盧夢(mèng)楠 李蘭芳 景玉蕾 宋 偉 李彩燕 錢國(guó)英

(浙江萬里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，浙江 寧波 315000)

中華鱉(Pelodiscus sinensis)是我國(guó)傳統(tǒng)的營(yíng)養(yǎng)滋補(bǔ)佳品，其背甲俗稱鱉甲，可藥食兩用。據(jù)報(bào)道，鱉甲中富含肽類、動(dòng)物膠、角蛋白、維生素、磷酸鈣、碳酸鈣、氨基酸以及多糖等[1]。目前關(guān)于鱉甲的研究主要集中在化學(xué)組成或鱉甲提取物的藥理作用方面[1-2]；在鱉甲活性多肽方面的報(bào)道也僅限于膜分離法制備[2]、抗肝纖維化及合成[3]、干燥方式[4]等。

膠原蛋白或明膠經(jīng)蛋白酶水解后可制得低分子或小分子膠原蛋白肽或水解膠原，此類物質(zhì)具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抑菌、抗高血壓、抗衰老等特殊功能，在保健品、化妝品、生物醫(yī)藥方面有著廣泛的應(yīng)用[5]。與陸生動(dòng)物膠原蛋白相比，水生動(dòng)物源膠原蛋白肽具有獨(dú)特的生理功能和物化特性，已成為當(dāng)前水產(chǎn)加工副產(chǎn)物綜合開發(fā)利用研究的熱點(diǎn)之一[6]。骨膠原肽品質(zhì)獨(dú)特，是特異功效活性肽的良好來源，具有其他替代材料無可比擬的優(yōu)越性。目前人們已經(jīng)從眾多海洋和淡水生物的魚鱗或骨架結(jié)構(gòu)中制備得到具有良好體外抗氧化活性的膠原肽，如鱘魚[7]、馬面魚[8-9]、鯉魚[10-12]、羅非魚[13-14]、鰱魚[15]、草魚[16]、魷魚[17-18]等。Abdollahi 等[12]利用酸法制備銀鯉中的膠原蛋白及肽類并比較了其理化性質(zhì)，Chen 等[14]也利用酸溶法制備獲得了羅非魚鱗片和皮中的酸溶性膠原蛋白，為中華鱉背甲中膠原蛋白的提取工作提供了思路。

前期研究從中華鱉的裙邊部位制備獲得膠原蛋白提取率為75.64%[19]，整鱉蛋白質(zhì)含量平均達(dá)23.44%[20]，且含有存在于膠原蛋白中的特征性氨基酸——羥脯氨酸[1]。但鱉甲中特異性的功效成分尚未明確。目前國(guó)內(nèi)外已有一些關(guān)于鱉源功能肽的研究報(bào)道，如徐懷德等[21-22]利用木瓜蛋白酶水解中華鱉蛋白獲得了具有較強(qiáng)抗氧化活性的酶解物。鱉甲經(jīng)過熱水浸提后超濾可以得到相對(duì)分子質(zhì)量小于6 kDa的肽類成分，具有顯著的抗肝纖維化作用[2-3]，說明鱉甲具有一定的生物學(xué)活性，也為研究鱉甲體外抗氧化性提供了初步的理論參考。但目前關(guān)于鱉甲中膠原蛋白酶解物的制備及活性研究尚鮮見報(bào)道。

為了建立鱉甲中膠原蛋白酶解物的制備工藝，本試驗(yàn)以DPPH·、O2-·和OH·清除率作為體外抗氧化能力的檢測(cè)指標(biāo)，研究酶解條件下鱉甲膠原的分離純化條件及生物學(xué)特性，旨在為鱉甲的開發(fā)利用及鱉源新型抗氧化物質(zhì)的研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鱉甲，購(gòu)自寧波當(dāng)?shù)刂腥A鱉養(yǎng)殖場(chǎng)；DPPH(1-二苯基-2-三硝基苯肼[1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2，2-Diphenyl-1-(2，4，6-trinitrophenyl)hydrazyl]、胃蛋白酶(350 000 U·g-1)、木瓜蛋白酶(200 000 U·g-1)、菠蘿蛋白酶(50 000 U·g-1)，均購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；復(fù)合蛋白酶(100 000 U·g-1)、低分子量蛋白質(zhì)Marker(15～150 kDa)，均購(gòu)自北京Solarbio公司；其余試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

