李慧峰 董慶龍 趙 強(qiáng) 冉 昆

(1山東省果樹(shù)研究所，山東 泰安 271000；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所，遼寧 興城 125100；3青島農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山東 青島 266109)

蘋(píng)果(Malus pumilaMill)是世界上重要的經(jīng)濟(jì)果樹(shù)之一。我國(guó)蘋(píng)果的栽培面積和產(chǎn)量均居世界首位，但環(huán)境脅迫因子如病害、干旱、鹽堿和極端溫度等嚴(yán)重影響蘋(píng)果的產(chǎn)量和品質(zhì)，限制了蘋(píng)果產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。APETALA2/ethylene responsive factor(AP2/ERF)轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育以及脅迫應(yīng)答等多個(gè)過(guò)程，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和環(huán)境適應(yīng)具有重要作用，因此開(kāi)展蘋(píng)果AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子研究，可為探索其在逆境調(diào)控過(guò)程中的生物學(xué)功能和利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良及培育蘋(píng)果新品種奠定理論基礎(chǔ)。

AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子是植物中研究較為廣泛的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，參與調(diào)控植物發(fā)育、代謝和響應(yīng)環(huán)境脅迫等多個(gè)生物進(jìn)程[1-4]，其名稱源于蛋白上含有60～70個(gè)氨基酸組成的AP2/ERF保守結(jié)構(gòu)域。研究表明，AP2 結(jié)構(gòu)域能結(jié)合啟動(dòng)子區(qū)域的GCC box元件[5]、脫水應(yīng)答元件(the dehydration responsive element)[6]和/或TTG元件[7]進(jìn)而調(diào)控靶基因的表達(dá)。根據(jù)氨基酸序列的相似性和AP2/ERF保守結(jié)構(gòu)域的數(shù)量，可將AP2/ERF蛋白分為AP2、ERF和RAV 三個(gè)亞家族[4，8]。其中，AP2亞家族成員含有2個(gè)AP2/ERF保守結(jié)構(gòu)域；RAV亞家族成員含有1個(gè)AP2/ERF保守結(jié)構(gòu)域和1個(gè)B3 結(jié)構(gòu)域；ERF亞家族成員含有1個(gè)AP2/ERF保守結(jié)構(gòu)域，又可根據(jù)AP2/ERF保守結(jié)構(gòu)域的第14和第19位氨基酸的不同，進(jìn)一步細(xì)分為ERF和CBF/DREB 兩個(gè)亞家族[9-10]。多個(gè)物種的AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子已被分離和鑒定[4，11-12]。研究表明，過(guò)表達(dá)DREB亞家族成員能夠提高轉(zhuǎn)基因株系對(duì)多種非生物脅迫的抗性，包括干旱[13-15]、高鹽[13，16]、凍害[15]和高溫[17]等；過(guò)表達(dá)ERF亞家族成員不僅能夠參與調(diào)控防衛(wèi)基因的表達(dá)而提高對(duì)多種生物脅迫的抵抗能力[18-21]，而且還能夠增強(qiáng)植物對(duì)干旱[22-23]、高鹽[19]、凍害[24]和滲透脅迫[25]的抗性；AP2亞家族成員在植物生長(zhǎng)和發(fā)育，包括種子、花器官和果實(shí)發(fā)育等進(jìn)程中扮演著重要角色[26-29]；RAV亞家族成員在響應(yīng)乙烯、油菜素內(nèi)酯以及生物和非生物脅迫等過(guò)程中具有重要作用[30]。

前人關(guān)于蘋(píng)果AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子的研究主要集中在果實(shí)成熟和軟化等方面[31-35]。故本研究在蘋(píng)果基因組數(shù)據(jù)庫(kù)[36]和前人研究結(jié)果[37]的基礎(chǔ)上，通過(guò)序列比對(duì)去除GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中已存在的60個(gè)蘋(píng)果AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子[32，38]，成功克隆了14個(gè)MdAP2/ERF基因，進(jìn)行進(jìn)化聚類、亞細(xì)胞定位分析，并研究其在蘋(píng)果不同組織及非生物和生物脅迫下的表達(dá)情況，以期為進(jìn)一步研究蘋(píng)果AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育以及逆境響應(yīng)等過(guò)程奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料及前處理

