苗長林，呂鵬梅，王忠銘，李惠文，楊玲梅，羅 文

模板法制備多孔交聯(lián)脂肪酶聚集體碳酸鈣及其特性

苗長林，呂鵬梅，王忠銘，李惠文※，楊玲梅，羅 文

（中國科學(xué)院廣州能源研究所，中國科學(xué)院可再生能源重點(diǎn)實驗室，廣東省新能源和可再生能源研究開發(fā)與應(yīng)用重點(diǎn)實驗室，廣州 510640）

針對傳統(tǒng)交聯(lián)脂肪酶聚集體（cross-linked lipase aggregates，CLEAs）表面密實、比表面積小、無太多孔隙結(jié)構(gòu)、在催化過程中存在擴(kuò)散限制、影響酶催化效率等問題，該文通過脂肪酶、氯化鈣、碳酸鈉、硫酸銨共沉淀制備脂肪酶/碳酸鈣微球，再加入二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）進(jìn)行脂肪酶交聯(lián)自組裝，然后用乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)去除碳酸鈣模板劑，制得多孔交聯(lián)脂肪酶聚集體微球（p-CLEAs），對其制備條件、結(jié)構(gòu)特征、酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。結(jié)果表明，最佳制備條件為：Ca2+濃度0.35 mol/L、脂肪酶與Ca2+比例5:1、沉淀劑飽和度80%、沉淀pH值為 8、沉淀時間45 min、DTT體積分?jǐn)?shù)0.2%、交聯(lián)時間40 min。與常規(guī)CLEAs相比，所制備的p-CLEAs在甲醇耐受性、熱穩(wěn)定性和pH值穩(wěn)定性方面均有明顯改善，4 ℃保藏6個月，仍保持較高的活性。其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，形貌、孔道尺寸可調(diào)控，呈多孔結(jié)構(gòu)，這種多孔結(jié)構(gòu)使得底物分子更容易進(jìn)入脂肪酶的活性位點(diǎn)，不僅降低了傳質(zhì)限制，還提高了催化效率，具有較高的催化活性。

催化劑；酶；交聯(lián)酶聚集體；脂肪酶；固定化；碳酸鈣；多孔

0 引 言

脂肪酶催化因具有反應(yīng)條件溫和、專一性強(qiáng)、效率高等優(yōu)勢而得到廣泛關(guān)注[1]，但直接使用游離的脂肪酶作催化劑，存在操作穩(wěn)定性差，對熱、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿均不穩(wěn)定，易失活、不易重復(fù)使用、分離純化操作復(fù)雜等問題[2]。而酶的固定化不僅可以提高酶的穩(wěn)定性，還有利于酶的回收和重復(fù)利用及連續(xù)自動化生產(chǎn)，這對降低生產(chǎn)成本、提高生產(chǎn)效率具有重要意義[3-4]。但常用的有載體固定化方法中，由于較強(qiáng)烈的化學(xué)反應(yīng)，通常對脂肪酶的性質(zhì)造成極大的影響[5]，另外酶又具有一定的高級空間結(jié)構(gòu)，極易受到載體表面物理性狀、化學(xué)接枝等因素的影響，對酶的空間結(jié)構(gòu)或活性中心造成不可逆的破壞，使得酶活力下降或失活，嚴(yán)重影響了固定化酶的效果和使用。交聯(lián)酶聚集體[6]（CLEAs）技術(shù)是一種利用鹽等沉淀劑沉淀酶蛋白獲得酶聚集體，然后用交聯(lián)劑對酶聚集體進(jìn)行交聯(lián)制備的無載體固定化酶方法。該固定化方法獲得的固定化酶無需載體，因而單位體積活性大、空間效率高，穩(wěn)定性好、活性高[7-8]。但CLEAs也存在一定的局限性：CLEAs沒有一定的物理形態(tài)，粒徑分布范圍寬，顆粒大小不均，形貌不規(guī)則[9]；表面密實平整，比表面積小，無太多孔隙結(jié)構(gòu)，而大多數(shù)具有催化活性的酶分子被隱蔽于CLEAs內(nèi)部，在催化過程中存在擴(kuò)散限制效應(yīng)、空間位阻和分配效應(yīng)，這些會影響酶的催化特性，進(jìn)而影響其使用效率[10-11]。鑒于CLEAs技術(shù)存在上述缺陷，一些研究者[12-14]提出新的固定化酶的思路——固載化CLEAs技術(shù)：即先將酶分子吸附在有孔載體材料里，然后進(jìn)行交聯(lián)，在孔材料內(nèi)部形成CLEAs。這種方法制備的CLEAs大小可由孔材料的孔徑來控制，而且很容易回收和再分散。如Wilson等[15]和Sangeetha 等[16]將CLEAs包埋于有機(jī)或無機(jī)凝膠中以提高CLEAs活性和穩(wěn)定性。Lee等[17]和Wang等[18]采用介孔和大孔材料固載化CLEAs，可有效地改善CLEAs的性質(zhì)，使其熱穩(wěn)定性、儲存穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性等明顯提高。但這種方法違背了CLEAs技術(shù)的“無載體”固定化方式，又回到了傳統(tǒng)“有載體”固定化方式。同時，由于大量孔材料載體的存在，會“稀釋”脂肪酶的活性，嚴(yán)重降低了單位體積內(nèi)酶的濃度（在整個固定化酶重量中，載體一般占90%以上），降低酶的結(jié)合容量和反應(yīng)能力，并且載體固定化也會引起擴(kuò)散限制效應(yīng)、空間位阻、分配效應(yīng)等傳質(zhì)問題[19]。