透析袋(100 kDa 截留量)，北京Solarbio 公司；KT-3400 磁力攪拌儀、高速冷凍離心機(jī)，上海盧湘儀離心儀器有限公司；FD-1A-50 真空冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；165-8001 垂直電泳儀、Gel DocTM凝膠成像儀，美國(guó)Bio-Rad 公司；Sephadex G-75、DEAE(二乙胺基乙基纖維素) 離子交換層析柱，General Electrics 公司；GK-0740層析儀，印尼AKTA公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 鱉甲膠原蛋白制備 鱉甲經(jīng)咬骨鉗粉碎，以料液比1∶10 置于0.5 mol·L-1HCl溶液中浸泡3次(4 h/次)，撈出瀝干后再以料液比1∶20 置于0.1 mol·L-1NaOH溶液中浸泡5 h，瀝干，在1∶15(m/v)10%的異丙醇中浸泡12 h，撈出瀝干后沸水浸提10 min，稱重然后添加5 000 U·g-1胃蛋白酶酶解，酶解產(chǎn)物于4℃、8 000 r·min-1條件下離心10 min，取上清液，于-50℃、1.0 Mbar條件下真空冷凍干燥48 h，即得中華鱉背甲膠原蛋白酶解物(collagen hydrolysates，CH)。

1.3.2 鱉甲膠原蛋白及其酶解物分子量測(cè)定 采用SDS-PAGE (sodium salt polyacrylamide gel electrophoresis)電泳法確定鱉甲膠原蛋白及膠原酶解物分子量。12%的分離膠、5%的濃縮膠；電泳緩沖液為Tris-甘氨酸緩沖液(pH值8.3，0.1% SDS)；樣品緩沖液為Tris-HCl 緩沖液(0.05 mol·L-1pH值8.0)；染色液為0.25%考馬斯亮蘭R-250 甲醇水。樣品質(zhì)量濃度為15 mg·mL-1，上樣量為10 μL。采用直流恒壓電源，濃縮膠90 V，分離膠120 V，電泳時(shí)間2 h[19]。

1.3.3 單酶水解制備鱉甲膠原蛋白肽 參照文獻(xiàn)[19，23-24]略有改動(dòng)，根據(jù)水解度和酶解條件，初步篩選出胃蛋白酶、菠蘿蛋白酶、復(fù)合蛋白酶3種酶，分別作為酸性、中性、弱酸作用條件的代表，水解中華鱉背甲膠原蛋白樣品，3種蛋白酶最佳水解條件見表1。

表1 中華鱉背甲膠原蛋白的酶解條件Table1 Enzymatic hydrolysis conditions of collagen from turtle carapace

1.3.4 體外抗氧化性測(cè)定 DPPH·清除率測(cè)定參考文獻(xiàn)[21-22]稍作修改，每一吸光度平行測(cè)定3次，取平均值。以維生素C(Vc)作陽性對(duì)照。OH·清除率及·清除率測(cè)定參照文獻(xiàn)[21]進(jìn)行。

1.3.5 單因素試驗(yàn) 以3種自由基(DPPH·、O2-·、OH·)清除能力作為體外抗氧化性測(cè)定指標(biāo)。選取不同加酶量(3 000、4 000、5 000、6 000 U·g-1)、不同水解溫度(40、45、50、55、60℃)、不同pH值(2.0、2.5、3.0、3.5和4.0)，分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)，確定每個(gè)因素的最佳條件。

