王 豐 王馨悅 朱強(qiáng)龍 楊有新 王 強(qiáng) 吳才君

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，江西 南昌 330045)

自毒物質(zhì)是一種特殊的化感物質(zhì)，來自植株的根系分泌物、雨水淋溶以及殘株腐解[1-2]。采用多種不同生物學(xué)方法測定發(fā)現(xiàn)自毒物質(zhì)對植株自身的生長發(fā)育有一定抑制作用，會對作物連作造成嚴(yán)重障礙[3-6]，這一現(xiàn)象及其作用機(jī)理一直受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。豆類極易發(fā)生連作障礙[7]，豇豆(Vigna unguiculataL.Walp.)作為重要的豆類蔬菜，在世界各地廣泛種植[8-10]。隨著效益農(nóng)業(yè)的發(fā)展，一些蔬菜基地在產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中常年連續(xù)種植豇豆，導(dǎo)致連作障礙問題日益突顯[11-12]。分析自毒物質(zhì)的作用機(jī)理有助于進(jìn)一步探明連作障礙的成因，為深入研究相關(guān)克服途徑提供一定的理論基礎(chǔ)[13]。黃興學(xué)[14]對豇豆連作土壤中自毒物質(zhì)的種類和成分進(jìn)行了鑒定和分析，結(jié)果表明，肉桂酸、苯乙酸、鄰苯二甲酸和4-羥基苯甲酸在連作土壤中的積累是豇豆連作障礙的一個重要因素，且肉桂酸可以通過抑制RuBP 羧化酶活性來影響光合速率。肉桂酸作為豇豆的主要自毒物質(zhì)之一[15]，目前關(guān)于其對豇豆毒害作用的研究主要集中在地上部分，對豇豆根系影響的研究鮮有報道。因此，本試驗選取2個抗性差異的豇豆品種，采用水培法，于營養(yǎng)液中施加一定濃度的肉桂酸，通過測定和分析其根系生理形態(tài)和生理指標(biāo)的變化，探究肉桂酸對豇豆根系的影響，以期為肉桂酸及其他自毒物質(zhì)對豇豆根系毒害作用的深入研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試豇豆為連作障礙抗性品種特早30號(TZ30)和敏感品種紫秋豇6號(ZQJ6)，均由華農(nóng)種業(yè)有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

5810R 離心機(jī)(艾本德，德國)；HI 2315 電導(dǎo)率儀(哈納，意大利)；UV-2600 紫外分光光度計(島津，日本)；LA2400 根系掃描儀(Regent，加拿大)；SPX-50智能生化培養(yǎng)箱(杭州綠博儀器有限公司)；KQ-500B超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.3 試驗方法

整個試驗除發(fā)芽期均在培養(yǎng)室進(jìn)行，光周期為14 h/10 h(day/night)，溫度設(shè)定25℃/20℃(day/night)。選取顆粒飽滿、大小均勻的豇豆種子，溫湯浸種15 min后置于28℃恒溫培養(yǎng)箱催芽。種子發(fā)芽后放入5×10孔的穴盤育苗，培養(yǎng)基質(zhì)為珍珠巖。豇豆長至兩葉一心時選大小一致的幼苗進(jìn)行水培，營養(yǎng)液為霍格蘭改良配方[16]。豇豆長至五葉一心時分4組處理(a～d)，每組2 盆，每盆15株，具體處理為:a 處理:種植TZ30，于營養(yǎng)液中加0.2 mmol·L-1肉桂酸，該濃度的設(shè)定與處理方法參考高旭等[17]的研究；b 處理:種植TZ30，于營養(yǎng)液中加相同體積的無菌水，作為對照組；c 處理:種植ZQJ6，于營養(yǎng)液中加0.2 mmol·L-1肉桂酸；d 處理:種植ZQJ6，于營養(yǎng)液中加相同體積的無菌水，作為對照組。處理36 h 取根系測定電導(dǎo)率、可溶性蛋白含量及抗氧化酶活性，每株為一個重復(fù)，取3個重復(fù)。處理5 d 對其表型拍照并取根系采用根系掃描儀進(jìn)行掃描。電導(dǎo)率采用浸泡法測定[18]，可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250 染色法測定[19]，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)采用氮藍(lán)四唑(nitro-blue tetrazolium，NBT)法[20]測定，過氧化物酶(peroxidase，POD)采用愈創(chuàng)木酚法[21]測定，抗壞血酸過氧化物酶(aseorbateperoxidase，APX)采用分光光度法[22]測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS Statistics 17 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Duncan 法和LSD 法對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和多重比較；采用Origin 8.1 繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 肉桂酸處理對豇豆幼苗根系生長的影響