供試材料為山東省果樹(shù)生物技術(shù)育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存的嘎啦組培苗(Malus domesticacv.Gala)。嘎啦組培苗于繼代培養(yǎng)基[MS 培養(yǎng)基+0.2 mg·L-1吲哚乙酸(indoleacetic acid，IAA)+0.8 mg·L-16-芐氨基嘌呤(benzylaminopurine，6-BA)+30 g·L-1蔗糖+7 g·L-1瓊脂粉)上生長(zhǎng)，每隔30 d 繼代一次，生長(zhǎng)條件為14 h光照/10 h 黑暗，溫度24±2℃。選取長(zhǎng)勢(shì)一致(繼代20 d 左右)的組培苗，在繼代培養(yǎng)基中分別加入150 mmol·L-1NaCl和300 mmol·L-1甘露醇進(jìn)行處理，以正常繼代培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的組培苗(繼代20 d 左右)為對(duì)照。

1.2 基因克隆與序列分析

采用改良CTAB 法[39]提取紫弘富士(Malus domesticacv.Zihong Fuji，山東省果樹(shù)研究所選育品種)葉片RNA，用大連TaKaRa 公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM1STStrand cDNA Synthesis Kit(Code No.6 110A)合成cDNA。根據(jù)已鑒定的MdAP2/ERF基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物(表1)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min 20 s，56～61℃退火1 min 50 s，72℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物回收后連接到pMD19-T載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化E.coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。

根據(jù)測(cè)序獲得的cDNA 序列，利用NCBI的BLAST P(https:/ /blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)程序進(jìn)行同源序列比對(duì)；DNAMAN 6.0.3 軟件分析基因的ORF和氨基酸序列；MEGA 6.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。利用NCBI的Conserved Domains(https:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)和Pfam 31.0(http:/ /pfam.xfam.org/)程序預(yù)測(cè)蛋白保守域結(jié)構(gòu)。利用在線軟件CELLO v.2.5(http:/ /cello.life.nctu.edu.tw/)、PSORT Prediction(http:/ /psort.hgc.jp/form.html)和SoftBerry ProtComp 9.0 (http:/ /linux1.softberry.com/berry.phtml)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)[40-42]。

1.3 蘋(píng)果MdAP2/ERF組織表達(dá)分析

MdAP2/ERF組織表達(dá)數(shù)據(jù)來(lái)自NCBI GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為GSE42873，包含16個(gè)不同蘋(píng)果組織(來(lái)自蘋(píng)果10個(gè)不同基因型:M14 葉、M20 花后100 d 果實(shí)/采后果實(shí)、M49 葉、M67 花、M74 花/花后100 d 果實(shí)/采后果實(shí)、GD根/莖/幼苗、X4102幼苗、X8877根/莖、X4442×X2596種子和X3069×X922種子，2個(gè)重復(fù))的Array，Array 使用探針為蘋(píng)果基因組V1.0 數(shù)據(jù)庫(kù)MDP 識(shí)別號(hào)。蘋(píng)果AP2/ERF響應(yīng)斑點(diǎn)落葉病菌的RNA-seq 數(shù)據(jù)參考Zhu 等[43]的報(bào)道。采用2年生紅星離體葉片接種含有斑點(diǎn)落葉病原菌的PDA 培養(yǎng)基，分別侵染0、8、12、18、36、72 h。依據(jù)MdAP2/ERF基因的3′-UTR或5′-UTR 設(shè)計(jì)熒光定量引物(表1)，選取Md18S RNA為內(nèi)參基因，應(yīng)用IQ5 PCR 儀(美國(guó)Bio-Rad 公司)采用三步法進(jìn)行熒光定量PCR 分析。所有PCR 反應(yīng)均設(shè)3次重復(fù)。PCR 反應(yīng)體系:SYBR Green Master Ⅰ10 μL，上、下游引物(5 μmol·L-1)各1 μL，模板1 μL，補(bǔ)充去離子水至20 μL。PCR 反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性3 min；95℃變性10 s，58℃退火30 s，72℃延伸15 s，40個(gè)循環(huán)；最后退火至55℃，每隔7 s上升0.5℃至95℃，共81個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析[44]。

表1 引物序列及用途Table1 Application and primers of sequences

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋(píng)果AP2/ERF基因克隆

測(cè)序結(jié)果顯示，共克隆得到14個(gè)AP2/ERF基因。基因命名、開(kāi)放閱讀框、蛋白大小、分子量、等電點(diǎn)、所屬類型和GenBank 登錄號(hào)詳見(jiàn)表2。對(duì)14個(gè)AP2/ERF蛋白氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)蘋(píng)果AP2/ERF蛋白均含有AP2 保守結(jié)構(gòu)域(圖1)。其中，MdAP2D66-69 含有2個(gè)AP2 保守結(jié)構(gòu)域。