1.3.6 Sephadex G-75 色譜柱層析分離鱉甲膠原酶解物 參照文獻(xiàn)[25]略有改動(dòng)，將最佳酶解工藝制備的鱉甲膠原酶解物(CH)過100、50 kDa 透析袋進(jìn)行透析，對(duì)透析獲得的不同分子量肽進(jìn)行體外抗氧化活性測(cè)定，取抗氧化活性最高的透析液凍干，制成濃度為10 mg·mL-1的溶液，用Sephadex G-75 葡聚糖凝膠柱層析分離，上樣量2 mL，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm，流動(dòng)相0.01 mol·L-1PBS 緩沖液(phosphate buffer saline，pH值7.0)，流速1 mL·min-1。收集抗氧化活性較高的洗脫組分，部分用于測(cè)定各組分的DPPH·、OH·、O2-·清除率，剩余部分冷凍干燥備用。

1.3.7 DEAE層析分離純化 根據(jù)文獻(xiàn)[26-27]略有改動(dòng)。取上一步驟的層析組分冷凍干燥部分，用0.05 mol·L-1Tris 緩沖液(pH值6.0)配成50 mg·mL-1的樣品溶液，0.1 mol·L-1NaCl 進(jìn)行線性梯度洗脫，所有溶液經(jīng)過0.45 μm 微孔濾膜進(jìn)行過濾。根據(jù)優(yōu)化條件選用1.6 cm×10 cm的離子交換層析柱，流速1 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm，收集洗脫峰，測(cè)定各組分的DPPH·、OH·、O2-·清除率，冷凍干燥收集抗氧化活性較高的組分。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，用Duncan多重比較法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)(P＜0.05)；應(yīng)用GraphPad Prism 5.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDS-PAGE 電泳圖

由圖1可知，鱉甲膠原蛋白粗提物(泳道1)經(jīng)酶解后的產(chǎn)物(泳道2)經(jīng)過100 kDa 截流量的透析袋分離得到大于100 kDa和小于100 kDa的酶解產(chǎn)物，可以獲得較為純凈的分子量大于100 kDa的膠原蛋白。小于100 kDa的酶解產(chǎn)物經(jīng)過Sephadex G-75 色譜柱進(jìn)行凝膠分離，得到了有效產(chǎn)物，即泳道3 產(chǎn)物；將所得產(chǎn)物通過離子交換柱分離獲得了泳道4 產(chǎn)物，將以上所有分離步驟所得產(chǎn)物進(jìn)行體外抗氧化測(cè)定，確定泳道4為高抗氧化活性產(chǎn)物且分子量在40 kDa左右的酶解物。

圖1 鱉甲膠原蛋白及其酶解物純化前后SDS-PAGE 電泳圖Fig.1 SDS-PAGE of turtle carapace collagen and collagen hydrolysates before and after purification

2.2 不同蛋白酶水解鱉甲膠原蛋白的效果

由表2可知，經(jīng)胃蛋白酶酶解的鱉甲膠原蛋白水解產(chǎn)物對(duì)DPPH·和OH·的清除率最高。復(fù)合蛋白酶酶解產(chǎn)物清除DPPH·和O2-·的效果優(yōu)于菠蘿蛋白酶，但清除OH·效果最低。故后續(xù)試驗(yàn)選擇胃蛋白酶酶解制備鱉甲膠原蛋白肽并確定其酶解條件。

表2 不同蛋白酶水解產(chǎn)物對(duì)DPPH·、OH·和O2-·清除率的影響Table2 Effects of different protase hydrolysates on the DPPH·，OH·and O2-·scavenmg rate /%

2.3 單因素試驗(yàn)確定鱉甲膠原酶解物的制備條件

由圖2-A可知，當(dāng)其他酶解條件確定(pH值2.5，加酶量4 000 U·g-1)，酶解溫度為35℃時(shí)，經(jīng)胃蛋白酶酶解的鱉甲膠原蛋白水解產(chǎn)物對(duì)O2-·、OH·和DPPH·3種自由基的清除率均達(dá)到最大。當(dāng)酶解溫度上升到40℃后，3種自由基清除率均隨著酶解溫度的升高而降低。

