(商洛市中心醫(yī)院急診科，陜西 商洛726000)

膿毒癥及并發(fā)休克是目前ICU患者的主要死亡原因之一[1]。感染引發(fā)的免疫反應(yīng)將炎癥因子作用于血管內(nèi)皮細胞，導致血管內(nèi)皮細胞功能受損是膿毒癥的病理基礎(chǔ)[2]。同時病原菌入侵機體釋放的內(nèi)毒素引發(fā)血管內(nèi)皮細胞中鈣濃度異常升高(鈣超載)，導致血管內(nèi)皮屏障功能受損，通透性增加，炎癥因子和病原菌可進入組織間隙，引發(fā)全身性炎癥反應(yīng)[3]。脂多糖活化Toll樣受體4(Toll-like receptor4,Tlr4)激活腫瘤壞死因子相關(guān)受體，活化核轉(zhuǎn)錄因子-κB(Nuclear transcription factor-κB,NF-κB)，誘發(fā)炎性介質(zhì)的分泌與釋放是細菌內(nèi)毒素引發(fā)炎癥反應(yīng)的經(jīng)典信號通路[4]。目前關(guān)于脂多糖誘導的細胞鈣超載機制尚未明確；作為體內(nèi)主要的第二信使，鈣離子的產(chǎn)生、流動與L型鈣通道、ATP酶等多種分子通路有關(guān)[5]，但脂多糖誘導的Tlr4活化與細胞內(nèi)外鈣流動相關(guān)的信號通路仍未闡明。相關(guān)研究顯示，細菌內(nèi)毒素能夠活化血管內(nèi)皮細胞表面的Tlr4和髓質(zhì)分化蛋白2復(fù)合物[6]；基質(zhì)相互作用分子1(Recombinant Human Stromal Interaction Molecule 1,Stim1)是細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面的鈣離子感受器，活化后的Stim1可激活細胞膜上的鈣池調(diào)控鈣離子通道，引發(fā)細胞外鈣離子內(nèi)流[7]。本研究使用脂多糖在體外誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞，構(gòu)建血管內(nèi)皮細胞損傷模型，分析細胞損傷過程中Tlr4、髓質(zhì)分化蛋白2、NF-κB、Stim1、白細胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、TNF-α的表達變化，旨在探討炎癥反應(yīng)及細胞內(nèi)鈣濃度異常升高在膿毒癥發(fā)展過程中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人臍靜脈內(nèi)皮細胞購于上海斯信生物科技有限公司；Stim1抑制表達載體、Tlr4抑制表達載體由上海權(quán)陽生物科技有限公司構(gòu)建；脂多糖、鈣離子熒光探針、NF-κB抑制劑PDTC購于海德創(chuàng)業(yè)(北京)生物科技有限公司；鼠抗人Stim1、髓質(zhì)分化蛋白2、NF-κB、GAPDH單克隆抗體，山羊抗鼠IgG購于艾美捷科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 脂多糖誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞中Tlr4、髓質(zhì)分化蛋白2、NF-κB mRNA表達水平檢測 使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞，傳至5代后取對數(shù)生長期細胞，使用濃度為1 mg/L的脂多糖刺激細胞，使用RT-PCR檢測脂多糖刺激前和刺激后1h、2h、6h、12h、24h的Tlr4、髓質(zhì)分化蛋白2、NF-κB mRNA的表達水平，引物序列由上海權(quán)陽生物科技有限公司合成；基質(zhì)相互作用蛋白1由上海百力格生物技術(shù)有限公司完成，其中Tlr4上游：5′-AGGACACA CTTTAACAATAGGCGA-3′，下游：5′-GCAATGCGATTGATACTCCC-3′；髓質(zhì)分化蛋白2上游：5′-GTGGTTTGCACCGA ACGG TCG GG-3′，下游：5′-GGAGACTG TGTACGTCGT TAG GCG-3′；NF-κB上游：5′-TGTTAAGGCGTCG AAAA TCT-3′，下游：5′-CTATGTAACTACTCAAACCT-3′；GAPDH上游：5′-GTAG AGGTGAG TCGTTCTCCG ACC-3′，下游：5′-GAGGTTAGTTCCAACAG CCGAA-3′。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，共40個循環(huán)，延伸72 ℃ 30 s。擴增產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳，計算Stim1、髓質(zhì)分化蛋白2、NF-κB mRNA的相對表達量。

