆、山東、江蘇、安徽、浙江、河南、湖北、廣西等地。胡蘆巴具有溫腎助陽(yáng)、祛寒止痛的功效，常用于治療腎臟虛冷、小腹冷痛、小腸疝氣、寒濕腳氣等[1-2]。胡蘆巴中含有甾體皂苷類、黃酮類、三萜類、生物堿類、香豆素類、油脂類等[4-9]化合物，具有抗腫瘤[10]、抗氧化應(yīng)激[11]、補(bǔ)腎壯陽(yáng)、保護(hù)重要器官[12]等作用；同時(shí)胡蘆巴中的纖維及甾體皂苷類成分還分別具有降血糖、降血脂作用[13]。

標(biāo)準(zhǔn)湯劑作為衡量中藥配方顆粒與臨床湯劑是否基本一致的基準(zhǔn)物質(zhì)，其質(zhì)量控制是中藥配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立的重要一環(huán)。在前期文獻(xiàn)[14-15]調(diào)研中發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地胡蘆巴藥材中所含成分種類及活性成分含量都存在著一定差異。這種由于原料差異而導(dǎo)致的藥材質(zhì)量不統(tǒng)一，不僅會(huì)間接影響著中藥配方顆粒的質(zhì)量穩(wěn)定，還會(huì)對(duì)臨床上用藥的準(zhǔn)確性造成干擾。因此，為減少藥材產(chǎn)地帶來(lái)的質(zhì)量差異，本研究對(duì)4個(gè)不同產(chǎn)地的24批胡蘆巴飲片進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備及特征圖譜研究，分析比較各個(gè)產(chǎn)地的胡蘆巴質(zhì)量差異，旨在鑒別胡蘆巴產(chǎn)地和更好地控制胡蘆巴標(biāo)準(zhǔn)湯劑及其配方顆粒的質(zhì)量穩(wěn)定，為不同產(chǎn)地胡蘆巴標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters Acquity H-class型超高效液相色譜儀(美國(guó)Waters科技有限公司)；Agilent 1260型高效液相色譜(HPLC)儀(美國(guó)安捷倫科技有限公司)；電子分析天平ME204E/02、MS205DU、XP26(梅特勒-托利多儀器有限公司)；超純水機(jī)細(xì)胞型1810A(上海摩勒科學(xué)儀器有限公司)；超聲波清洗器KQ5200DB型(600W，40kHz，昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 材料

牡荊素對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111687-201704，純度：94.9%)；異葒草苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111974-201401，純度：94.0%)；胡蘆巴堿對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110883-201604，純度：78.4%)；24批胡蘆巴標(biāo)準(zhǔn)湯劑(四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司)；乙腈、甲醇(色譜純，西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司)；冰乙酸(色譜純，成都市科隆化學(xué)試劑有限公司)；甲醇(分析純，成都市科隆化學(xué)試劑有限公司)；水為超純水。24批藥材、飲片及標(biāo)準(zhǔn)湯劑信息見(jiàn)表1。

表1 24批胡蘆巴飲片產(chǎn)地信息

2 方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備

取胡蘆巴飲片100 g，加水煎煮2次，一煎加10倍水，浸泡30 min，煮沸，保持微沸煎煮60 min，200目篩網(wǎng)過(guò)濾，立即冷卻至室溫；二煎加8倍水，煮沸，保持微沸煎煮40 min，200目篩網(wǎng)過(guò)濾，合并兩次水煎液，立即冷卻至室溫，濃縮、冷凍干燥，分裝，即得。

2.2 胡蘆巴堿含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 采用Waters Acquity H-class型超高效液相色譜儀，Agilent5 Tc-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以甲醇-0.05%十二烷基磺酸鈉溶液-冰醋酸(20∶80∶0.1)為流動(dòng)相等度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為265 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。

2.2.2 溶液制備 (1)供試品溶液制備：取本品粉末(過(guò)三號(hào)篩)約0.2 g，精密稱定，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，稱定重量，放置1 h，超聲處理(功率300 W，頻率50 kHz)45 min，放冷，密塞，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