由圖2-B可知，當(dāng)其他酶解條件確定(pH值2.5，酶解溫度35℃)時(shí)，酶解鱉甲膠原蛋白水解產(chǎn)物對(duì)和DPPH·的清除率均隨著加酶量的增加而升高。當(dāng)加酶量介于2 000～4 000 U·g-1之間時(shí)，3種自由基清除率提高的幅度較大；當(dāng)加酶量為4 000～6 000 U·g-1時(shí)，3種自由基清除率增幅減緩。從經(jīng)濟(jì)和水解效率綜合考慮，加酶量選取4 000～5 000 U·g-1為宜。

由圖2-C可知，當(dāng)其他酶解條件確定(加酶量4 000 U·g-1，酶解溫度35℃)時(shí)，pH值介于1.5～2.5之間時(shí)，酶解鱉甲膠原蛋白水解產(chǎn)物對(duì)DPPH·、OH·和O2-·的清除率均逐漸增加，在pH值2.5時(shí)達(dá)到最大，分別為58.30%、27.65%和2.81%；隨著pH值繼續(xù)升高，3種自由基的清除率均逐漸降低。綜上，胃蛋白酶在酸性條件水解效果較好。

圖2 酶解溫度、加酶量、pH值對(duì)3種自由基清除率的影響Fig.2 Effects of hydrolysis temperature，enzyme addition，and pH value on free radical scavening rates

2.4 鱉甲膠原酶解物的分級(jí)純化及體外抗氧化活性研究

在最適酶解環(huán)境下，鱉甲膠原酶解物(CH)經(jīng)透析后分別得到組分CH-1(分子量＞100 kDa)、CH-2(分子量50～100 kDa)和CH-3(分子量＜50 kDa)。由圖3可知，透析過的CH-1、CH-2、CH-3的體外抗氧化活性(OH·和DPPH·3種自由基清除率)不同，分子量越低抗氧化活性越高。CH-3 對(duì)3種自由基的清除率最高，極顯著高于CH-1(P＜0.01)；CH-2 對(duì)3種自由基的清除率次之，顯著高于CH-1(P＜0.05)；CH-1的清除效果最低。

Sephadex G-75 凝膠色譜柱層析可用于分離分子量介于3～80 kDa之間的蛋白。CH-3 經(jīng)Sephadex G-75 凝膠色譜柱層析分離后出現(xiàn)2個(gè)特征明顯的峰，即層析得到2個(gè)組分GP-1和GP-2(圖4-A)。由圖3可知，隨著多肽分子量的降低，3種自由基清除率總體呈上升趨勢(shì)，可見清除率與多肽分子量之間有一定的協(xié)同作用。

圖3 鱉甲膠原酶解物純化過程各組分對(duì)體外3種自由基清除率的影響Fig.3 Effects of collagen hydrolysate from turtle carapace on free radical clearance rates

GP-2 進(jìn)一步經(jīng)離子交換層析后得到了2個(gè)洗脫峰，即組分P1和P2(圖4-B)。由圖3可知，P1的體外抗氧化活性極顯著高于P2(P＜0.01)，且P1 對(duì)DPPH·和OH·的清除率極顯著高于GP-2(P＜0.01)，對(duì)O2-·的清除率顯著高于GP-2(P＜0.05)。與陽性對(duì)照Vc相比，P1 對(duì)DPPH·的清除率無顯著差異(P＞0.05)。表明鱉甲膠原酶解物經(jīng)純化分離后，體外抗氧化活性提高非常明顯。經(jīng)SDS-PAGE 電泳可知，P1組分分子量介于35～48 kDa之間(圖1)，也證實(shí)本試驗(yàn)獲得了鱉甲組織的水解明膠。明膠是膠原蛋白部分水解的產(chǎn)物，其三螺旋結(jié)構(gòu)部分被破壞，分子量通常介于15～250 kDa之間[9]。