1.2.2 Stim1對脂多糖誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞鈣流動的檢測 人臍靜脈內(nèi)皮細胞接種于6孔板中常規(guī)培養(yǎng)12 h后分為空白對照組、脂多糖組、Stim1抑制表達載體轉(zhuǎn)染組、Stim1抑制表達載體+脂多糖組，轉(zhuǎn)染2 h，加入鈣離子熒光探針室溫下反應(yīng)30 min，脂多糖刺激人臍靜脈內(nèi)皮細胞，激光共聚焦顯微鏡檢測細胞中鈣離子濃度變化。

1.2.3 Tlr4對人臍靜脈內(nèi)皮細胞中鈣超載的影響

人臍靜脈內(nèi)皮細胞接種于6孔板中常規(guī)培養(yǎng)12 h后，分為空白對照組、脂多糖組、Tlr4抑制表達載體轉(zhuǎn)染組、Tlr4抑制表達載體+脂多糖組、Tlr4及Stim1抑制表達載體+脂多糖組，轉(zhuǎn)染2 h，加入鈣離子熒光探針室溫下反應(yīng)30 min，脂多糖刺激人臍靜脈內(nèi)皮細胞，激光共聚焦顯微鏡檢測細胞中鈣離子濃度變化。

1.2.4 免疫共沉淀法分析Tlr4對人臍靜脈內(nèi)皮細胞中Stim1、髓質(zhì)分化蛋白2、NF-κB蛋白表達的影響 人臍靜脈內(nèi)皮細胞接種于6孔板中常規(guī)培養(yǎng)12 h后，分為空白對照組、脂多糖組、Tlr4抑制表達載體+脂多糖組，轉(zhuǎn)染12 h，脂多糖刺激6 h。RIPA提取細胞總蛋白50 μg，每組滴加1 μg Tlr4抗體，4 ℃孵育2 h，滴加Protein A/G瓊脂糖30 μL過夜，預(yù)冷的細胞裂解液洗滌后，沉淀物行SDS-PAGE電泳，濕法轉(zhuǎn)至PVDF膜，滴加鼠抗人Stim1單克隆抗體(1∶500)，鼠抗人髓質(zhì)分化蛋白2、NF-κB單克隆抗體(1∶200)，鼠抗人GAPDH單克隆抗體(1∶1 000)，4 ℃過夜，滴加HRP標記的山羊抗鼠IgG(1∶2 000)，室溫靜置2 h，ECL顯色，暗室中顯影、采集圖像并分析各條帶灰度值。

1.2.5 NF-κB對脂多糖誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞炎性介質(zhì)及Stim1、NF-κB mRNA表達的影響 人臍靜脈內(nèi)皮細胞接種于6孔板中常規(guī)培養(yǎng)12 h后，分為空白對照組、脂多糖組、0.1 mg/L、1 mg/L PDTC組(脂多糖與PDTC共同刺激)、Tlr4抑制表達載體轉(zhuǎn)染1 h、12 h組。酶聯(lián)免疫吸附法檢測細胞培養(yǎng)液上清中IL-6、TNF-α濃度。RIPA裂解液提取細胞總RNA，RT-PCR法檢測Stim1、NF-κB mRNA表達水平。

1.3 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)使用SPSS23.0處理，以均數(shù)±標準差表示，進行t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 脂多糖刺激不同時間Tlr4、髓質(zhì)分化蛋白2、NF-κB mRNA表達

脂多糖刺激人臍靜脈內(nèi)皮細胞2 h、6 h、12 h時Tlr4、髓質(zhì)分化蛋白2、NF-κB mRNA相對表達量明顯高于刺激前(P<0.05)；脂多糖刺激6 h時Tlr4、髓質(zhì)分化蛋白2、NF-κB mRNA相對表達量達到峰值。表1，圖1，圖2。

表1 脂多糖刺激不同時間Tlr4、髓質(zhì)分化蛋白2、NF-ΚB mRNA表達

與刺激前比較，aP<0.05(n=6)

圖1 脂多糖刺激不同時間Tlr4、髓質(zhì)分化蛋白2、NF-κB mRNA表達變化

圖2 脂多糖刺激不同時間Tlr4、髓質(zhì)分化蛋白2、NF-κB mRNA表達的電泳圖1：刺激前；2：刺激后1 h；3：刺激后2 h；4：刺激后6 h；5：刺激后12 h；6：刺激后24 h