(2)對(duì)照品溶液制備：取胡蘆巴堿對(duì)照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1 mL含60.0 μg胡蘆巴堿的溶液，即得。

2.2.3 方法學(xué)考察(1)線性關(guān)系：取胡蘆巴堿對(duì)照品溶液母液(59.68 μg/mL)，分別精密吸取對(duì)照品溶液2 μL、5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、30 μL注入液相色譜儀，分析得到峰面積積分。以進(jìn)樣量(X，μg)為橫坐標(biāo)，峰面積積分(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y=2E+06x+29880(R2=0.999)，可知胡蘆巴標(biāo)準(zhǔn)湯劑線性范圍為0.119 4～1.790 4 μg。

(2)精密度。取同一份胡蘆巴堿對(duì)照品溶液，按照“2.2.1”項(xiàng)下條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄胡蘆巴堿的峰面積，計(jì)算RSD值，結(jié)果RSD=0.42%<2.0%，說(shuō)明該液相色譜儀的精密度良好。

(3)重復(fù)性。取供試品(批號(hào)：HLBBT180723)0.2 g，精密稱定6份，由同一操作人員按照“2.2.2”項(xiàng)下的方法制成供試品溶液，按照“2.2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣，計(jì)算6份供試品中胡蘆巴堿的含量，結(jié)果RSD=1.41%<2.0%，表明本方法重復(fù)性良好。

(4)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。取同一供試品溶液(批號(hào)：HLBBT1-80723)，分別于放置0 h、4 h、6 h、10 h、14 h、18 h、24 h后進(jìn)樣測(cè)定胡蘆巴堿的峰面積。結(jié)果表明，在本實(shí)驗(yàn)條件下，胡蘆巴堿峰面積的RSD值為0.97%<2.0%，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

圖1胡蘆巴標(biāo)準(zhǔn)湯劑中胡蘆巴堿色譜

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.2.4 含量測(cè)定以24批胡蘆巴標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉為供試品，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按照“2.2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算胡蘆巴堿的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.3 特征圖譜建立

2.3.1 色譜條件 采用ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×50 mm)色譜柱，以乙腈-甲醇(3∶1)為流動(dòng)相A，以0.2%冰乙酸溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫(0～34 min，A：9.5%→13%；34～55 min，A：13%→30%；55～65 min，A：30%)，檢測(cè)波長(zhǎng)為339 nm，流速為0.3 mL/min，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量為1 μL。

2.3.2 溶液制備(1)供試品溶液制備。取本品約0.2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率600 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

(2)參照物溶液制備。取牡荊素、異葒草苷對(duì)照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1 mL含牡荊素30.0 μg、異葒草苷15.0 μg的溶液，即得。

2.3.3 方法學(xué)考察 (1)精密度。取胡蘆巴標(biāo)準(zhǔn)湯劑(批號(hào)：HLBBT180723)凍干粉粉末，按照“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.3.1”項(xiàng)下方法連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積。結(jié)果各特征峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD在0.16%～2.16%之間，特征峰相對(duì)峰面積的RSD在1.92%～4.92%之間，表明該儀器精密度良好。

(2)重復(fù)性。取胡蘆巴標(biāo)準(zhǔn)湯劑(批號(hào)：HLBBT180723)凍干粉粉末，按照“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.3.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積。結(jié)果各特征峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD在0.11%～0.60%之間，特征峰相對(duì)峰面積的RSD在1.48%～8.07%之間，表明該方法重復(fù)性良好。

(3)穩(wěn)定性考察。取胡蘆巴標(biāo)準(zhǔn)湯劑(批號(hào)：HLBBT1-80723)凍干粉粉末，按照“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于放置0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、24 h時(shí)按照“2.3.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果相對(duì)應(yīng)的特征峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD在0.24%～2.58%之間，特征峰相對(duì)峰面積的RSD為0.81%～9.25%，說(shuō)明樣品溶液在24 h內(nèi)較穩(wěn)定。

