李文濤 張紅兵 李會(huì)宣 史秀英 李磊

摘 要：石化能源枯竭和生態(tài)環(huán)境的惡化迫使人們必須高度重視能源的清潔和可持續(xù)性，而微藻具有生長(zhǎng)快、易培養(yǎng)、種類繁多、功能各異等優(yōu)點(diǎn)為國(guó)內(nèi)外學(xué)者所青睞，也是生產(chǎn)清潔可持續(xù)生物質(zhì)的最佳選擇。微藻的篩選、分類、鑒定是研究其生理生化特征的基礎(chǔ)，因此保障篩選、鑒定和分類的準(zhǔn)確至關(guān)重要。隨著科技的發(fā)展，人們對(duì)于微藻分類鑒定方法的探索仍未終止。該文闡述了近年來用于篩選純化微藻的方法及其優(yōu)劣，分析并展望了微藻分類和鑒定的發(fā)展方向，旨在為微藻的相關(guān)研究提供參考。

關(guān)鍵詞：微藻;篩選;分類

中圖分類號(hào) Q939.99文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731（2020）05-0026-04

Progress in Screening and Classification Methods of Microalgae

Li Wentao et al.

（Biological Science and Engineering Institute，Hebei University of Economics and Business，Shijiazhuang 050061，China）

Abstract： In recent years，the depletion of petrochemical energy and the deterioration of the ecological environment have forced people to attach great importance to the cleanliness and sustainability of energy. However，microalgae have the advantages of fast growth，easy cultivation，various types and different functions，which are favored by scholars at home and abroad，it is also the best choice to produce clean and sustainable biomass. The screening，classification and identification of microalgae are the basis for studying their physiological and biochemical characteristics，so it is essential to ensure the accuracy of screening，identification and classification. With the development of science and technology，the exploration of microalgae classification and identification methods has not stopped ，in this paper，the methods for screening and purifying microalgae and their advantages and disadvantages are reviewed. The research progress of microalgae classification and identification is analyzed and the reference for microalgae research is provided.

Key words： Microalgae ;Screening ;Classification

18世紀(jì)工業(yè)革命以來，化石能源的消耗與日俱增，導(dǎo)致生態(tài)系統(tǒng)嚴(yán)重惡化、環(huán)境污染日趨加劇，研發(fā)清潔可再生能源成為當(dāng)務(wù)之急。微藻（microalgae）廣泛分布于各類水域中，是一類可以自養(yǎng)的單細(xì)胞生物，種類多樣、光合作用效率高、生長(zhǎng)速度快，是生態(tài)系統(tǒng)中的初級(jí)生產(chǎn)者，作為生物能源的開發(fā)潛力巨大。西方發(fā)達(dá)國(guó)家已經(jīng)利用微藻生物質(zhì)生產(chǎn)生物柴油或生物酒精[1，2]，我國(guó)程軍[3]等利用微藻轉(zhuǎn)化制航油也取得較好效果。除此之外，某些種屬的微藻成分具有很高的藥用價(jià)值，其中典型的微藻多糖具有提高機(jī)體免疫力的作用，可抗癌、抗衰老、抗疲勞、抗輻射損傷，已經(jīng)用于醫(yī)療保健[4-6]及制作功能食品[7]。另外，微藻也可作為飼料[8]、餌料和食品添加劑[9]，增強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)。更加有意義的是，微藻可以利用污水中的無機(jī)、有機(jī)等污染物生長(zhǎng)，并通過生物積累、生物吸附、生物轉(zhuǎn)化和生物絮凝等方式減緩污染，實(shí)現(xiàn)微藻生長(zhǎng)和環(huán)境污染治理的耦合，這種方式引起國(guó)內(nèi)外廣泛重視[10-12]，成為近年來微藻養(yǎng)殖和污水處理領(lǐng)域的新趨勢(shì)。