表2 蘋(píng)果AP2/ERF基因信息Table2 The MdAP2/ERF genes in apple

圖1 蘋(píng)果AP2/ERF蛋白的AP2 保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.1 Sequence analysis of the AP2 conserved domains in MdAP2/ERFproteins of apple

2.2 蘋(píng)果AP2/ERF進(jìn)化分析

通過(guò)引入已鑒定的擬南芥AP2/ERF蛋白，利用MEGA 6.0 軟件對(duì)MdAP2/ERF蛋白進(jìn)行進(jìn)化分析，從而確定MdAP2/ERF蛋白的分組[4，8]。由圖2可知，AP2/ERF家族分為4個(gè)亞家族:DREB、ERF、RAV和AP2。其中，DREB亞家族可進(jìn)一步分為A-1、A-2、A-3、A-4、A-5和A-6組；ERF亞家族可進(jìn)一步分為B-1、B-2、B-3、B-4、B-5和B-6組。蘋(píng)果AP2/ERF蛋白中MdERF12、MdERF37和MdERF20 分別屬于DREB亞家族A-2、A-4和A- 6組；MdERF15、MdERF14/21和MdERF9/10/13/30 分別屬于ERF亞家族B-3、B-5和B-6組；MdAP2D66/67/68/69屬于AP2亞家族。

圖2 蘋(píng)果和擬南芥AP2/ERF蛋白的進(jìn)化分析和亞家族分類Fig.2 Phylogenetic relationships and subfamily classification of AP2/ERFprotein from apple and Arabidopsis

2.3 蘋(píng)果AP2/ERF蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

通過(guò)SoftBerry ProtComp 9.0 軟件對(duì)MdAP2/ERF蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。由表3可知，MdERF9-10、MdERF12-15、MdERF20、MdERF30、MdERF37和MdAP2D66-69 定位在細(xì)胞核的預(yù)測(cè)數(shù)值均為最高(共10 分:數(shù)值越高表示可信度越大)，MdERF21 定位在線粒體的預(yù)測(cè)數(shù)值最高。進(jìn)一步利用CELLO和PORST 軟件進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)結(jié)果與SoftBerry ProtComp 9.0 分析結(jié)果相一致。由此判斷，MdERF9- 10、MdERF12-15、MdERF20、MdERF30、MdERF37和MdAP2D66-69 可能位于細(xì)胞核，MdERF21 可能位于線粒體。

2.4 蘋(píng)果AP2/ERF表達(dá)分析

利用NCBI 網(wǎng)站的GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)下載蘋(píng)果16個(gè)不同組織的Array(GSE42873)，檢測(cè)蘋(píng)果AP2/ERF基因在不同組織中的表達(dá)情況。由圖3可知，14個(gè)MdAP2/ERF基因在16個(gè)不同的被檢測(cè)組織中均有不同的相對(duì)表達(dá)水平，其中，MdERF12、MdERF15、MdERF10、MdAP2D67 在根中相對(duì)表達(dá)水平較高；MdERF12、MdERF21、MdAP2D68 在種子中相對(duì)表達(dá)水平較高。

進(jìn)一步檢測(cè)蘋(píng)果AP2/ERF基因在斑點(diǎn)落葉病菌侵染下的相對(duì)表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)MdERF20(A6)的轉(zhuǎn)錄水平受斑點(diǎn)落葉病菌侵染上調(diào)，在侵染72 h 后上調(diào)了22.3倍；MdERF12(A2)的轉(zhuǎn)錄水平在處理12 h和18 h 后下降，36 h 后上調(diào)2.2倍，72 h 后恢復(fù)CK水平；MdERF15(B3)的轉(zhuǎn)錄水平在處理12 h和18 h 后上調(diào)，36 h 后下調(diào)到CK的0.6倍，72 h 后恢復(fù)CK 水平；MdERF14和MdAP2D66/67/69的轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，其中在處理72 h 后MdAP2D69的轉(zhuǎn)錄水平僅為CK的0.1倍。其他AP2/ERF基因的轉(zhuǎn)錄水平無(wú)明顯變化(圖4)。

表3 蘋(píng)果AP2/ERF亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)Table3 Subcellular localization prediction of MdAP2/ERFproteins