(4)特征圖譜建立及相似度評(píng)價(jià)。取24批不同產(chǎn)地的胡蘆巴標(biāo)準(zhǔn)湯劑粉末，按照“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.3.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣測(cè)定。采用中藥色譜特征圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)軟件對(duì)24批樣品進(jìn)行特征圖譜分析，計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積比值及相似度。

3 結(jié)果

3.1 含量測(cè)定結(jié)果

按擬定的方法對(duì)24批胡蘆巴標(biāo)準(zhǔn)湯劑中胡蘆巴堿的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。4個(gè)產(chǎn)地胡蘆巴標(biāo)準(zhǔn)湯劑中胡蘆巴堿的含量范圍為1.58%～2.12%，平均含量為1.85%。通過(guò)計(jì)算不同產(chǎn)地批次胡蘆巴中胡蘆巴堿含量的平均值可知，4個(gè)產(chǎn)地胡蘆巴標(biāo)準(zhǔn)湯劑中胡蘆巴堿含量并無(wú)明顯差異。

3.2 特征圖譜分析

利用中藥色譜特征圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)軟件對(duì)24批標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品進(jìn)行匹配，根據(jù)相對(duì)保留時(shí)間穩(wěn)定及各批次樣品均能檢出峰且該峰相對(duì)較高的原則，共標(biāo)定了10個(gè)重復(fù)性較好的峰作為特征共有峰，其相似度均大于0.95，結(jié)果見(jiàn)表4、表5。經(jīng)過(guò)與對(duì)照品進(jìn)行指認(rèn)，確認(rèn)2個(gè)峰，即峰10為異葒草苷，峰13為牡荊素，如圖2所示。24批樣品的特征圖譜及其對(duì)照?qǐng)D譜見(jiàn)圖3和圖4，相對(duì)保留時(shí)間及其相對(duì)峰面積見(jiàn)表6和表7。

表3 24批胡蘆巴標(biāo)準(zhǔn)湯劑含量測(cè)定結(jié)果

10-異葒草苷；13-牡荊素

圖3 胡蘆巴標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜

圖4 胡蘆巴標(biāo)準(zhǔn)湯劑對(duì)照特征圖譜

表4 2批樣品相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

表5 12批樣品相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

續(xù)表5

樣品相似度S13S14S15S16S17S18S19S20S21S22S23S24S180.9910.9900.9910.9921.0001.0001.0000.9991.0001.0001.0001.000S190.9910.9900.9910.9921.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.000S200.9920.9920.9930.9931.0000.9991.0001.0001.0000.9990.9991.000S210.9920.9920.9920.9931.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.000S220.9900.9900.9900.9911.0001.0001.0000.9991.0001.0001.0001.000S230.9890.9890.9890.9901.0001.0001.0000.9991.0001.0001.0001.000S240.9910.9900.9910.9921.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.000R0.9590.9590.9590.9610.9830.9850.9830.9800.9810.9840.9860.984

表6 24批胡蘆巴標(biāo)準(zhǔn)湯劑相對(duì)保留時(shí)間

表7 24批胡蘆巴標(biāo)準(zhǔn)湯劑相對(duì)峰面積

續(xù)表7

批號(hào)峰5峰6峰8峰9峰10峰11峰13(s)峰14峰23峰24S230.141.060.611.221.780.531.001.190.470.17S240.131.020.601.191.740.471.001.150.460.15平均值0.110.620.591.081.520.491.001.170.320.12RSD(%)20.2672.8939.3043.8141.9530.09/2.0543.5926.39

通過(guò)對(duì)不同產(chǎn)地胡蘆巴標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜進(jìn)行對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地胡蘆巴藥材制備的對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)湯劑所含化學(xué)成分差異較大，其中四川、安徽產(chǎn)地的胡蘆巴標(biāo)準(zhǔn)湯劑化學(xué)成分一致，甘肅、河北產(chǎn)地的胡蘆巴標(biāo)準(zhǔn)湯劑化學(xué)成分一致。除標(biāo)定的峰5、峰6、峰8～峰11及峰13、峰14、峰23、峰24等10個(gè)共有峰之外，共計(jì)差異性成分峰11個(gè)，其中峰1～峰4，峰7、峰12、峰16等7個(gè)峰只存在于甘肅、河北產(chǎn)地的胡蘆巴中，而峰15，峰17～峰19等4個(gè)峰也僅存在于四川、安徽兩地的胡蘆巴中，且部分峰的峰面積差異較大(如峰20、峰22等)，推測(cè)其相應(yīng)的含量也存在一定差異。這可能與文獻(xiàn)[14]報(bào)道的“由于產(chǎn)地的土壤、氣候、海拔、植物生境等條件不同，使胡蘆巴植物次生代謝過(guò)程存在一定差異，導(dǎo)致其不同產(chǎn)地胡蘆巴藥材化學(xué)成分不一致”的結(jié)果相同。