微藻種類繁多，能力各異，實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)優(yōu)化和環(huán)保應(yīng)用需要探究其理化特性，首先就必須對(duì)微藻進(jìn)行科學(xué)篩選和分類，因此有必要討論篩選和分類的傳統(tǒng)方法與現(xiàn)代方法之間的差異，比較其優(yōu)劣，以便篩選和分類工作能夠快速準(zhǔn)確。

1 微藻的篩選

微藻篩選方法與微生物的篩選方法類似，先采用選擇性培養(yǎng)基從基質(zhì)中進(jìn)行篩選，然后結(jié)合顯微鏡下微藻的形態(tài)及理化性質(zhì)進(jìn)行初步判斷。隨著電子技術(shù)發(fā)展，儀器設(shè)備的不斷更新，結(jié)合儀器進(jìn)行篩選的先進(jìn)方法得以建立，使得篩選工作逐步簡(jiǎn)化，效率提高。

1.1 傳統(tǒng)篩選方法 傳統(tǒng)篩選方法通常是利用毛細(xì)管法、平板法和逐級(jí)稀釋法[13]，根據(jù)微藻的表型結(jié)構(gòu)、鞭毛有無、顏色等指標(biāo)來分離樣品中的微藻。但這些因素易受周圍環(huán)境條件的影響，而且一些同種類型的微藻也會(huì)因自身生長(zhǎng)狀態(tài)的不同而存在差異，另有一些親緣關(guān)系較近的物種差異也較小，如：甲藻門的亞歷山大藻屬的某些種類，僅細(xì)胞壁上少數(shù)甲片的結(jié)構(gòu)有差別[14]。此外，傳統(tǒng)方法篩選速度慢、周期長(zhǎng)，對(duì)操作人員的業(yè)務(wù)素質(zhì)要求較高，因此這種方法有很大局限性。

1.2 儀器設(shè)備篩選方法 傳統(tǒng)篩選方法效率低、盲目性較大、且操作過程繁瑣、費(fèi)用高，不適于微藻的大批量篩選。為此許多國(guó)內(nèi)外學(xué)者開始嘗試借助于先進(jìn)儀器進(jìn)行微藻篩選。例如，韓煒[15]等利用96孔板轉(zhuǎn)盤系統(tǒng)篩選微藻，篩選效果與傳統(tǒng)的篩選方式相比有較好的一致性，且篩選速度快。李青[16]等對(duì)產(chǎn)油小球藻（Chlorella zofingensis）進(jìn)行紫外誘變，經(jīng)尼羅紅染色后結(jié)合流式細(xì)胞儀，篩選出高含油的小球藻藻株，實(shí)現(xiàn)了對(duì)特定微藻的篩選，取得顯著效果。

2 微藻的分類

2.1 傳統(tǒng)分類方法 傳統(tǒng)分類方法依據(jù)的是微藻細(xì)胞形態(tài)、大小、生理等指標(biāo)特性，但由于不同培養(yǎng)基或不同生長(zhǎng)階段的微藻特征有差異，導(dǎo)致判斷標(biāo)準(zhǔn)難以把握，同時(shí)這種方法難以正確地揭示一些微藻物種之間的親緣關(guān)系，導(dǎo)致在某些微藻屬、種的分類上造成混亂。

2.2 分子生物學(xué)方法 分子生物學(xué)分類技術(shù)中，常用以同工酶和蛋白質(zhì)以及DNA多態(tài)性為基礎(chǔ)進(jìn)行分析分類[17]。

2.2.1 同工酶和蛋白質(zhì)分析技術(shù) 不同微藻種、屬間，其各酶系統(tǒng)中的同工酶酶譜帶和某些蛋白質(zhì)的基因型存在差異，因此，依據(jù)不同微藻同工酶和蛋白質(zhì)作為物種的分類方法也是可行途徑[18]，且這2種方法酶帶少而明確，工作量小。但是，同工酶和蛋白質(zhì)的可標(biāo)記位點(diǎn)有限，提供的信息較少，且化學(xué)成分差異較小不穩(wěn)定;同時(shí)它們易受基因和多種內(nèi)外環(huán)境因素的影響，因此，在某些微藻屬、種的分類和鑒定時(shí)，很難得到準(zhǔn)確的結(jié)果。