由圖5可知，在正常生長(zhǎng)條件下，14個(gè)蘋(píng)果AP21ERF基因的相對(duì)表達(dá)水平無(wú)明顯變化；在150 mmol·L-1NaCl 處理下，與0 h相比，48 h時(shí)MdERF12(A2)、MdERF37 (A4)、MdERF20 (A6)、MdERF15(B3)、MdERF13(B6)、MdERF30(B6)和MDAP2D67相對(duì)表達(dá)水平升高，其中MdERF37(A4)和MdERF20(A6)的轉(zhuǎn)錄水平在處理48 h 后分別上調(diào)了25.1倍和50.3倍；而MdERF14(B5)和MdAP2D68 相對(duì)表達(dá)水平下調(diào)，其中MdERF14(B5)的轉(zhuǎn)錄水平在處理48 h后僅為0 h的0.14倍(圖5-B)。在300 mmol·L-1甘露醇處理下，與對(duì)照相比，MdERF37(A4)、MdERF15(B3)、MdERF10(B6)、MdERF30(B6)和MdAP2D66/67/68/69 相對(duì)表達(dá)水平升高，其中MdAP2D69的相對(duì)表達(dá)水平最高，在24 h時(shí)達(dá)到對(duì)照的26.3倍；而MdERF14(B5)相對(duì)表達(dá)水平下調(diào)，在處理48 h 后僅為對(duì)照的0.08倍(圖5-B)。此外，300 mmol·L-1甘露醇處理下，其他MdERF基因的相對(duì)表達(dá)水平無(wú)明顯變化(圖5-C)。

3 討論

AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子是植物最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一。擬南芥基因組中含有147個(gè)AP2/ERF蛋白[8]，根據(jù)氨基酸序列相似性和保守結(jié)構(gòu)域的數(shù)量可分為AP2、ERF(包含ERF和DREB)和RAV 三個(gè)亞家族[4，8]。本研究通過(guò)引入擬南芥AP2/ERF蛋白，對(duì)克隆的14個(gè)MdAP2/ERF蛋白進(jìn)行了亞家族分類，得到3個(gè)DREB 成員、7個(gè)ERF 成員和4個(gè)AP2 成員。進(jìn)一步研究斑點(diǎn)落葉病菌侵染、NaCl 與甘露醇脅迫下的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)DREB亞家族成員MdERF12(A2)對(duì)斑點(diǎn)落葉病菌侵染和NaCl 脅迫有響應(yīng)；MdERF37(A4)對(duì)NaCl和甘露醇脅迫有響應(yīng)；MdERF20(A6)對(duì)斑點(diǎn)落葉病菌侵染和NaCl 脅迫有響應(yīng)。研究表明，DREB 轉(zhuǎn)錄因子在應(yīng)答非生物脅迫過(guò)程中具有重要作用[4]。擬南芥A2組成員DREB2A和DREB2B的轉(zhuǎn)錄水平受到高鹽和干旱誘導(dǎo)，DREB2C、DREB2D和DREB2F轉(zhuǎn)錄水平受到高鹽誘導(dǎo)[4]，過(guò)表達(dá)擬南芥和玉米DREB2A能夠增強(qiáng)擬南芥和玉米的抗旱能力[17，45]。過(guò)表達(dá)擬南芥A4組成員HARDY能夠增加植株的抗鹽和抗旱容忍力[46]。擬南芥A6組RAP2.4轉(zhuǎn)錄水平受到鹽和干旱誘導(dǎo)，過(guò)表達(dá)RAP2.4 能夠增強(qiáng)植株的抗旱能力[47]。此外，過(guò)量表達(dá)罌粟(Papaver somniferum)A6組PsAP2 能夠增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)病原菌、鹽和甘露醇脅迫的抗性[48]。本研究中，MdERF12(A2)、MdERF37(A4)和MdERF20(A6)轉(zhuǎn)錄水平受到NaCl 脅迫誘導(dǎo)；MdERF37 轉(zhuǎn)錄水平受到甘露醇脅迫誘導(dǎo)，表明DREB 轉(zhuǎn)錄因子MdERF12、MdERF37和MdERF20 可能在蘋(píng)果高鹽或滲透脅迫過(guò)程中具有重要作用，部分成員MdERF12和MdERF20 在生物脅迫中也可能具有一定作用。

圖3 蘋(píng)果AP2/ERF基因多個(gè)組織表達(dá)熱圖Fig.3 Expression profiles of MdAP2/ERF genes in various tissues of apple

圖4 蘋(píng)果AP2/ERF基因在斑點(diǎn)落葉病菌侵染下的表達(dá)熱圖Fig.4 Expression profiles of AP2/ERF genes in response to Alternaria alternata apple pathotype infection