2.2 Stim1對脂多糖誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞鈣流動的影響

空白對照組、脂多糖組、Stim1抑制表達載體轉(zhuǎn)染組、Stim1抑制表達載體+脂多糖組人臍靜脈內(nèi)皮細胞中鈣離子濃度分別為(42.68±12.31)、(110.24±19.65)、(31.55±10.07)、(63.72±12.90) nmol/L。脂多糖組鈣離子濃度明顯高于空白對照組，Stim1抑制表達載體轉(zhuǎn)染組鈣離子濃度明顯低于空白對照組，Stim1抑制表達載體+脂多糖組鈣離子濃度明顯低于脂多糖組(P<0.01)；Stim1抑制表達載體轉(zhuǎn)染可顯著逆轉(zhuǎn)脂多糖誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞外鈣離子內(nèi)流。見圖3。

圖3 Stim1對脂多糖誘導各組人臍靜脈內(nèi)皮細胞中鈣離子濃度比較1：空白對照組；2：脂多糖組；3：Stim1抑制表達載體轉(zhuǎn)染組；4：Stim1抑制表達載體+脂多糖組

2.3 Tlr4對脂多糖誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞鈣流動的影響

空白對照組、脂多糖組、Tlr4抑制表達載體轉(zhuǎn)染組、Tlr4抑制表達載體+脂多糖組、Tlr4及Stim1抑制表達載體+脂多糖組人臍靜脈內(nèi)皮細胞中鈣離子濃度分別為(43.24±10.51)、(111.50±19.73)、(42.93±9.75)、(51.88±9.16)、(40.29±7.53) nmol/L。脂多糖組鈣離子濃度明顯高于空白對照組、Tlr4抑制表達載體轉(zhuǎn)染組(P<0.01)；鈣離子濃度在空白對照組與Tlr4抑制表達載體轉(zhuǎn)染組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；Tlr4抑制表達載體+脂多糖組、Tlr4及Stim1抑制表達載體+脂多糖組鈣離子濃度明顯低于脂多糖組，其中Stim1抑制表達載體+脂多糖組下降最明顯(P<0.05)。見圖4。

2.4 脂多糖誘導Tlr4與髓質(zhì)分化蛋白2蛋白結(jié)合

免疫共沉淀分析顯示，空白對照組、脂多糖組、Tlr4抑制表達載體+脂多糖組抗Tlr4抗體沉淀物中髓質(zhì)分化蛋白2蛋白相對表達量分別為(2.68±0.24)、(4.41±0.56)、(1.83±0.18)。脂多糖組髓質(zhì)分化蛋白2蛋白相對表達量明顯高于空白對照組，Tlr4抑制表達載體+脂多糖組髓質(zhì)分化蛋白2蛋白相對表達量明顯低于脂多糖組(P<0.05)?？瞻讓φ战M、脂多糖組、Tlr4抑制表達載體+脂多糖組抗Tlr4抗體沉淀物中均未檢測出Stim1、NF-κB蛋白表達。見圖5，圖6。

圖4 Tlr4對脂多糖誘導各組人臍靜脈內(nèi)皮細胞中鈣離子濃度1：空白對照組；2：脂多糖組；3：Tlr4抑制表達載體轉(zhuǎn)染組；4：Tlr4抑制表達載體+脂多糖組；5：Tlr4及Stim1抑制表達載體+脂多糖組

圖5 抗Tlr4抗體沉淀物中髓質(zhì)分化蛋白2蛋白表達1：空白對照組；2：脂多糖組；3：Tlr4抑制表達載體+脂多糖組

圖6 各組髓質(zhì)分化蛋白2蛋白相對表達量比較1：空白對照組；2：脂多糖組；3：Tlr4抑制表達載體+脂多糖組

2.5 Tlr4、髓質(zhì)分化蛋白2對細胞炎性因子及細胞鈣信號的調(diào)節(jié)作用

脂多糖組IL-6、TNF-α濃度及Stim1、NF-κB mRNA表達水平均明顯高于空白對照組(P<0.01)；與脂多糖組相比，0.1 mg/L PDTC組、1 mg/L PDTC組、Tlr4抑制表達載體轉(zhuǎn)染12 h組IL-6水平明顯降低(P<0.05)，而Tlr4抑制表達載體轉(zhuǎn)染1 h組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與脂多糖組相比，1 mg/L PDTC組TNF-α水平明顯降低(P<0.01)，而0.1 mg/L PDTC組、Tlr4抑制表達載體轉(zhuǎn)染1 h及12 h組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。1 mg/L PDTC組、Tlr4抑制表達載體轉(zhuǎn)染12 h組Stim1、NF-κB mRNA表達水平明顯低于脂多糖組(P<0.05)。見表2。