2.2.2 DNA多態(tài)性分析技術(shù) DNA多態(tài)性分析技術(shù)是以基因序列為基礎(chǔ)，根據(jù)基因序列間差異進(jìn)行比較、分析確定其分類，該技術(shù)最為直接有效。而不同微藻之間的差異是因其基因組DNA堿基序列間不同引起的，因此，只要測(cè)出微藻基因組序列，比較其差異，就可以進(jìn)行分類，其結(jié)果可靠、準(zhǔn)確性高。但是，微藻的基因組DNA較為龐大復(fù)雜，且種類繁多，全部測(cè)序耗財(cái)、耗力、耗時(shí)。而目前所采用的主要手段是從基因組中選擇有代表性的某些片段作為分類標(biāo)準(zhǔn)，通過分析片段間的差異，以確定物種間的遺傳差異，達(dá)到準(zhǔn)確分類。

目前在基因水平的分類研究中，主要以線粒體基因組（mitochondrial DNA）、葉綠體基因組（chloroplast DNA）和核基因組（nDNA）的基因序列及其內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)Ⅰ和Ⅱ作為分類依據(jù)[14]。例如，許多國(guó)外研究者利用mtDNA中的細(xì)胞色素c氧化酶基因做藻類分類，通過對(duì)細(xì)胞色素c氧化酶亞基Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，分類效果較好[19-20];但是mtDNA重排率高、突變率低，進(jìn)化速度慢，鑒別位點(diǎn)有限，在同源性分析上受到一定影響，同時(shí)在微藻基因組中的拷貝數(shù)低，提取純化困難，所以在微藻分類中應(yīng)用有限，一般運(yùn)用于較高等級(jí)的分類，如屬間、科間甚至更高。而在藻類cpDNA中，由于序列差異比較大，多數(shù)在120～220kb之間，所以研究起來較為方便。實(shí)驗(yàn)表明，任何2種植物之間其cp DNA至少有30%的同源性，同源性越高，它們?cè)诜诸惾褐杏H緣關(guān)系就越近[21]。而目前對(duì)微藻進(jìn)行屬及以上水平進(jìn)行分類時(shí)，cp DNA中的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶大亞基（rbcL）基因使用者較多，且分類結(jié)果可靠[22-24]。核糖體基因功能同源且古老，既含有保守區(qū)又含有可變區(qū)，且具有高度重復(fù)序列，如：編碼核糖體RNA（rDNA）的基因和轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS），因此可作為微藻分類依據(jù)。而在核糖體基因分類研究中18srDNA和ITS使用者較多，因其分子大小適合操作，效果顯著，被廣泛應(yīng)用于微藻分類學(xué)研究[25-29]。但是，ITS序列在微藻種內(nèi)高度保守，而在種間差異較大，適宜于不同種間的分類，不適宜于科及以上水平的分類。

3 其他分類方法

3.1 光譜 微藻色素豐富，種類多樣，色素成分和濃度差異導(dǎo)致其光譜信息，如吸收光譜，熒光光譜和拉曼光譜存在一定差異，根據(jù)差異可以反推或間接確定微藻的種類，因此結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，利用紅外光譜能夠進(jìn)行微藻的快速鑒定、判別和分類[30]。如Lin[31]等人利用高光譜顯微成像系統(tǒng)鑒定形態(tài)相似的銅綠微囊藻，然后使用Fisher算法來識(shí)別微藻物種，其敏感性和特異性很高，結(jié)果證明了這種方法可以快速方便地對(duì)微藻進(jìn)行分類，并且還可以獲取樣本的數(shù)量和空間信息。朱慧云[32]等使用已建立的光譜采集系統(tǒng)可有效地識(shí)別4種微藻種，為微藻種的鑒定和分類提供了新的途徑。使用Vis/NIR光譜儀和便攜式光學(xué)探針的方法適用于各種微藻物種，是一種快速、精確、無損的檢測(cè)方法。