針對載體固定化酶制備過程中存在的單位質(zhì)量酶活低、負(fù)載量低以及CLEAs固定化酶形貌、粒徑、孔徑可控性差等問題，本研究提出通過模板法設(shè)計制備多孔無載體固定化酶微球的思路[20-21]：以碳酸鈣為模板，脂肪酶為模型酶，通過酶分子、氯化鈣和碳酸鈉共沉淀制備酶/碳酸鈣微球，再加入交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)或組裝，而后去除碳酸鈣模板，制備多孔無載體交聯(lián)脂肪酶聚集體（p-CLEAs），以改善常規(guī)載體法和CLEAs在固定化酶中存在的問題。并考察固定化條件對p-CLEAs的影響，探索酶所處微環(huán)境與催化特性間關(guān)系，以實現(xiàn)高性能多孔脂肪酶微球可控制備。

1 材料與方法

1.1 材 料

脂肪酶（RML），實驗室自制；二硫蘇糖醇（DTT），生化試劑，Sigma公司；戊二醛（25%溶液）分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；橄欖油，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氯化鈣、碳酸鈉、硫酸銨、甲醇、EDTA，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為市售，分析純。

NewClassic電子天平：上海梅特勒-托利多儀器有限公司；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；DF–101S型恒溫磁力攪拌器：上海智誠實驗設(shè)備公司；DZF–6020型真空干燥箱：上海一恒科技有限公司；TGL16G臺式高速離心機(jī)，上海醫(yī)用儀器分析廠；S-3400N 型掃描電鏡日本，Hitachi公司；FTS–40傅里葉紅外光譜儀：BIORAD 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 可控多孔交聯(lián)脂肪酶聚集體（p-CLEAs）制備

1）脂肪酶共沉淀模板化制備：將游離態(tài)脂肪酶溶于磷酸鹽緩沖液，加入氯化鈣水溶液中，混合均勻后，快速加入與氯化鈣等量等摩爾濃度碳酸鈉溶液，在4～25 ℃條件下磁力攪拌1～2 min，之后，再滴加一定量硫酸銨溶液沉淀劑，在4～25 ℃下緩慢震蕩1～2 min后靜止10～60 min，通過共沉淀讓游離態(tài)酶分子均勻分散于氯化鈣與碳酸鈉反應(yīng)生成的CaCO3微粒內(nèi)部，形成穩(wěn)定球形脂肪酶凝聚碳酸鈣顆粒沉淀，3 000 r/min離心洗滌3 min得共沉淀顆粒。

2）模板化酶蛋白共沉淀顆粒共價交聯(lián)：將上述共沉淀顆粒中溶于磷酸緩沖液中，在4～25 ℃條件下，滴加二硫蘇糖醇（DTT）溶液，緩慢震蕩1～2 min，靜止5～10 min，用以打開脂肪酶“分子內(nèi)部”的二硫鍵，然后3 000 r/min離心洗滌3 min，去除DTT，將獲得的沉淀物重新用磷酸鹽緩沖液懸浮分散，靜止10～60 min，使被打開的二硫鍵在酶分子間形成新的二硫鍵，進(jìn)而得到形成“分子間”交聯(lián)自組裝固定化酶微粒沉淀。

3）CaCO3模板劑去除：向上述分子間交聯(lián)自組裝固定化酶微粒沉淀中加入0.25 mol/L EDTA溶液，4～25 ℃下震蕩洗滌1 h，離心分離，洗滌，反復(fù)3～5次，用以徹底去除CaCO3模板劑，即獲孔多孔交聯(lián)脂肪酶聚集體微球，標(biāo)記為p-CLEAs。

1.2.2 常規(guī)交聯(lián)脂肪酶聚集體（CLEAs）的制備

按照已有文獻(xiàn)進(jìn)行制備[22-23]，具體如下：將游離態(tài)脂肪酶溶于pH值為7.5，摩爾濃度為0.5 mol/L的磷酸鹽緩沖液中，滴加飽和硫酸銨溶液沉淀劑，在4～25 ℃下緩慢震蕩1～2 min后靜置40 min，進(jìn)行脂肪酶凝聚沉淀，3 000 r/min離心洗滌3 min，將獲得的沉淀再懸浮于磷酸鹽緩沖液中，向其中緩慢滴加5%的戊二醛溶液，并輕微攪拌，交聯(lián)120 min，3 000 r/min離心5 min，棄去上清液，經(jīng)磷酸鹽緩沖液洗滌數(shù)3～5次，得到交聯(lián)脂肪酶聚集體，標(biāo)記為CLEAs，用于和上述制備的p-CLEAs進(jìn)行對照。相關(guān)制備流程如圖1。

