陳小豐 任 慧 許 鳳 王 靖 孫 朦 王鴻飛

(寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 寧波 315211)

金桔[Fortunella margarita(Lour.) Swingle]是金橘屬(FortunellaSwingle)的一種小果種，口感酸甜，可全部食用，富含維生素、果膠、鈣、磷、鐵和類黃酮化合物[1]。金桔作為傳統(tǒng)的祛痰、降酒、調(diào)節(jié)氣滯活血、抗抑郁的民間良藥，具有良好的藥用和食用價(jià)值[2-3]。然而，金桔采后生理退化、機(jī)械損傷、病原菌感染等，往往會(huì)縮短其保質(zhì)期，造成一定的經(jīng)濟(jì)損失，因此柑橘采后病害的控制對(duì)于保持其品質(zhì)和延長(zhǎng)貨架期至關(guān)重要。在金桔采后貯運(yùn)期間，由意大利青霉(Penicillium italicum)引發(fā)的青霉病是金桔最常見(jiàn)的采后病害之一[4]，除此之外，意大利青霉還會(huì)產(chǎn)生大量的無(wú)性分生孢子，容易借助氣流傳播[5-6]。為了控制這種病原體，目前多采用化學(xué)方法控制其采后病害的發(fā)生，但考慮到環(huán)境健康和食用安全問(wèn)題以及開(kāi)發(fā)新的殺蟲劑以克服病原體所產(chǎn)生抗性的成本[7]，化學(xué)殺菌劑的使用受到越來(lái)越多的限制[8]。因此，尋找安全有效的天然保鮮劑已成為當(dāng)務(wù)之急。

含有活性成分的天然植物提取液因具有優(yōu)良的抑菌和防腐性能，在采后果蔬保鮮和貯運(yùn)過(guò)程中起著越來(lái)越重要的作用[9]。何麗芳等[10]研究發(fā)現(xiàn)，芒果皮提取液與羧甲基殼聚糖復(fù)合對(duì)葡萄的保鮮有明顯的效果；另外，Zhang 等[11]對(duì)香附根莖精油的抑菌活性及作用機(jī)理進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，其對(duì)金黃色葡萄球菌具有很強(qiáng)的抗菌活性。已有研究表明，植物提取液不僅能夠抑制或殺滅真菌，還可以通過(guò)去除自由基防止果實(shí)細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化，進(jìn)而保持果實(shí)新鮮，延長(zhǎng)貨架期[12]。辣 木(Moringa oleiferaLam.)為辣 木 科(Moringaceae Martinov)辣木屬(MoringaAdans.)多年生熱帶植物，其葉、種子、根等部位均為民間傳統(tǒng)藥物。辣木作為一種優(yōu)質(zhì)的功能性食品原料，隨著其營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值被逐步發(fā)現(xiàn)，目前已成為研究和開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)。黃酮類化合物是辣木富含的活性物質(zhì)之一，作為低分子量天然多酚類次級(jí)代謝產(chǎn)物，其對(duì)細(xì)菌有抑制能力[13]，已逐漸被應(yīng)用于豬肉、果蔬等食品的保鮮，但鮮有文獻(xiàn)報(bào)道辣木葉黃酮對(duì)金桔采后病害的防治作用。本研究通過(guò)體外和體內(nèi)試驗(yàn)，探究辣木葉黃酮對(duì)金桔采后青霉病的抑制作用及其機(jī)制，以期為辣木葉黃酮的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用以及金桔在運(yùn)貯過(guò)程中真菌病害的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干辣木葉購(gòu)于深圳惠綠寶辣木生物科技有限公司；意大利青霉(Penicillium italicum)購(gòu)于西南大學(xué)柑橘研究所；金桔購(gòu)于寧波大學(xué)森林果園(十月中下旬采摘)，挑選大小、色澤基本一致，無(wú)病蟲害及機(jī)械損傷的果實(shí)。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato-dextrose agar，PDA)、馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基(potato-dextrose broth，PDB)，杭州微生物試劑有限公司；幾丁質(zhì)酶試劑盒、果膠酶試劑盒、苯丙氨酸解氨酶(phenyalnine ammonia-lyose，PAL)試劑盒，南京建成生物工程研究所；蕓香葉苷、槲皮苷、槲皮素、山柰酚、染料木苷、木犀草素、異鼠李素標(biāo)準(zhǔn)品，阿拉丁試劑(上海)有限公司；三葉豆苷、兒茶素、忍冬苷、紫云英苷、沒(méi)食子酸、異槲皮苷、野黃芩素標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉生物科技有限公司；無(wú)水乙醇、氯化鈉，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