由圖1可知，0.2 mmol·L-1肉桂酸處理后TZ30和ZQJ6 根系生長均受到了抑制，根系減小發(fā)黃。由表1可知，經(jīng)0.2 mmol·L-1肉桂酸處理后，2種豇豆的總根長、總根表面積、總根體積、總根尖數(shù)均減少，說明肉桂酸對豇豆根系生長有明顯抑制作用。與對照相比TZ30的總根長、總根表面積、總根體積、總根尖數(shù)分別顯著減少59.99%、57.70%、55.28%、38.40%；ZQJ6的總根長、總根表面積、總根體積、總根尖數(shù)分別顯著減少65.47%、62.52%、59.04%、38.67%，表明TZ30 對肉桂酸的自毒抗性強(qiáng)于ZQJ6。經(jīng)0.2 mmol·L-1肉桂酸處理后，TZ30的平均根系直徑增加6.03%，但無顯著性差異(P＞0.05)；ZQJ6 平均根系直徑顯著增加9.89%(P＜0.05)，表明肉桂酸對豇豆根系影響主要在幼嫩根系部位，TZ30 抗性較高。

表1 肉桂酸對豇豆根系形態(tài)指標(biāo)的影響Table1 Effect of cinnamic acid on morphological index of roots system of cowpea

2.2 肉桂酸處理對豇豆幼苗根系相對電導(dǎo)率的影響

相對電導(dǎo)率是反映植物質(zhì)膜系統(tǒng)生理生化狀況的重要指標(biāo)之一。植物在逆境或受到其他損傷的情況下細(xì)胞膜容易破裂，膜蛋白受損而使細(xì)胞內(nèi)的胞液外滲導(dǎo)致相對電導(dǎo)率增加。由圖2可知，經(jīng)0.2 mmol·L-1肉桂酸處理后，2種豇豆的相對電導(dǎo)率均增加，其中TZ30、ZQJ6的相對電導(dǎo)率分別較對照顯著增加158.21%、131.08%(P＜0.05)，表明經(jīng)由桂酸處理豇豆根系質(zhì)膜系統(tǒng)受到嚴(yán)重破壞，且TZ30 受到的破壞更嚴(yán)重。

2.3 肉桂酸處理對豇豆幼苗根系可溶性蛋白含量的影響

圖1 肉桂酸處理對豇豆生長的影響Fig.1 Effects of cinnamic acid treatments on growth of cowpea

圖2 肉桂酸處理對豇豆根系相對電導(dǎo)率的影響Fig.2 Effects of cinnamic acid treatments on relative electrical conductivity in roots of cowpea

可溶性蛋白是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)，其含量增加和積累能提高細(xì)胞的保水能力，對細(xì)胞的生命物質(zhì)及生物膜起到保護(hù)作用。由圖3可知，經(jīng)0.2 mmol·L-1肉桂酸處理后，2種豇豆的可溶性蛋白含量均降低。TZ30、ZQJ6的可溶性蛋白含量分別降低了58.60%、43.73%，均與對照差異顯著(P＜0.05)，表明經(jīng)肉桂酸處理豇豆根系細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重破壞，且TZ30 受到的破壞更嚴(yán)重。

圖3 肉桂酸處理對豇豆根系可溶性蛋白的影響Fig.3 Effects of cinnamic acid treatments on soluble protein content in roots of cowpea

2.4 肉桂酸處理對豇豆幼苗根系抗氧化酶活性影響

由圖4可知，經(jīng)0.2 mmol·L-1肉桂酸處理后，TZ30和ZQJ6的SOD、POD和APX 活性均升高，其中TZ30的SOD、POD和APX 活性分別增加124.30%、85.85%和47.48%，與對照差異顯著(P＜0.05)；ZQJ6的SOD活性增加32.93%，與對照無顯著性差異(P＞0.05)，POD和APX 活性分別增加50.79%和36.88%，與對照差異顯著(P＜0.05)，表明豇豆可以通過提高抗氧化酶的活性來抵抗肉桂酸的自毒作用，且TZ30 對肉桂酸的自毒抗性強(qiáng)于ZQJ6。

3 討論

豇豆作為我國重要的蔬菜作物[23-25]，連作障礙是制約豇豆產(chǎn)業(yè)發(fā)展的突出問題，而自毒作用是豇豆連作障礙的主要原因之一[26]。探究豇豆自毒物質(zhì)的毒害作用和機(jī)理對克服豇豆連作障礙具有重要意義。有研究表明自毒物質(zhì)首先會作用于豇豆根系[14]。本試驗采用的水培法，相對于土培，能直觀地顯示出自毒物質(zhì)肉桂酸對豇豆根系的毒害作用，根系取樣方便完整，便于進(jìn)行更深入的研究。