圖1 傳統(tǒng)CLEAs及controlled-CLEAs制備流程

1.2.3 脂肪酶酶活測定及回收率計算

游離酶和固定化酶的活性均采用改進(jìn)的橄欖油乳化法進(jìn)行測定[24]。脂肪酶活力單位定義為：在37 ℃，pH值為8.0條件下，橄欖油水解每分鐘釋放出1mol脂肪酸所需的酶量定義為1個脂肪酶活力單位（U）。酶活性可由下式計算得出：

（1）

式中為脂肪酶活力，U/g；1為脂肪酸濃度，mol/mL；1為脂肪酸溶液的體積，mL；2為酶液用量，mL；為作用時間，min。

固定化酶酶活回收率，按下式計算：

式中為酶活回收率，%；2為實際固定化酶的酶活力，U/g；1為固定時使用的游離酶總活力，U/g。

1.2.4 脂肪酶沉淀率測定

采用考馬斯亮藍(lán)染色法[25]測定蛋白質(zhì)含量，再根據(jù)以下公式求得固定化脂肪酶沉淀率：

式中為脂肪酶沉淀率，%；2為固定化前脂肪酶含量，g；1為固定化后溶液中剩余游離的脂肪酶含量，g。

1.2.5 p-CLEAs紅外測定與分析

取適量試樣微球于研缽中，加入KBr并混合后壓制成透明薄片，在25 ℃下，波數(shù)為400～4 000 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行傅立葉變換紅外光譜儀檢測，儀器分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)32次，每個樣品至少檢測5次。觀察脂肪酶固定化前后固體樣品紅外圖譜，并分析其結(jié)構(gòu)變化。通過相應(yīng)軟件對圖譜進(jìn)行處理，觀察二級結(jié)構(gòu)變化。

1.2.6 p-CLEAs掃描電鏡分析

采用掃描電鏡觀察聚集體微球和游離脂肪酶的表面形貌，首先將經(jīng)過真空冷凍干燥后的2種酶均勻撒在帶有導(dǎo)電膠的掃描電鏡的樣品臺上，對2種酶進(jìn)行固定，然后在真空條件下進(jìn)行噴金，最后放入樣品室，用掃描電鏡觀察微球表面形態(tài)及粒徑的大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 模板化脂肪酶共沉淀顆粒制備條件優(yōu)化

2.1.1 模板劑對模板化脂肪酶共沉淀顆粒活性的影響

在脂肪酶溶液質(zhì)量濃度為0.06 g/mL，硫酸銨沉淀劑飽和度為80%、沉淀pH值為7、反應(yīng)溫度為20 ℃、沉淀時間為40 min的條件下，考察不同Ca2+濃度對脂肪酶酶活回收率和沉淀率的影響，結(jié)果見圖2。

注：脂肪酶溶液質(zhì)量濃度為0.06 g·mL-1，硫酸銨沉淀劑飽和度為80%、沉淀pH值為7、反應(yīng)溫度為20 ℃、沉淀時間為40 min。

由圖2可知，隨著Ca2+濃度增加，固定化酶活回收率、脂肪酶沉淀量增加，這是由于氯化鈣與碳酸鈉作用，形成CaCO3微晶，可將酶固定化在微晶網(wǎng)絡(luò)中。當(dāng)Ca2+濃度小于0.35 mol/L時，Ca2+質(zhì)量濃度過小會導(dǎo)致微晶網(wǎng)絡(luò)孔徑較大，強(qiáng)度過小，Ca2+對酶包埋不完全，導(dǎo)致更多酶流失。而當(dāng)Ca2+濃度大于0.35 mol/L時，Ca2+濃度過高時，形成的CaCO3模板劑微球強(qiáng)度越大，不利于形成均勻的孔隙結(jié)構(gòu)，影響脂肪酶與模板劑微球的結(jié)合。再有，Ca2+濃度過高，會與酶作用而使酶易變性失活，相對酶活力降低。因此，Ca2+濃度選擇在0.35 mol/L為最佳[26]。

2.1.2 脂肪酶酶液量與Ca2+比例的選擇

在Ca2+濃度為在0.35 mol/L，硫酸銨沉淀劑飽和度為80%、沉淀pH值為7、反應(yīng)溫度為20 ℃、沉淀時間為40 min的條件下，考察不同酶液量與Ca2+濃度比對脂肪酶沉淀量及酶活回收率影響，結(jié)果見圖3。

注：Ca2+濃度為在0.35 mol·L-1，硫酸銨沉淀劑飽和度為80%、沉淀pH值為7、反應(yīng)溫度為20 ℃、沉淀時間為40 min。

從圖3中可以看出，隨著酶液量的增加，脂肪酶固定化率逐步增大，在開始階段增加速度比較快，當(dāng)酶液增加到4:1后，脂肪酶沉淀率增長趨勢開始緩慢，超過以后，沉淀率基本保持不變，這說明脂肪酶沉淀量已經(jīng)達(dá)到模板劑的最大負(fù)載量。對于酶活回收率，在開始階段，回收率增加迅速，在5:1時達(dá)到最大值，之后，再增加酶液的量，酶活力回收率開始下降，這可能是因為過多的酶液造成吸附在模板劑孔道內(nèi)部的脂肪酶堆積在一起形成致密的團(tuán)塊，導(dǎo)致擴(kuò)散阻力的增大，酶活力無法表現(xiàn)出來。因此脂肪酶與Ca2+比例5:1時為最佳選擇[27]。