DNP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；SHZ82型氣浴恒溫振蕩器，金壇市科析儀器有限公司；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；S-3400N型掃描電子顯微鏡，日本日立公司；TGL-16型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；H-7650型透射電子顯微鏡，日本日立公司；SYNAPTG2型液相色譜、Synapt G2 MS型串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜，美國(guó)Waters 公司；TA-XT2i 質(zhì)構(gòu)儀，英國(guó)StableMicro Systems 有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 辣木葉黃酮制取 辣木葉黃酮的提取參照文獻(xiàn)[14]并略作修改。將干辣木葉粉碎過(guò)80 目篩，稱取一定量辣木葉干粉，按料液比1∶50(w∶v)加入70%乙醇溶液，60℃超聲輔助提取90 min，8 000 r·min-1離心10 min，抽濾得上清液，參照文獻(xiàn)[15]的方法進(jìn)行黃酮分離純化，之后45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得辣木葉黃酮濃縮液，然后將濃縮液冷凍干燥，直至黃酮凍干為粉末，取出后-20℃密封保存?zhèn)溆?。取一定量?jī)龈煞?，測(cè)得黃酮含量為53.14%。

1.3.2 辣木葉黃酮成分分析 采用超高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜法。稱取1 g 凍干粉，加入25 mL 甲醇溶液，超聲波處理(60℃，功率150 W)40 min，然后常溫離心(10 000 r·min-1，10 min)，過(guò)0.22 μm 微孔濾膜后上機(jī)檢測(cè)。

1.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品制備 將各標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇溶解定容至刻度，配制標(biāo)準(zhǔn)液，存放于棕色瓶中，待檢測(cè)。各標(biāo)準(zhǔn)品濃度見(jiàn)表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度Table1 Concentration of standard samples

1.3.2.2 色譜質(zhì)譜條件 色譜柱:Angilent Zorbax XDB-C18 柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流動(dòng)相:甲醇(A)和0.1%甲酸溶液(B)，流速0.8 mL·min-1，進(jìn)樣量10 μL，柱溫25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。線性梯度洗脫程序:0～5 min，70%～30% A；5～18 min，30%～10%A。離子源ESI 掃描范圍100～1 200m/z，毛細(xì)管電壓2.50 kV，錐孔電壓50.00 V，錐孔氣流量50 L·h-1，提取電壓2.00 V，離子源溫度125℃，脫溶劑氣溫度250℃，脫溶劑氣流量400 L·h-1。

1.3.3 孢子懸浮液的制備 利用于PDA 斜面上保存的意大利青霉菌[16]，參照Bill 等[17]的方法制備孢子懸浮液。將斜面菌種接于PDA 平板上，28℃活化5 d，然后用無(wú)菌生理鹽水將平板上的孢子洗出，通過(guò)8層紗布過(guò)濾除去菌絲等，并配成1×106個(gè)·mL-1的孢子懸浮液(血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù))，隨用隨配。

1.3.4 辣木葉黃酮對(duì)意大利青霉菌體外生長(zhǎng)的抑制作用

1.3.4.1 孢子萌發(fā)率測(cè)定 參考文獻(xiàn)[18]的方法，并略作修改。取2 mL 1×104個(gè)·mL-1意大利青霉孢子懸浮液，加入2 mL PDB 培養(yǎng)基，再加入辣木葉黃酮至終濃度分別為0.5、1、2、4、8、16和32 mg·mL-1，以未加辣木葉黃酮處理為對(duì)照。于28℃、200 r·min-1條件下?lián)u培20 h 后顯微鏡觀察統(tǒng)計(jì)萌發(fā)的孢子數(shù)，每個(gè)平行至少觀察200個(gè)孢子，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)平行。