圖4 鱉甲膠原酶解物組分凝膠色譜層析(A)、離子交換層析(B)分離圖譜Fig.4 Gel chromatography(A) and DEAE chromatography (B) of collagen hydrolysate from turtle carapace

3 討論

本試驗(yàn)提取鱉甲膠原蛋白進(jìn)行酶解獲得的酶解產(chǎn)物具有良好的體外抗氧化活性，這與郭瑤[23]酶解羅非魚皮膠原蛋白獲得具有良好的體外抗氧化活性功能多肽的結(jié)果相一致。目前國(guó)內(nèi)外采用聯(lián)用純化技術(shù)較為廣泛，賈建萍等[5]將三文魚皮抗氧化肽段深入純化分離，獲得了純度較高的功能活性肽段。王雪芹[28]將鮐魚多肽進(jìn)行超濾純化，將超濾后小于2.5 kDa 多肽經(jīng)過Superdex 75層析獲得4個(gè)組分，再次經(jīng)過Sephadex C-25層析獲得高體外抗氧化活性產(chǎn)物。舒一梅等[29]將豬股骨超濾后小于5 kDa 分子量濾液經(jīng)Sephadex G-25 凝膠層析分離，再利用UNO-S 陽離子交換樹脂對(duì)凝膠層析分離后的活性組分進(jìn)一步分離，得到2個(gè)組分，組分2(1 kDa)的抗氧化活性較組分1(7 kDa)明顯提高，這與本研究采用多級(jí)純化獲得高抗氧化活性產(chǎn)物的趨勢(shì)相一致。鄒利[30]利用豬骨粉酶解液制備抗氧化活性物質(zhì)時(shí)發(fā)現(xiàn)，單純的豬股骨抗氧化活性與LMPRS(mission planning and restitution system)各有優(yōu)勢(shì)，豬股骨酶解物對(duì)DPPH·清除率大于MPRS，但OH·清除率小于MPRS，這可能與2種物質(zhì)中含有不同的化學(xué)官能團(tuán)有關(guān)。王晨[31]測(cè)定牛骨膠原多肽的體外清除率發(fā)現(xiàn)，當(dāng)活性成分的平均分子量為2.0 kDa時(shí)，其清除O2-·作用較強(qiáng)，與Vc的清除率接近，但對(duì)DPPH·的清除率明顯低于Vc，而本試驗(yàn)獲得的鱉甲膠原酶解物對(duì)DPPH·、OH·和O2-·的清除率低于Vc。這可能是不同動(dòng)物來源的骨源多肽活性差異所致，也可能是由于不同分子量的膠原肽的體外抗氧化活性不同，這與Wu 等[32]和Li 等[33]的研究相一致，即膠原肽分子量越小，抗氧化性越強(qiáng)。蛋白分子量大小、構(gòu)象及氨基酸組成是影響蛋白酶解物抗氧化能力的主要因素[33]。

本研究采用膜分離、凝膠分離、離子交換的聯(lián)用純化方法對(duì)鱉甲膠原蛋白酶解產(chǎn)物進(jìn)行一系列分離，獲得了具有良好體外抗氧化性的活性產(chǎn)物。但此方法與單一純化技術(shù)相比，耗時(shí)偏長(zhǎng)，不適用于中試化生產(chǎn)，下一步應(yīng)探究有效的簡(jiǎn)便純化方法。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)確定了鱉甲膠原蛋白酶解物的適合制備條件為，采用胃蛋白酶酶解，酶解溫度35℃、pH值2.5、加酶量4 000 U·g-1，獲得的酶解產(chǎn)物經(jīng)透析、層析等多級(jí)純化獲得分子量大小為40 kDa 左右的水解明膠產(chǎn)物，其DPPH·清除率與Vc 無顯著差異。本研究為中華鱉背甲制品的研發(fā)及抗氧化活性的發(fā)揮提供了科學(xué)參考。