2.1.3 沉淀劑飽和度的確定

于50 mL酶液（Ca2+濃度為0.35 mol/L，脂肪酶與Ca2+比例5：1，pH 值7）中分別加入65%、70%、75%、80%、85%、90%飽和度硫酸銨沉淀劑10 mL，于20 ℃，沉淀40 min，考察其對酶活回收率的變化規(guī)律，結(jié)果見圖4。由圖4可知，隨著沉淀劑飽和度的增加，脂肪酶分子逐步聚集成簇，然后小簇聚集為大簇。當(dāng)飽和度超過80%時，脂肪酶沉淀率增長趨勢開始緩慢。而酶聚集體回收率則呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，當(dāng)飽和度為80%時，酶聚集體酶活力最高。這可能是因為當(dāng)硫酸銨濃度較低時，酶沉淀速度慢，致使大量游離酶的活性中心暴露于沉淀劑中而遭到破壞，酶聚集需要更長時間，即使形成聚集體，這些聚集體也發(fā)生了變性，從而失去活性。而高濃度的硫酸銨使游離酶立即沉淀完全，活性中心被包圍在聚集體中，不易受到沉淀劑的進(jìn)一步破壞，從而使酶的活性中心瞬時被鎖定在高酶活狀態(tài)，在一定程度上避免酶活的劇烈損失。但是，如果沉淀劑濃度過高，雖然游離酶能立即沉淀，但酶的活性也遭到了破壞，因此，選擇最佳沉淀劑飽和度為80%[28]。

注：Ca2+濃度為0.35 mol·L -1，脂肪酶與Ca2+比例5:1、沉淀pH值為7、反應(yīng)溫度為20 ℃、沉淀時間為40 min。

2.1.4 沉淀pH值的影響

采用不同pH值（3.0～10.0）的磷酸緩沖液配制50 mL酶液，于50 mL酶液（Ca2+濃度為0.35mol/L，脂肪酶與Ca2+比例5:1）中加入80%飽和度硫酸銨沉淀劑10 mL，于20 ℃，磁力攪拌1～2 min，沉淀40 min，考察不同pH對酶活變化規(guī)律影響，結(jié)果見圖5。

注：Ca2+濃度為0.35 mol·L -1，脂肪酶與Ca2+比例5：1、硫酸銨沉淀劑飽和度為80%、反應(yīng)溫度為20 ℃、沉淀時間為40 min。

由圖5可知，隨著pH值增大，脂肪酶固定化率和酶活力回收率都增加，但當(dāng)pH值超過8.0以后，固定化率和酶活力回收率開始下降，這可解釋為該脂肪酶的等電點(diǎn)在pH=8.0附近，在此條件下制備的CLEAs，酶活性中心瞬時被鎖定在高酶活狀態(tài)，酶活性中心不易被破壞。而pH過高，會導(dǎo)致脂肪酶變性失活。因此，pH=8.0為最佳緩沖液[29]。

2.1.5 沉淀時間的確定

在Ca2+濃度為0.35 mol/L，脂肪酶與Ca2+比例5:1，pH值為8，硫酸銨沉淀劑飽和度為80%、反應(yīng)溫度為20 ℃的條件下，對脂肪酶進(jìn)行沉淀，考察不同沉淀時間對酶活變化規(guī)律影響，結(jié)果見圖6。

注：Ca2+濃度為0.35 mol·L -1，脂肪酶與Ca2+比例5:1、硫酸銨沉淀劑飽和度為80%、反應(yīng)溫度為20 ℃、沉淀pH值為7。

在酶液中加入沉淀劑進(jìn)行沉淀是為了使酶液在沉淀劑的作用下形成聚集體，時間過短酶分子還沒有形成聚集體，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，雖然脂肪酶沉淀率不斷增大，后趨于穩(wěn)定，但反應(yīng)體系的Ca2+以及硫酸銨沉淀劑與酶作用而使酶逐漸變性失活，導(dǎo)致酶活較低，從圖6中看出，酶活回收率隨著沉淀時間的增加而逐漸增大，在沉淀40 min時，酶活回收率達(dá)到最大值，而后隨著沉淀時間的增加而降低。因此選擇沉淀時間為40 min最佳。

2.2 模板化共沉淀顆粒交聯(lián)制備條件優(yōu)化

考察不同濃度的二硫蘇糖醇（DTT）溶液（0.05%～0.4%）和交聯(lián)不同時間（10～60 min）對酶活影響。

注：交聯(lián)時間為40 min。

由圖7可知，隨著二硫蘇糖醇（DTT）濃度的增加，CLEAs的酶活先升高后降低。這是由于當(dāng)DTT的濃度較小時，酶聚集體交聯(lián)不充分不能將足夠多的酶交聯(lián)，酶活力回收率較低。而當(dāng)濃度大于時，酶活隨著DTT濃度的增大而減小，這是因為DTT的增多，酶分子之間的交聯(lián)過于緊密，使得酶的空間位阻增大，導(dǎo)致酶聚集體內(nèi)部的酶蛋白活力無法被檢測到，不利于酶活性的發(fā)揮。同時DTT也是蛋白質(zhì)變性劑，低濃度時有利于酶聚集體交聯(lián)，而高濃度會加劇酶蛋白中毒，導(dǎo)致酶失活，從而引起酶活下降。因此通過試驗得出，DTT濃度為0.2%為最佳交聯(lián)濃度[30]。