1.3.4.2 菌絲生長(zhǎng)抑制能力測(cè)定 采用瓊脂稀釋法[19]測(cè)定辣木葉黃酮處理后意大利青霉菌絲生長(zhǎng)的情況。將PDA 培養(yǎng)基倒入已滅菌培養(yǎng)皿，將適量純化后的辣木葉黃酮粉末用20%乙醇溶液溶解，并用蒸餾水稀釋后添加到PDA 培養(yǎng)基中，得到辣木葉黃酮濃度依次為0、0.5、1、2、4、8、16和32 mg·mL-1的PDA 培養(yǎng)基。用滅菌的打孔器在長(zhǎng)有意大利青霉的培養(yǎng)基上取直徑為6 mm 菌餅置于含有辣木葉黃酮的培養(yǎng)基的中心處。將培養(yǎng)基置于28℃孵育48 h，每個(gè)處理設(shè)置6個(gè)平行。按照公式計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率(mycelial growth inhibition，MGI):

式中，dc為對(duì)照組的平均菌落直徑，mm；dt為處理組的平均菌落直徑，mm；di為菌餅的初始菌落直徑，mm。

培養(yǎng)48 h 后，完全抑制真菌生長(zhǎng)的最低濃度被認(rèn)為是最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)。培養(yǎng)72 h 后，完全抑制真菌生長(zhǎng)的最低濃度被認(rèn)為是最低殺菌濃度(minimum fungicidal concentration，MFC)[20-21]，表明此時(shí)原始接種物的殺滅率超過(guò)99.5%。

1.3.4.3 掃描電鏡(scanning electron microscopy，SEM) 觀察和透射電鏡(transmission electron microscope，TEM)觀察 掃描電鏡根據(jù)文獻(xiàn)[22]、透射電鏡根據(jù)文獻(xiàn)[23]的方法并略作修改。吸取孢子懸浮液分別注入PDB 培養(yǎng)基中，搖床(120 r·min-1，28℃)培養(yǎng)48 h 后挑取菌絲球，用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)緩沖液(0.1 mol·L-1，pH值7.4)沖洗菌絲球，此后置于辣木葉黃酮終濃度分別為MIC和MFC的處理液中各處理6 h，以PBS溶液作為對(duì)照。然后置于3%戊二醛溶液中過(guò)夜(4℃)，再用PBS 緩沖液洗脫，每次15 min，重復(fù)3次，經(jīng)系列濃度乙醇(體積分?jǐn)?shù)為30%、50%、70%、80%、90%、100%)逐級(jí)洗脫樣品，每次間隔10 min，其中100%乙醇脫水2次。叔丁醇與無(wú)水乙醇逐級(jí)(比例分別為1∶3、1∶1、3∶1)洗脫樣品，每次脫水10 min，最后用純叔丁醇洗脫1次。經(jīng)過(guò)干燥、粘樣、鍍膜后于掃描電子顯微鏡下觀察、拍照，每個(gè)樣品取3個(gè)平行。按照上述步驟處理樣品，經(jīng)乙醇梯度洗脫后，用無(wú)水丙酮洗脫4次，每次15 min，經(jīng)包埋烘干后進(jìn)行超薄切片，于透射電子顯微鏡下觀察、拍照。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)平行。