ERF亞家族成員在植物應(yīng)答生物和非生物脅迫過(guò)程中也具有重要作用。擬南芥B3組ERF 成員AtERF1、AtERF2、ERF5 與ERF6 均能夠受到滲透脅迫誘導(dǎo)[20]。模擬酸雨脅迫下BrERF2 基因的表達(dá)量發(fā)生變化，表明其可能參與青花菜抗酸雨脅迫的應(yīng)答機(jī)制[49]。小麥B3組ERF 基因TaPIEP1 受根腐離蠕孢(Bipolaris sorokiniana)誘導(dǎo)，過(guò)表達(dá)可顯著提高小麥植株的抗病性[50]。過(guò)量表達(dá)B3組ERF 基因NtERF5 與GbERF2的轉(zhuǎn)基因煙草可以明顯增強(qiáng)對(duì)煙草花葉病毒與褐斑病的抗性[51]。水稻OsERF96 可應(yīng)答白葉枯病或稻瘟病病原菌的浸染，其啟動(dòng)子是一個(gè)對(duì)病原菌侵染產(chǎn)生應(yīng)答的誘導(dǎo)性啟動(dòng)子[52]。過(guò)量表達(dá)紫花針茅(Stipa purpurea)B3組ERF 成員SpERF1的轉(zhuǎn)基因擬南芥可明顯提高對(duì)干旱的容忍力[53]。硬質(zhì)小麥B6組ERF 成員TdSHN1 受鹽、干旱、ABA和低溫誘導(dǎo)，并且在轉(zhuǎn)基因酵母中過(guò)量表達(dá)該基因能夠增強(qiáng)對(duì)鹽、滲透和低溫的容忍力[54]。本研究中，MdERF12(B3)的轉(zhuǎn)錄響應(yīng)水平斑點(diǎn)落葉病菌侵染和鹽脅迫；MdERF10(B6)、MdERF13(B6)和MdERF30(B6)的轉(zhuǎn)錄水平響應(yīng)NaCl 脅迫處理，對(duì)甘露醇脅迫處理也有部分應(yīng)答，表明B3組ERF 成員MdERF12 可能在蘋(píng)果調(diào)控生物脅迫和非生物脅迫過(guò)程中起到重要作用；B6組ERF成員MdERF10/13/30 可能在蘋(píng)果調(diào)控非生物脅迫過(guò)程中起到重要作用。

此外，AP2亞家族成員不僅在植物生長(zhǎng)和發(fā)育等進(jìn)程具有重要作用[26-29]，而且在生物和非生物脅迫中也起關(guān)鍵作用[55-56]。過(guò)量表達(dá)煙草Tsi1 不僅能夠增強(qiáng)植株的抵抗病原菌的能力，還能夠增強(qiáng)植株的滲透脅迫能力[55]。胡椒(Capsicum annuumcv.Bukang)CaPF1 受乙烯(ethylene，ET)、茉莉酸(jasmonic acid，JA)和冷脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，過(guò)表達(dá)該基因不僅可以提高擬南芥對(duì)低溫的抗性，而且可以提高對(duì)丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000)的抗性[56]。本研究中，蘋(píng)果AP2 成員MdAP2D66/67/69的轉(zhuǎn)錄水平受到斑點(diǎn)落葉病菌侵染下調(diào)，多數(shù)成員的轉(zhuǎn)錄水平在NaCl 脅迫處理下無(wú)明顯變化，但全部成員MdAP2D66/67/68/69的轉(zhuǎn)錄水平均受甘露醇脅迫處理誘導(dǎo)，表明MdAP2D66/67/68/69 可能在病原菌應(yīng)答過(guò)程和滲透脅迫中具有重要作用。

4 結(jié)論

本研究克隆了14個(gè)MdAP2/ERF基因，其中，MdERF12、MdERF37和MdERF20 分別屬于DREB亞家族A-2、A-4和A-6組；MdERF30、MdERF15、MdERF14/MdERF21和MdERF9/MdERF10/MdERF13分別屬于ERF亞家族B-1、B-3、B-5和B-6組；MdAP2D66-69屬于AP2亞家族。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)表明，除MdERF21 定位于線粒體外，其他成員均定位于細(xì)胞核。Array和RT-qPCR 分析表明，MdAP2/ERF基因在斑點(diǎn)落葉病菌、NaCl和甘露醇脅迫下表達(dá)水平被誘導(dǎo)上調(diào)或下調(diào)，推測(cè)其可能參與調(diào)控蘋(píng)果生物脅迫和非生物脅迫應(yīng)答的過(guò)程，為進(jìn)一步揭示蘋(píng)果AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育以及逆境響應(yīng)等機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。