注：交聯(lián)劑濃度為0.2%。

在交聯(lián)過程中，交聯(lián)時間和交聯(lián)劑濃度一樣起著至關(guān)重要的作用，如果交聯(lián)時間過短，大部分酶還沒有被交聯(lián)上，交聯(lián)的酶比較少，酶與酶結(jié)合不牢固，而交聯(lián)時間過長，脂肪酶將長時間處于交聯(lián)劑的混合溶液中，而使脂肪酶變性失活，從而降低酶的活性，從圖8的研究結(jié)果可以看出，最佳交聯(lián)時間為40 min。

2.3 多孔交聯(lián)脂肪酶聚集體微球掃描電鏡分析

從圖9可以看出，常規(guī)方法制備的CLEAs是由一個個粒徑較小的單個聚集體組成的團(tuán)簇結(jié)構(gòu)，單個聚集體顆粒直徑約1m，單個聚集體顆粒之間再發(fā)生交聯(lián)作用，使多個單個聚集體堆積在一起，形成更大的團(tuán)簇結(jié)構(gòu)，團(tuán)簇大小會達(dá)到300m以上，且表面光滑，結(jié)構(gòu)排列緊湊，形狀不規(guī)則，空隙相對較少。這種結(jié)構(gòu)可能造成酶促反應(yīng)傳質(zhì)阻力，底物難以進(jìn)入酶活性中心進(jìn)行反應(yīng)，影響酶活力，從而導(dǎo)致催化效率下降。而經(jīng)過碳酸鈣模板法制備的p-CLEAs形成了網(wǎng)絡(luò)狀的結(jié)構(gòu)，具有粗糙的更大的比表面積和豐富的空隙孔道，經(jīng)測定p-CLEAs的粒徑大部分在2～3m范圍內(nèi)，孔洞直徑在60～100 nm之間，這些孔洞能夠讓反應(yīng)底物進(jìn)入酶內(nèi)部與酶催化位點(diǎn)接觸，從而提高p-CLEAs催化效率。

圖9 SEM分析

2.4 CLSM分析

為了進(jìn)一步表征所得的p-CLEAs脂肪酶的孔隙度，使用熒光標(biāo)記的高分子量葡聚糖和納米級熒光聚苯乙烯微球浸泡p-CLEAs脂肪酶。（葡聚糖的分子量分別為500和2 000 kDa，直徑分別為29 kDa和56 nm；納米級熒光聚苯乙烯微球直徑75～100 nm）。

由圖10可知，即使分子量小于500 kDa（29 nm）的葡聚糖也不能自由擴(kuò)散到CLEAs脂肪酶顆粒中，而分子量為2 000 kDa（56 nm）的葡聚糖可以自由擴(kuò)散到p-CLEAs脂肪酶顆粒中。此外，納米級熒光聚苯乙烯珠的透性研究表明，75 nm級聚苯乙烯微球可以穿透p-CLEAs內(nèi)部，而100 nm級聚苯乙烯珠不能進(jìn)入p-CLEAs內(nèi)部，而是粘在p-CLEAs表面。以上研究表明，p-CLEAs脂肪酶顆粒為介孔，孔徑小于100 nm。這再次印證了上述SEM分析，p-CLEAs脂肪酶為多孔結(jié)構(gòu)，p-CLEAs脂肪酶的多孔結(jié)構(gòu)有利于反應(yīng)物的擴(kuò)散，提高反應(yīng)效率。

圖10 樣品形貌分析

2.5 多孔交聯(lián)脂肪酶聚集體微球紅外分析

由圖11紅外譜圖可知，吸附峰在3 406或3 477 cm-1處為羥基吸收峰，吸附峰在2 918 cm-1處為脂肪酶分子中出現(xiàn)的CH2鍵伸縮振動帶，吸附峰在1 311 cm-1處為CH2彎曲和搖擺吸收峰。由圖11b可知，在1 456 cm-1處為戊二醛交聯(lián)形成的C=N振動吸收峰，這是因為，在脂肪酶交聯(lián)制備過程中，戊二醛有2個醛基，它可以與脂肪酶的末端胺基反應(yīng)，形成席夫堿鍵。通過以上吸收峰可判斷，已成功地制備了CLEAs脂肪酶。而由圖10c可知，572 cm-1處為二硫鍵S-S吸附帶，這表明p-CLEAs脂肪酶已成功交聯(lián)制備[8]。

利用軟件Peakfit 4.2對游離脂肪酶及p-CLEAs所得紅外光譜譜圖進(jìn)行分析，根據(jù)二階導(dǎo)數(shù)結(jié)果選取紅外光譜中各峰的峰位和峰寬，對紅外光譜中的酰胺Ⅰ帶（1 700～1 600 cm-1）進(jìn)行基線校正，Gaussian去卷積，然后進(jìn)行曲線擬合，通過各子峰的位置及峰面積計算出各種二級結(jié)構(gòu)的相對百分含量。