1.3.5 辣木葉黃酮對(duì)金桔采后青霉病的防治效果

1.3.5.1 辣木葉黃酮溶液配制 取適量純化后的辣木葉黃酮粉，用蒸餾水溶解至終濃度分別為1、4、8、12 mg·mL-1，以蒸餾水為對(duì)照。

1.3.5.2 樣品處理 參照Sellamuthu 等[24]的方法并略作修改。將金桔放置于2%(v:v)的次氯酸鈉溶液中浸泡2 min 后，取出晾干。將金桔隨機(jī)分為5組，然后用滅菌不銹鋼釘子于果實(shí)赤道部刺孔1個(gè)(深4 mm，直徑3 mm)，用微量移液器分別向每孔中注入10 μL 濃度依次為1、4、8、12 mg·mL-1辣木葉黃酮溶液和無(wú)菌水，自然風(fēng)干后接入10 μL 意大利青霉孢子懸浮液。晾干后，將這些樣品放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱(溫度20±1℃，相對(duì)濕度75%)中，模擬零售環(huán)境。在貯藏0、2、4、6 d時(shí)測(cè)定菌斑直徑(mm)。每組處理15個(gè)果實(shí)，設(shè)置3個(gè)平行，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5.3 果皮硬度測(cè)定 采用質(zhì)構(gòu)儀進(jìn)行測(cè)定。探頭(SMSP/6)直徑為5 mm。下壓距離為5 mm，下壓速度為1 mm·s-1，取最大值，每個(gè)金桔果實(shí)分別測(cè)定陰陽(yáng)面赤道部位，每組處理15個(gè)果實(shí)，結(jié)果取平均值。

1.3.5.4 防御相關(guān)酶活測(cè)定 選取處理后的15個(gè)金桔果實(shí)，經(jīng)0、2、4和6 d 貯藏后取果實(shí)病斑周圍2～10 mm的果皮組織，經(jīng)液氮速凍研磨成粉后于-80℃冰箱冷凍保存。按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行幾丁質(zhì)酶、果膠酶、苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase，PAL)等相關(guān)酶活性的測(cè)定。其中，粗酶液的制備參考文獻(xiàn)[25]的方法進(jìn)行，粗酶液中蛋白質(zhì)含量采用Bradford法[26]，使用考馬斯亮藍(lán)試劑盒測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SAS 8.1 軟件的One-way ANOVA 分析所得數(shù)據(jù)，差異顯著分析用Duncan′s multiple range test 進(jìn)行多重比較(P＜0.05表示差異性顯著)，采用Origin Pro 9.0 軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣木葉黃酮成分分析

由圖1可知，在配制的14種標(biāo)準(zhǔn)品中，辣木葉黃酮只含有其中2種成分，分別為槲皮苷和異槲皮苷。由圖1-A可知，m/z=463.09的質(zhì)譜峰是異槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)分子離子[M-H]-，出峰時(shí)間為7.23 min，峰面積為6 432.44。由圖1-B可知，m/z=447.09的質(zhì)譜峰是槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)分子離子[M-H]-，出峰時(shí)間為8.00 min，峰面積為4 883.35。

由表2可知，辣木葉黃酮中所含黃酮成分主要為槲皮苷(黃酮類)和異槲皮苷(黃酮醇類)。其中異槲皮苷含量高達(dá)314.960 mg·L-1，槲皮苷含量為158.652mg·L-1。

圖1 辣木葉樣品的超高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜圖(254 nm)Fig.1 HPLC-EIS-MS of the samples in Moringa oleifera leaves at 254 nm

表2 辣木葉中黃酮的主要成分Table2 The main compounds of flavonoids in Moringa oleifera leaves

2.2 辣木葉黃酮對(duì)意大利青霉菌體外生長(zhǎng)的抑制作用

2.2.1 辣木葉黃酮對(duì)孢子萌發(fā)的影響 由圖2可知，不同濃度的辣木葉黃酮對(duì)意大利青霉孢子的萌發(fā)均有顯著抑制作用(P＜0.05)，抑制效果隨著辣木葉黃酮濃度的增加而增強(qiáng)。當(dāng)辣木葉黃酮濃度大于8.0 mg·mL-1時(shí)，意大利青霉孢子的萌發(fā)率為0，表明此濃度下的辣木葉黃酮完全抑制了意大利青霉孢子的萌發(fā)。

2.2.2 辣木葉黃酮對(duì)菌絲生長(zhǎng)抑制能力測(cè)定 由表3可知，辣木葉黃酮對(duì)意大利青霉的菌絲生長(zhǎng)的抑制作用呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)。培養(yǎng)48 h時(shí)，4 mg·mL-1辣木葉黃酮已經(jīng)完全抑制了意大利青霉菌絲的生長(zhǎng)；培養(yǎng)72 h時(shí)，8 mg·mL-1劑量表現(xiàn)出對(duì)意大利青霉菌絲的完全抑制。因此，辣木葉黃酮對(duì)意大利青霉的MIC和MFC 分別為4 mg·mL-1和8 mg·mL-1。