黃興學(xué)[14]研究發(fā)現(xiàn)，大田環(huán)境下肉桂酸會抑制連作豇豆的生長發(fā)育，影響豇豆的單株產(chǎn)量、株數(shù)及總產(chǎn)量，且肉桂酸對豇豆的自毒作用首先作用于根系，然而其研究主要集中在地上部分和根際土。本試驗進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)0.2 mmol·L-1肉桂酸處理后，TZ30和ZQJ6 根系生長均受到明顯抑制，2個品種的總根長、總根表面積、總根體積、總根尖數(shù)均顯著降低，說明肉桂酸對豇豆根系生長有明顯的抑制作用。在肉桂酸對豇豆根系生長的影響中，TZ30的總根長、總根表面積、總根體積、總根尖數(shù)的降幅均小于ZQJ6，說明TZ30 對肉桂酸的自毒抗性強(qiáng)于ZQJ6。肉桂酸處理后，2種豇豆的平均根系直徑均表現(xiàn)為增加趨勢，其中TZ30 與對照無顯著性差異，ZQJ6 差異顯著，說明TZ30 抗性較高，且表明肉桂酸對豇豆根系影響主要在幼嫩根系部位。

圖4 肉桂酸處理對豇豆根系抗氧化酶活性的影響Fig.4 Effects of cinnamic acid treatments on antioxidant enzyme activity in roots of cowpea

植物細(xì)胞膜對維持細(xì)胞的微環(huán)境和正常代謝起著重要作用，當(dāng)植物受到逆境脅迫時，細(xì)胞膜遭到破壞，膜透性增大，從而使細(xì)胞內(nèi)的電解質(zhì)外滲，相對電導(dǎo)率增大[27-28]。植物體內(nèi)的可溶性蛋白大多數(shù)是參與各種代謝的酶類，其含量是植物體總代謝水平的一個重要指標(biāo)[29]。逆境脅迫下可溶性蛋白的合成受到抑制，且分解加速[30]。本試驗結(jié)果表明，經(jīng)肉桂酸處理后，2種豇豆的相對電導(dǎo)率均顯著增加，可溶性蛋白含量均顯著下降，說明2種豇豆的根系細(xì)胞結(jié)構(gòu)均受到了明顯損壞，其中TZ30 相對電導(dǎo)率增加更多，可溶性蛋白含量下降更多，說明經(jīng)肉桂酸處理后，TZ30的細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到的破壞更嚴(yán)重。

豇豆可以通過提高自身抗氧化酶系統(tǒng)的活性來抵抗逆境脅迫。杜世章等[31]研究表明，豇豆幼苗通過提高抗氧化酶系統(tǒng)活性來抵抗NaCl的脅迫作用。于力[32]研究表明豇豆通過提高抗氧化酶活性來抵抗鋁脅迫作用。肉桂酸對豇豆的毒害作用和逆境脅迫有共通之處，在自毒物質(zhì)作用下，植物體內(nèi)直接或間接形成過量的活性氧自由基，其對細(xì)胞大分子物質(zhì)如膜系統(tǒng)、蛋白質(zhì)、脂類和核酸等具有很強(qiáng)的破壞作用，使得植物生長受阻，此時在植物體內(nèi)會有酶促防御系統(tǒng)及非酶機(jī)制來清除體內(nèi)多余的自由基，該防御系統(tǒng)實際上是一個抗氧化系統(tǒng)，通過提高抗氧化酶活性，來加強(qiáng)植物的抗氧化作用，從而提高其對逆境的抗性，減輕自由基毒害[33]。SOD、POD和APX是植物體內(nèi)抗氧化防御體系中重要的保護(hù)酶類[34]。本研究表明，經(jīng)肉桂酸處理后，2種豇豆的3種酶活性均顯著升高，說明豇豆也通過提高抗氧化酶的活性來抵抗肉桂酸的自毒作用。在TZ30 細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損更嚴(yán)重的情況下，其SOD、POD和APX 活性均較ZQJ6 提高更多，說明TZ30 對肉桂酸的自毒抗性強(qiáng)于ZQJ6。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，自毒物質(zhì)肉桂酸阻礙豇豆的根系生長。主要表現(xiàn)為:肉桂酸顯著降低了豇豆根系的總根長、總根表面積、總根體積、總根尖數(shù)，對豇豆根系的破壞首先集中在幼嫩根系。肉桂酸會破壞豇豆根系細(xì)胞質(zhì)膜的完整性，降低根系可溶性蛋白的含量，提高抗氧化酶活性。但對2種抗性不同的豇豆(TZ30和ZQJ6)根系的生長有著不同程度的影響，這些差異表明TZ30 較ZQJ6 表現(xiàn)出更高的自毒作用抗性，這些差異還可以用來檢測鑒定豇豆對肉桂酸等自毒物質(zhì)的抗性，輔助豇豆育種中選育耐連作障礙的優(yōu)良品種。后續(xù)可進(jìn)行基因?qū)用嫜芯浚瑸槿夤鹚岬茸远疚镔|(zhì)對豇豆根系的毒害作用的深入研究奠定理論基礎(chǔ)。