注：a為游離脂肪酶；b為CLEAs；c為p-CLEAs，下同。

從表1可以看出，經(jīng)過交聯(lián)酶聚集固定化后，-螺旋、-折疊、無規(guī)則卷曲分別減少?1.23%、?0.83%、?1.61%，整體變化不大，但-轉(zhuǎn)角卻增加了7.22%，發(fā)生較大變化。這表明，經(jīng)過交聯(lián)之后p-CLEAs的剛性有所增強(qiáng)，脂肪酶分子中殘基柔性基本保持不變，這使得結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，耐受性增強(qiáng)。

表1 p-CLEAs 二級結(jié)構(gòu)變化 Table 1 Secondary structures changes of p-CLEAs

注：差值*= p-CLEAs –游離脂肪酶。

2.6 交聯(lián)酶凝聚體的性能考察

2.6.1 不同固定化酶活對比

在上述最優(yōu)條件下制備CLEAs和p-CLEAs，采用橄欖油乳化法進(jìn)行酶活測定，對比分析游離脂肪酶、CLEAs和p-CLEAs的酶活，將游離脂肪酶初始酶活力定為100%，結(jié)果見圖12。

從圖12可以看出，固定化脂肪酶較游離脂肪酶活力有所降低的，這主要是因為在固定化過程中有所損失造成的。而p-CLEAs酶活比CLEAs的活性高，這是由于CLEAs沒有一定的物理形態(tài)，顆粒會凝聚成致密的團(tuán)塊，大多數(shù)具有催化活性的酶分子被隱蔽于團(tuán)塊內(nèi)部，進(jìn)而影響其活性。而由于碳酸鈣模板劑制備的p-CLEAs，內(nèi)部具有規(guī)則蜂窩狀通孔結(jié)構(gòu)，孔徑都在幾微米以下，尺寸形貌均一、可控。因而，其具有很大的內(nèi)表面積，可提高脂肪酶與底物接觸的界面面積，且底物可很容易接近內(nèi)p-CLEAs脂肪酶的活性位點(diǎn)，減小了內(nèi)部擴(kuò)散阻力，提高了催化效率。

圖12 不同固定化方式對酶活影響

2.6.2 最適溫度

取1 g上述最優(yōu)條件下制備的CLEAs和p-CLEAs，孵化于磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH=7.0）中，30～70 ℃恒溫水浴中孵育脂肪酶樣品30 min，每隔5 ℃測定固定化酶和游離酶的相對酶活力，以各自的初始酶活力定為100%。

從圖13a中可以看出，隨著溫度的不斷升高，游離酶、CLEAs和p-CLEAs酶活性都不斷升高，最適溫度都為45 ℃，但與游離脂肪酶相比，CLEAs和p-CLEAs最適溫度范圍比游離酶寬，在65 ℃孵育后，CLEAs和p-CLEAs脂肪酶的相對活性分別保留了63%和86%，而游離脂肪酶僅保留了33.67%的相對活性。這應(yīng)該是脂肪酶的交聯(lián)作用，改變了酶的空間構(gòu)象，從游離狀態(tài)變成了一種更加穩(wěn)定的聚集狀態(tài)。此外，進(jìn)一步比較了CLEAs和p-CLEAs在70 ℃條件下的孵育結(jié)果，p-CLEAs的初始相對活性約為81%，而常規(guī)CLEAs的殘留活性約為54%，明顯低于p-CLEAs活性。究其原因，p-CLEAs熱穩(wěn)定性的提高可能是由于脂肪酶分子內(nèi)分子間二硫鍵在脂肪酶分子內(nèi)誘導(dǎo)形成分子間二硫鍵，酶分子二級結(jié)構(gòu)剛性增強(qiáng)，導(dǎo)致脂肪酶分子間的共價交聯(lián)更加穩(wěn)定，這表明，在極端條件下，p-CLEAs高穩(wěn)定性便于大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用。

2.6.3 最適pH值

在0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液中，45 ℃孵育5 h，在pH值5.5～9范圍考察游離脂肪酶、CLEAs和p-CLEAs酶的相對酶活力，結(jié)果如圖13b所示。

從圖13b中可以看出，游離酶、CLEAs和p-CLEAs酶活性都隨著pH值增大而增加，在pH值為7時游離酶、CLEAs的酶活性達(dá)到最大，在pH值為7～9之間，酶活性都表現(xiàn)出下降趨勢，但CLEAs仍保持在90%以上，而游離脂肪酶,相對酶活在72%～89%之間，游離酶酶活性比CLEAs的酶活性下降迅速，這表明，經(jīng)交聯(lián)固定化后其最適pH值沒有發(fā)生變，但最適pH值范圍變寬，這和最適溫度范圍變寬的原因一樣，都是因為交聯(lián)固定化后處于一種更穩(wěn)定的狀態(tài)，對pH值的變化變得不敏感。p-CLEAs的pH值適用范圍的增寬，使得酶在實際生產(chǎn)中將具有更廣泛的應(yīng)用范圍。另外，與p-CLEAs相比，CLEAs最適pH值有所偏移變?yōu)?，這種變化可能是由于脂肪酶表面氨基酸基團(tuán)與戊二醛交聯(lián)，使得脂肪酶表面帶有負(fù)電荷，最終使最適pH值發(fā)生了較大的變化。