表2 Tlr4、髓質(zhì)分化蛋白2對細胞炎性因子及細胞鈣信號的調(diào)節(jié)作用

與空白對照組比較，aP<0.01；與脂多糖組比較，bP<0.05

3 討 論

細菌內(nèi)毒素通過與髓質(zhì)分化蛋白2特異性結(jié)合后激活細胞內(nèi)信號，Tlr4在此過程中具有重要作用[8-10]。相關(guān)研究顯示，體外肝素預(yù)處理后，可拮抗脂多糖誘導的IL-6、粒細胞集落刺激因子水平上調(diào)，與激活Tlr4通路有關(guān)[11-12]。本研究顯示，脂多糖可上調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細胞Tlr4表達，且髓質(zhì)分化蛋白2表達水平也明顯提升，具有明顯的時間依賴性，在脂多糖刺激6 h時Tlr4、髓質(zhì)分化蛋白2水平達到峰值。提示細菌內(nèi)毒素通過活化細胞膜受體來發(fā)揮啟動炎性介質(zhì)的效應(yīng)。同時脂多糖啟動炎性介質(zhì)分泌的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB也具有明顯的時間依賴性，且與Tlr4、髓質(zhì)分化蛋白2變化趨勢一致，提示細菌內(nèi)毒素激活炎性介質(zhì)生存的信號通路從活化受體Tlr4、髓質(zhì)分化蛋白2到NF-κB大量分泌具有同步性特征，為抑制細菌內(nèi)毒素炎性介質(zhì)的產(chǎn)生提供了參考。

本研究顯示，脂多糖刺激人臍靜脈內(nèi)皮細胞可引發(fā)鈣離子內(nèi)流增加，細胞內(nèi)鈣濃度異常升高；下調(diào)鈣離子通道蛋白Stim1表達后可有效逆轉(zhuǎn)脂多糖誘導的細胞外鈣離子內(nèi)流。提示Stim1可作為內(nèi)毒素引發(fā)細胞內(nèi)鈣超載的作用靶點，特異性阻斷細胞外鈣離子內(nèi)流。正常生理狀態(tài)下Tlr4表達下調(diào)后對細胞外鈣離子內(nèi)流無明顯影響，但能夠有效逆轉(zhuǎn)脂多糖誘發(fā)的細胞外鈣離子內(nèi)流。提示脂多糖誘發(fā)的鈣超載與Tlr4明顯相關(guān)，作用機制可能與Tlr4激活細胞內(nèi)信號有關(guān)。同時轉(zhuǎn)染Tlr4與Stim1后脂多糖誘發(fā)的細胞外鈣離子內(nèi)流進一步減少，提示Tlr4與Stim1可能共同介導了細菌內(nèi)毒素引發(fā)的鈣超載。免疫共沉淀檢測顯示，正常生理狀態(tài)下血管內(nèi)皮細胞中Tlr4與髓質(zhì)分化蛋白2存在相互作用，在脂多糖刺激下該作用更明顯，但能夠被Tlr4表達下調(diào)所逆轉(zhuǎn)。提示內(nèi)毒素活化Tlr4的作用與髓質(zhì)分化蛋白2明顯相關(guān)，可能通過與髓質(zhì)分化蛋白2形成復(fù)合物，活化細胞內(nèi)信號，啟動多個信號通路。但沉淀復(fù)合物中未檢測出Stim1、NF-κB蛋白表達，提示內(nèi)毒素Tlr4的活化未通過與Stim1、NF-κB之間的相互作用來實現(xiàn)，可能通過其他中間分子，仍需進一步深入研究。

Stim1可通過感受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣離子濃度變化，激活細胞膜上的鈣池調(diào)控鈣離子通道，引發(fā)細胞外鈣離子內(nèi)流[13-15]。本研究中在NF-κB抑制劑PDTC的干預(yù)下，能夠有效逆轉(zhuǎn)脂多糖上調(diào)Stim1、NF-κB表達的作用，提示Stim1表達與NF-κB明顯相關(guān)。Tlr4抑制表達載體轉(zhuǎn)染12 h可有效下調(diào)脂多糖誘導的Stim1、NF-κB表達，提示Stim1、NF-κB可能參與調(diào)控細菌內(nèi)毒素上調(diào)Stim1表達發(fā)揮的生物學作用。NF-κB抑制劑PDTC還能夠逆轉(zhuǎn)脂多糖對細胞IL-6、TNF-α表達的影響，且具有明顯的時間依賴性，提示細菌內(nèi)毒素誘發(fā)炎性介質(zhì)生成的過程中需轉(zhuǎn)錄活化因子NF-κB的參與，脂多糖可能通過作用于Tlr4、髓質(zhì)分化蛋白2信號通路來活化NF-κB，進而啟動鈣池調(diào)控鈣離子通道蛋白信號和炎性介質(zhì)信號。