2.2.3 SEM 觀察辣木葉黃酮對(duì)意大利青霉菌絲形態(tài)的影響 由圖3可知，辣木葉黃酮對(duì)意大利青霉的菌絲有一定的影響。對(duì)照組的樣品菌絲排列規(guī)則且均勻，直徑恒定，呈現(xiàn)出正常和完整的管狀結(jié)構(gòu)，且菌絲體表面光滑。而經(jīng)MIC和MFC 濃度辣木葉黃酮處理的意大利青霉的菌絲在菌絲體形態(tài)上表現(xiàn)出較大變化。其中，MIC處理組菌絲表面皺縮且粗糙不平，菌絲已受損。MFC處理組菌絲體皺縮度加深，損傷程度較MIC處理組更嚴(yán)重，菌絲出現(xiàn)皺褶、塌陷、折疊，且細(xì)胞質(zhì)已外流，甚至嚴(yán)重崩解。

表3 辣木葉黃酮對(duì)意大利青霉菌絲生長(zhǎng)的抑制Table3 Effects of flavonoids from leaves of Moringa oleifera on mycelium of Penicillium italicum

圖2 辣木葉黃酮對(duì)意大利青霉孢子萌發(fā)的影響Fig.2 Effects of flavonoids from leaves of Moringa oleifera on the germination of Penicillium italicum

2.2.4 TEM 觀察辣木葉黃酮對(duì)意大利青霉內(nèi)部形態(tài)的影響 由圖4可知，對(duì)照組的菌絲結(jié)構(gòu)規(guī)則，質(zhì)膜和細(xì)胞壁完整，細(xì)胞器如線粒體清晰正常(圖4-A 字母M所示)。經(jīng)辣木葉黃酮處理后的意大利青霉菌的菌絲體內(nèi)部形態(tài)變化較明顯，MIC處理組的菌絲內(nèi)部結(jié)構(gòu)受到不同程度的損壞，質(zhì)膜脫離細(xì)胞壁(圖4-B箭頭2所示)，細(xì)胞膜受損甚至消失(圖4-B箭頭1所示)。所有的細(xì)胞器均變得模糊不清，有些細(xì)胞器甚至消失，內(nèi)部出現(xiàn)空洞。而MFC處理組變化更明顯，受損程度更嚴(yán)重，胞內(nèi)空洞化(圖4-C箭頭3所示)，已無(wú)完整的細(xì)胞器存在，胞質(zhì)外流(圖4-C箭頭4所示)，細(xì)胞已死亡。上述結(jié)果表明，辣木葉黃酮能破壞意大利青霉內(nèi)部細(xì)胞器，導(dǎo)致其死亡。

2.3 辣木葉黃酮對(duì)金桔采后病害的防治作用

2.3.1 辣木葉黃酮對(duì)損傷接種意大利青霉的金桔果實(shí)硬度的影響 由圖5可知，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，金柑果皮硬度均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但不同濃度辣木葉黃酮處理組金桔與CK 金桔的下降幅度不盡相同。在貯藏期結(jié)束時(shí)，果實(shí)硬度下降明顯，但12 mg·mL-1辣木葉黃酮處理組仍保持較高的硬度(21.96 N)，其次是8 mg·mL-1辣木葉黃酮處理組(14.69 N)，CK的硬度值最低(9.97 N)，顯著低于不同濃度辣木葉黃酮處理組。說(shuō)明辣木葉黃酮能夠有效延緩金桔染病后果皮硬度下降的速率。