4 討論

中藥特征圖譜在中藥質(zhì)量控制中占有重要地位，其能較全面地反映胡蘆巴標(biāo)準(zhǔn)湯劑中的化學(xué)成分信息，通過(guò)對(duì)這些信息進(jìn)行分析，可以對(duì)樣本質(zhì)量進(jìn)行整體評(píng)估，該方法已成為研究中藥標(biāo)準(zhǔn)湯劑以及中藥配方顆粒的主要途徑。

在本研究初期，筆者對(duì)流動(dòng)相[甲醇-0.1%甲酸，乙腈-0.1%甲酸，乙腈-甲醇(3∶1)-0.1%甲酸、乙腈-甲醇(3∶1)-0.2%冰乙酸，乙腈-甲醇(3∶1)-0.1%磷酸，乙腈-甲醇(3∶1)-0.1%冰乙酸]，波長(zhǎng)(360 nm、280 nm、254 nm、300 nm、339 nm)，柱溫(25、30、35、40 ℃)，流速(0.20 mL/min、0.27 mL/min、0.30 mL/min、0.32 mL/min、0.40 mL/min)等色譜條件進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，以乙腈-甲醇(3∶1)-0.2%冰乙酸為流動(dòng)相，在波長(zhǎng)339 nm、柱溫25 ℃、流速0.3 mL/min的條件下進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，供試品中色譜圖的基線較穩(wěn)且色譜峰的峰形、分離度均較好。在同一色譜條件下，對(duì)供試品溶液制備中的不同提取溶劑(水、50%甲醇、甲醇)和不同提取方式(超聲、回流)進(jìn)行考察。結(jié)果表明，50%甲醇作為提取溶劑時(shí)，所得色譜圖的峰面積較大，分離度良好；回流和超聲提取效果相差不大，為方便操作，選擇超聲作為胡蘆巴標(biāo)準(zhǔn)湯劑的提取方式。

本文參考2015版《中國(guó)藥典》，選擇胡蘆巴堿作為胡蘆巴標(biāo)準(zhǔn)湯劑的指標(biāo)成分。結(jié)果顯示，不同產(chǎn)區(qū)的胡蘆巴標(biāo)準(zhǔn)湯劑中胡蘆巴堿含量相差不大，范圍在1.58%～2.12%之間。同時(shí)，結(jié)合UPLC特征圖譜分析得知，24批次不同產(chǎn)地的胡蘆巴標(biāo)準(zhǔn)湯劑中所含化學(xué)成分既有相似性，也有差異性。在同一色譜條件下，共標(biāo)定共有峰10個(gè)，其中四川、安徽兩產(chǎn)地與甘肅、河北產(chǎn)地的胡蘆巴標(biāo)準(zhǔn)湯劑中差異性成分共計(jì)11個(gè)。通過(guò)建立UPLC特征圖譜可快速、直觀、有效地鑒別出胡蘆巴的產(chǎn)區(qū)，結(jié)合指標(biāo)成分定量研究，為胡蘆巴標(biāo)準(zhǔn)湯劑的內(nèi)在質(zhì)量控制提供了參考依據(jù)，同時(shí)為建立胡蘆巴配方顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了更加全面的研究思路。然而，為能更系統(tǒng)地辨別不同產(chǎn)區(qū)胡蘆巴的質(zhì)量差異，還需對(duì)其差異性成分峰進(jìn)行進(jìn)一步的指認(rèn)和含量測(cè)定研究。