注：各單因素試驗固定因素值為：磷酸鹽緩沖液0.1 mol·L-1，pH 值7.0，45℃，30 min。

2.6.4 貯存穩(wěn)定性

將游離脂肪酶、CLEAs和p-CLEAs脂肪酶樣品在4 ℃磷酸鹽緩沖液（pH值為7）中孵育至180 d，每隔10天測定其酶活，評價其貯存穩(wěn)定性。以各自的初始酶活力定為100%，結(jié)果如圖13c所示。

由圖13c可知，常規(guī)CLEAs和p-CLEAs脂肪酶的活性在0～60 d的貯藏期間沒有明顯的下降。但在相同的貯藏條件下，60 d后，游離脂肪酶活性顯著下降，酶活性下降90%以上。因此，與游離脂肪酶相比，常規(guī)固定化CLEAs和p-CLEAs脂肪酶具有更好的貯藏穩(wěn)定性。究其原因，CLEAs和p-CLEAs脂肪酶儲存穩(wěn)定性的提高可能是由于交聯(lián)共價鍵的形成，導(dǎo)致酶更加穩(wěn)定，限制了脂肪酶的運(yùn)動。此外，進(jìn)一步比較了傳統(tǒng)CLEAs和p-CLEAs脂肪酶。在經(jīng)過4 ℃，180 d貯藏后孵育，常規(guī)CLEAs殘留活性約為10%，而p-CLEAs相對活性約為71%，明顯高于常規(guī)CLEAs殘留活性。另外，貯藏60 d后，p-CLEAs活性隨貯藏時間略有增加，其p-CLEAs活性在貯藏80～100 d時最高。這種活性的增加可能是因為酶蛋白質(zhì)分子間形成穩(wěn)定的二硫鍵，使其不易生物降解。

2.6.5 甲醇對酶活性的影響

在酯化、酯交換中脂肪酶常受到有機(jī)溶劑的毒害作用，本文采用濃度為10%的甲醇磷酸緩沖液處理交聯(lián)酶聚集體，研究交聯(lián)酶聚集體對甲醇耐受性。從圖13b可知，CLEAs和p-CLEAs對甲醇有較強(qiáng)的耐受性，經(jīng)甲醇處理150 h后，CLEAs和p-CLEAs相對酶活力分別為83%和76%，而游離脂肪酶甲醇處理50 h后，活力僅剩余34%。這可能是由于經(jīng)交聯(lián)后形成超分子結(jié)構(gòu)，減弱了甲醇對酶活性中心的影響，使得交聯(lián)酶聚集體的酶活力相對較高。而游離的脂肪酶酶蛋白是完全暴露在環(huán)境中，直接與甲醇接觸，酶的活性中心遭到破壞，因而酶活力損失較大。另外，于CLEAs相比，p-CLEAs的甲醇的耐受性也是有一定的降低，這可能是因為p-CLEAs具有豐富的孔道，甲酯與p-CLEAs作用面積更大，導(dǎo)致酶活力損失更快，但整體降低幅度較小。因此，p-CLEAs對甲醇耐受性拓展了脂肪酶在酯化、酯交換中的應(yīng)用。

2.6.6 p-CLEAs交聯(lián)酶的重復(fù)使用性能

固定化酶的主要優(yōu)點(diǎn)是昂貴的酶可以重復(fù)利用。因此，有必要對p-CLEAs脂肪酶催化劑可重復(fù)使用性進(jìn)行評價。本研究采用菜籽油和甲醇轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)來評價p-CLEAs脂肪酶的催化活性。反應(yīng)條件：菜籽油（10 g），油與甲醇摩爾比1:6，脂肪酶催化劑用量20%，含水率3%，溫度45 ℃，反應(yīng)時間24 h。每批反應(yīng)后，離心回收固定化脂肪酶，然后加入一批新的菜籽油和甲醇到反應(yīng)器中，進(jìn)行下一批次反應(yīng)，分析了各批次反應(yīng)后油脂轉(zhuǎn)化率。p-CLEAs脂肪酶重復(fù)利用變化如圖14所示。