2.3.2 辣木葉黃酮對(duì)損傷接種意大利青霉的金桔果實(shí)菌斑直徑的影響 由圖6可知，貯藏期間金柑的菌斑直徑均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，經(jīng)辣木葉黃酮處理后的金桔的菌斑直徑均低于CK。貯藏第6天時(shí)，各濃度辣木葉黃酮處理組的菌斑直徑均顯著低于CK，12 mg·mL-1辣木葉黃酮處理組的菌斑直徑為25.42 mm，1、4、8 mg·mL-1辣木葉黃酮處理組之間的病斑直徑無(wú)顯著差異。結(jié)合圖7可知，辣木葉黃酮處理能夠有效抑制青霉菌在金桔果實(shí)上的生長(zhǎng)，對(duì)金桔果實(shí)采后病害具有一定的防治作用。

圖3 掃描電鏡觀察意大利青霉菌絲形態(tài)變化Fig.3 The morphological alteration of Penicillium italicum hyphae observed by SEM

圖4 透射電鏡觀察意大利青霉菌絲內(nèi)部形態(tài)變化Fig.4 Internal morphological alteration of Penicillium italicum hyphae observed by TEM

圖5 辣木葉黃酮對(duì)金桔果皮硬度的影響Fig.5 Effects of flavonoids from leaves of Moringa oleifera on firmness of kumquat peel

圖6 辣木葉黃酮對(duì)金桔傷口菌斑直徑的影響Fig.6 Effects of flavonoids from leaves of Moringa oleifera on lesion diameter of kumguat wounds

圖7 辣木葉黃酮對(duì)金桔青霉病的抑制效果(第6天)Fig.7 Inhibitory effects of flavonoids from leaves of Moringa oleifera on blue mold of kumquat after 6 days

2.3.3 辣木葉黃酮對(duì)金桔防御酶系的影響 由圖8可知，辣木葉黃酮對(duì)金桔防御酶系具有一定的影響。在各貯藏期間，與CK相比，辣木葉黃酮處理組對(duì)相關(guān)防御酶活具有不同程度的影響。在貯藏第2、第4和第6天時(shí)，果膠酶一直呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在貯藏期第4和第6天時(shí)，12 mg·mL-1辣木葉黃酮處理組果膠酶活性顯著低于其他處理組(圖8-A)，顯著抑制了果膠酶的活性(P＜0.05)。PAL活性在貯藏前4 d 一直處于上升趨勢(shì)，相對(duì)于CK，4、8和12 mg·mL-1辣木葉黃酮處理組PAL活性顯著上升，特別是高濃度辣木葉黃酮處理組更加明顯；在貯藏第6天時(shí)，PAL活性出現(xiàn)下降，但12 mg·mL-1辣木葉黃酮處理組PAL活性一直顯著高于他各組(圖8-B)。而幾丁質(zhì)酶活性在整個(gè)貯藏過(guò)程中一直呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，其中8、12 mg·mL-1辣木葉黃酮處理組一直與其他各組存在顯著差異(P＜0.05)，且顯著高于CK(圖8-C)。

3 討論

研究表明，黃酮通過(guò)作用真菌細(xì)胞膜及呼吸代謝來(lái)發(fā)揮抑菌作用[27]，蜂膠及其活性化合物松曲菌素可通過(guò)抑制意大利青霉的能量平衡和細(xì)胞膜的完整性來(lái)抑制其菌絲的生長(zhǎng)[28]。此外，Jabeen 等[29]指出辣木葉黃酮的抗菌活性與親脂性化合物有關(guān)，它可能與細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)合，改變真菌細(xì)胞膜透性，延緩其生長(zhǎng)。本研究結(jié)果表明，辣木葉黃酮對(duì)意大利青霉菌絲的生長(zhǎng)有抑制作用，且滿足劑量效應(yīng)關(guān)系。經(jīng)過(guò)不同濃度的辣木葉黃酮處理，菌絲收縮，形成粗糙的表面，出現(xiàn)嚴(yán)重扭曲和凹陷現(xiàn)象。此外，超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)菌絲細(xì)胞膜受損，胞質(zhì)外流，細(xì)胞器受到不同程度的損傷。推測(cè)可能是黃酮類化合物對(duì)病原體細(xì)胞質(zhì)膜具有干擾作用，從而導(dǎo)致膜流動(dòng)性的變化，隨后使某些細(xì)胞內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)流出，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[30]。