3.2 變性梯度凝膠電泳技術(shù) 變性梯度凝膠電泳技術(shù)（DGGE）是一種重要的分子多態(tài)性技術(shù)，在物種鑒定及浮游生物群落多樣性研究方面有著廣泛的應(yīng)用[33]，而將DGGE技術(shù)運(yùn)用到微藻鑒定中也有許多研究[34]，通常選擇18S rDNA和28S rDNA的片段或其它區(qū)間作為特征區(qū)域，通過DGGE電泳，從而獲得微藻的特征性條帶進(jìn)行微藻分類。通過DGGE技術(shù)對(duì)藻類的特征區(qū)域進(jìn)行差異性分析，可以達(dá)到較好的區(qū)分效果，同時(shí)根據(jù)其條帶強(qiáng)弱還能觀測(cè)出樣品中的優(yōu)勢(shì)微類。但是，該技術(shù)所需設(shè)備昂貴，對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件有一定的要求，且操作繁瑣，耗時(shí)耗力，不適于批量操作。

4 展望

隨著微藻生物應(yīng)用和微藻功能研究的不斷深入，正確篩選鑒定和分類是基礎(chǔ)，也是一項(xiàng)嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。對(duì)微藻進(jìn)行篩選時(shí)，平板劃線法雖然操作繁瑣耗時(shí)長(zhǎng)卻是最可靠穩(wěn)妥的方法，操作也較為簡(jiǎn)單，目前微藻篩選方面需亟待解決的仍然是篩選方法及周期問題。

對(duì)微藻分類時(shí)，特別是依據(jù)形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行表征時(shí)，僅通過普通光學(xué)顯微鏡難以觀測(cè)其表型結(jié)構(gòu)，而電子顯微鏡價(jià)格昂貴，此外，一些微藻形態(tài)、大小和表型結(jié)構(gòu)在不同生長(zhǎng)期會(huì)發(fā)生變化或未表露出來，以至于無法做出準(zhǔn)確的判斷。目前，對(duì)微藻分類多采用傳統(tǒng)分類結(jié)合分子技術(shù)手段進(jìn)行，在分子生物學(xué)中，線粒體基因組（mitochondrial DNA;mtDNA）、葉綠體基因組（chloroplast DNA; cpDNA）和核基因組（nDNA）的基因序列及其轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)3者的方法使用較多，是快速鑒定方法。但是，僅依靠1種判斷依據(jù)對(duì)近緣種屬間微藻進(jìn)行分類時(shí)，結(jié)果會(huì)有一定誤差，因此需要選用多個(gè)判斷標(biāo)準(zhǔn)，多重比較才能得出較準(zhǔn)確的結(jié)論。選擇ITS1-2和葉綠體中rbcL以及18sRDNA特征區(qū)域作為判斷依據(jù)是最經(jīng)濟(jì)有效可行的手段，目前最為廣泛使用。此外，微藻分類研究中，基因組DNA提取不易，試劑盒昂貴，應(yīng)尋找更為方便快捷的提取基因組方法，或直接利用PCR方法擴(kuò)增特征區(qū)域，使實(shí)驗(yàn)更高效。

對(duì)微藻鑒定時(shí)，通常先將序列比對(duì)，然后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析確定其在遺傳系統(tǒng)中的地位。此外，今后藻類分類學(xué)研究不能僅僅局限于尋求新的分子指標(biāo)，也需要借助當(dāng)前先進(jìn)儀器，創(chuàng)新思維并尋求更合適的分類方法，還應(yīng)該去發(fā)現(xiàn)某些藻類特有組分，為藻類分類學(xué)研究提供準(zhǔn)確依據(jù)。

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（責(zé)編：張 麗）