圖14 常規(guī)CLEAs和p-CLEAs脂肪酶的重復(fù)利用

從圖14可以看出，CLEAs和p-CLEAs脂肪酶在重復(fù)8次利用后，其催化反應(yīng)活性均有所下降，但程度不同。p-CLEAs脂肪酶重復(fù)使用8次，F(xiàn)AME轉(zhuǎn)化率仍保持在70%以上。與常規(guī)CLEAs相比，具有更好的重復(fù)利用性和穩(wěn)定性。p-CLEAs脂肪酶活性的喪失可以從以下3方面來解釋：1）在反應(yīng)過程中，脂肪酶構(gòu)象發(fā)生變化。為了驗證這一現(xiàn)象，本研究對重復(fù)使用8次的p-CLEAs脂肪酶進(jìn)行SEM分析。從圖15可以看出，重復(fù)8次使用后的p-CLEAs脂肪酶，有部分p-CLEAs脂肪酶顆粒發(fā)生了破碎，且有一些孔隙結(jié)構(gòu)發(fā)生塌陷，不再保持原來的多孔形態(tài)。p-CLEAs脂肪酶顆粒的破碎和塌縮使底物無法進(jìn)入p-CLEAs脂肪酶的內(nèi)部，降低了脂肪酶的催化反應(yīng)性能。因此，在今后的工作中，有必要對提高p-CLEAs脂肪酶顆粒的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性進(jìn)行更深入的研究。2）甲醇對p-CLEAs脂肪酶的毒害作用使其活性降低。3）反應(yīng)產(chǎn)物吸附在p-CLEAs脂肪酶表面，從而限制底物與脂肪酶分子活性位點(diǎn)的接觸。

圖15 SEM分析

3 結(jié) 論

本研究以CaCO3為模板共沉淀制得脂肪酶微球，然后通過DTT誘導(dǎo)脂肪酶分子“內(nèi)部”二硫鍵交聯(lián)成“分子間”二硫鍵，在用EDTA去除CaCO3模板，得到的多孔p-CLEAs，形態(tài)學(xué)表征結(jié)果表明，與常規(guī)CLEAs相比，具有形狀規(guī)則、顆粒小、孔徑大、空間位阻小、比表面積大的特點(diǎn)；其溫度耐受性、穩(wěn)定性、甲醇溶劑耐受性、貯存穩(wěn)定性均有明顯改善，因此，p-CLEAs脂肪酶在生物催化中具有更好的實用前景，其催化油脂轉(zhuǎn)化，重復(fù)使用8次，轉(zhuǎn)化率保持在70%左右。然而，p-CLEAs脂肪酶顆粒在重復(fù)利用過程中，顆粒容易破碎和坍塌，影響了實際應(yīng)用效果。因此，在今后的工作中，有必要進(jìn)一步研究p-CLEAs脂肪酶顆粒損耗的原因和改進(jìn)措施。

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Preparation and properties of porous crosslinked lipase polymeric by calcium carbonate template method

Miao Changlin, Lü Pengmei, Wang Zhongming, Li Huiwen※, Yang Lingmei, Luo Wen

(510640,)

In view of the problems such as compact surface, small specific surface area and lack of much pore structure of traditional cross-linked lipase aggregates (CLEAs), which further affects the catalytic efficiency of the enzyme in the catalytic process. To solve above problems, this study prepared porous-cross linked enzyme aggregates (p-CLEAs) were synthesized by in-situ co-precipitation method using CaCO3microparticles as templates. The preparation procedure involves crude lipase was immobilized as CLEAs via precipitation with ammonium sulfate and entrapping this lipase molecules into CaCO3templates, followed by DTT (dithiothreitol) induced assemble of lipase molecules to from lipase microparticles (Lipase molecules were assembled into a microparticle by the internal using disulfide bonds within lipase molecules as molecular linkers and stimulated by dithiothreitol) and finally the removal of CaCO3templates by EDTA to form pores in the CLEAs. The preparation conditions, structural characteristics and enzymatic properties were studied. The results showed that the best preparation conditions were: mass concentration of concentration of Ca2+0.35 mol/L, the ratio of lipase to Ca2+is 5:1, saturation of precipitator is 80%, precipitation pH value is 8, precipitation time is 40 min, DTT volume fraction is 0.2%, and crosslinking time is 40 min, Compared with conventional CLEAs, the prepared p-CLEAs presented a porous structure and showed significant improvement in methanol tolerance, thermal stability and pH value stability. It was preserved at 4 ℃ for 6 months and still maintained a high activity. This porous structure makes it easier for substrate molecules to enter the active site of lipase, which not only reduces the mass transfer limitation, but also improves the catalytic efficiency. Therefore, p-CLEAs lipase has a high catalytic activity.

catalyst; enzyme; cross linked enzyme aggregates; lipase; immobilization; CaCO3; porous

苗長林，呂鵬梅，王忠銘，李惠文，楊玲梅，羅 文. 模板法制備多孔交聯(lián)脂肪酶聚集體碳酸鈣及其特性[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2020，36(3)：218－226.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2020.03.027 http://www.tcsae.org

Miao Changlin, Lü Pengmei, Wang Zhongming, Li Huiwen, Yang Lingmei, Luo Wen. Preparation and properties of porous crosslinked lipase polymeric by calcium carbonate template method[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2020, 36(3): 218－226. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2020.03.027 http://www.tcsae.org

2019-09-25

2019-10-14

國家重點(diǎn)研發(fā)計劃（2017YFD0601003）；國家自然科學(xué)基金項目（21506217）

苗長林，副研究員，主要從事生物質(zhì)生化轉(zhuǎn)化研究。Email：miaocl@ms.giec.ac.cn

李惠文，高級工程師，主要從事生物質(zhì)能源利用研究。Email：huiwl@ms.giec.ac.cn

10.11975/j.issn.1002-6819.2020.03.027

TE667

A

1002-6819(2020)-03-0218-09