硬度是衡量果實(shí)品質(zhì)的重要指標(biāo)，辣木葉黃酮對(duì)金桔硬度的保持具有顯著的效果。本研究中，辣木葉黃酮可能作為屏障，減少了金桔中乙烯的產(chǎn)生，從而提高膜的完整性并保持其堅(jiān)韌性。本研究中對(duì)照組金桔果皮硬度下降，這與Tesfay 等[16]的結(jié)果相似，可能與細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)減弱、膜完整性喪失、纖維素和半纖維素的水解以及果膠和淀粉的解聚有關(guān)，其中纖維素和半纖維素的水解、果膠和淀粉的解聚是由聚半乳糖醛酸酶、果膠甲基酯酶、果膠裂解酶等酶的催化導(dǎo)致的[31]。果品若在銷售階段出現(xiàn)硬度下降，會(huì)對(duì)其品質(zhì)造成不利影響[32]，研究發(fā)現(xiàn)植物提取物對(duì)果實(shí)品質(zhì)的保持具有良好的效果。戴鵬輝等[33]研究發(fā)現(xiàn)紫蘇提取物能延緩越橘品質(zhì)下降，與本試驗(yàn)中辣木葉黃酮有相似的作用。研究表明，果膠酶活性的增加會(huì)加快果實(shí)軟化[34]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，4、8、12 mg·mL-1辣木葉黃酮處理組的果膠酶活性明顯較低，說(shuō)明較高濃度的辣木葉黃酮能抑制果膠酶的活性，使果實(shí)保持一定的硬度。這可能是因?yàn)槔蹦救~黃酮直接與果膠結(jié)合，防止了果膠酶進(jìn)入細(xì)胞壁的基底，有效保護(hù)了果實(shí)的細(xì)胞壁，從而使其具有一定的硬度[35]。

圖8 辣木葉黃酮對(duì)金桔防御相關(guān)酶的影響Fig.8 Effects of flavonoids from leaves of Moninga oleifera on active of defence response-related enzymes of kumquat

采后水果的抗病性與病程相關(guān)蛋白有關(guān)。在病程相關(guān)蛋白中，幾丁質(zhì)酶與植物抗病性密切相關(guān)，被認(rèn)為是植物抗真菌侵染的關(guān)鍵物質(zhì)[17]。辣木葉黃酮能顯著誘導(dǎo)金桔中的幾丁質(zhì)酶活性的升高，抑制果實(shí)腐爛。本研究結(jié)果表明，辣木葉黃酮能夠延緩金桔青霉病發(fā)病進(jìn)程，保護(hù)細(xì)胞膜的完整結(jié)構(gòu)和正常功能。這些作用都有助于提高金桔果實(shí)組織抵御青霉入侵的能力，減緩意大利青霉的傳播，這與張美麗[36]的研究結(jié)果具有相似性。PAL是苯丙烷類代謝途徑的關(guān)鍵酶，其活性與酚類化合物的合成密切相關(guān)。PAL是植保素、木質(zhì)素和酚類化合物合成的關(guān)鍵酶，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育、抵御病蟲害、防紫外輻射及構(gòu)成植物交撐系統(tǒng)等方面有重要意義，當(dāng)果實(shí)被誘導(dǎo)后PAL活性明顯增強(qiáng)[37]。本研究發(fā)現(xiàn)辣木葉黃酮在初期提高了PAL活性，有助于提高果實(shí)的抗菌能力，延長(zhǎng)貨架期。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，辣木葉黃酮能夠破壞意大利青霉菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致內(nèi)容物外漏，胞內(nèi)細(xì)胞器損傷，出現(xiàn)空洞化，進(jìn)而抑制意大利青霉的生長(zhǎng)，抑制采后青霉病的發(fā)生。本研究著重揭示了幾丁質(zhì)酶和PAL活性的增加，從而增強(qiáng)金桔對(duì)意大利青霉的抵抗能力，表明辣木葉黃酮可以作為一種極具潛力的生物殺真菌劑?？紤]到辣木葉黃酮在病害防治中的重要作用，應(yīng)進(jìn)一步研究辣木葉黃酮抑制意大利青霉的作用機(jī)理。