張佰清，葛新宇，馬鳳鳴，馬藝超，張士豪，謝加豪

脈沖強(qiáng)光誘變對(duì)黑曲霉產(chǎn)果膠酶活力的影響

張佰清，葛新宇，馬鳳鳴，馬藝超，張士豪，謝加豪

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，沈陽 110866）

脈沖強(qiáng)光技術(shù)可應(yīng)用于微生物誘變育種以及獲得高產(chǎn)菌株。該文采用響應(yīng)面法確定脈沖強(qiáng)光誘變黑曲霉高產(chǎn)果膠酶的最佳條件，同時(shí)探究突變菌株高產(chǎn)果膠酶的酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明：脈沖強(qiáng)光誘變條件為脈沖電壓2 075 V，脈沖次數(shù)36次，脈沖距離5.4 cm。以此工藝參數(shù)進(jìn)行誘變，得到了高產(chǎn)果膠酶的突變菌株L9，與原始菌株相比，其果膠酶活力提高了82.22%±0.18%。突變菌株L9遺傳性能良好，所產(chǎn)果膠酶具有更高的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。因此，脈沖強(qiáng)光可用于黑曲霉誘變，得到穩(wěn)定性良好的高產(chǎn)果膠酶的突變菌株。

酶；農(nóng)產(chǎn)品；電場(chǎng)；脈沖強(qiáng)光；誘變；黑曲霉；果膠酶；響應(yīng)面法

0 引 言

果膠酶[1]是一種能將果膠裂解，使其變成多聚半乳糖醛酸的復(fù)合酶，主要用于提高果蔬汁出汁率和果酒澄清處理[2]，增加產(chǎn)品風(fēng)味。目前，食品加工用黑曲霉生產(chǎn)果膠酶，雖然其果膠酶組分較為齊全，但產(chǎn)量較低[3]。人工誘變篩選的黑曲霉能夠提高果膠酶產(chǎn)量，因此，探索新型物理方法，將其應(yīng)用于黑曲霉誘變育種，以獲得具有穩(wěn)定遺傳性狀的高產(chǎn)菌株是食品工業(yè)的重要研究熱點(diǎn)[4]。

脈沖強(qiáng)光是一種利用瞬間放電以脈沖光形式誘變微生物的新型冷處理技術(shù)[5]。目前，脈沖強(qiáng)光逐漸應(yīng)用于優(yōu)良菌株的誘變選育，具有處理時(shí)間短、耗能低[6]、效率高、污染小[7]等優(yōu)點(diǎn)。孟憲軍等[8]利用脈沖強(qiáng)光誘變納塔爾鏈霉菌得到高產(chǎn)納他霉素突變菌株，較原始菌株提高1.6倍。孫欄夢(mèng)等[9]以啤酒酵母為出發(fā)株，通過脈沖強(qiáng)光抗性篩選得到產(chǎn)雙乙酰含量高、凝聚性強(qiáng)、發(fā)酵速率快的優(yōu)良突變株。張佰清等[10-11]通過脈沖強(qiáng)光誘變?nèi)樗崛榍蚓捅＜永麃喨闂U菌，分別得到Nisin高產(chǎn)突變株和高產(chǎn)多糖菌株，提高了菌株發(fā)酵性能。Orcajo等[12-13]研究表明脈沖強(qiáng)光通過改變菌體細(xì)胞的核酸結(jié)構(gòu)來引起細(xì)胞變異，但DNA修復(fù)機(jī)制不發(fā)生作用，從而誘導(dǎo)微生物突變[14]。

本試驗(yàn)以產(chǎn)果膠酶的黑曲霉為研究對(duì)象，進(jìn)行脈沖強(qiáng)光誘變，通過響應(yīng)面優(yōu)化法確定最優(yōu)誘變條件，初步探究誘變菌株果膠酶的酶學(xué)性質(zhì)，考察脈沖強(qiáng)光作為一種新型誘變技術(shù)，應(yīng)用于黑曲霉誘變的可行性。為脈沖強(qiáng)光作為一種新的誘變技術(shù)應(yīng)用于優(yōu)良菌株誘變提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

黑曲霉（CICC40493），沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院提供。

1.1.2 主要設(shè)備

脈沖強(qiáng)光裝置波長范圍在200～1 100 nm，其中紫外光部分占15%～20%，脈沖寬度20s，最大輸入能量644 J，沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院自制；高壓蒸汽滅菌鍋上海三申器械有限公司；PHS-3C型酸度計(jì)；DK-S22恒溫水浴鍋，常州國華科技有限公司；超凈工作臺(tái)，上海博訊有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；離心機(jī)，Sigma 公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基[15]

初篩培養(yǎng)基：果膠5 g/L、NaNO33 g/L、NaCl 1 g/L、MgSO41 g/L、K2HPO4·3H2O 1 g/L、KH2PO40.5 g/L、溴酚藍(lán)0.1 g/L、瓊脂粉20 g/L、pH值5.5

發(fā)酵培養(yǎng)基：桔皮粉20 g/L、蛋白胨5 g/L、NaCl 1 g/L、MgSO41 g/L、K2HPO4·3H2O 1 g/L、KH2PO40.5 g/L。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 脈沖強(qiáng)光誘變條件的確定

斜面活化好菌株后，將制備的孢子懸液轉(zhuǎn)移到直徑為9 cm的滅菌培養(yǎng)皿中，放入脈沖強(qiáng)光處理室氙燈正下方，進(jìn)行脈沖強(qiáng)光照射處理?？疾熳罴衙}沖電壓、脈沖次數(shù)、脈沖距離和菌液量[16]對(duì)菌株致死率和突變菌株胞外果膠酶活力的影響。文獻(xiàn)報(bào)道，致死率在70%～80%時(shí)，菌株突變性可以保持在較穩(wěn)定的水平[17]。前期單因素試驗(yàn)結(jié)果得到脈沖電壓2 000 V、脈沖次數(shù)30次、脈沖距離5 cm為最佳處理?xiàng)l件，菌液量對(duì)脈沖處理結(jié)果無顯著影響。進(jìn)而通過最陡爬坡試驗(yàn)以快速逼近最佳產(chǎn)酶區(qū)域。

式中為對(duì)照組平皿上的菌落數(shù)；為誘變處理后平皿上的菌落數(shù)。

1.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以最陡爬坡試驗(yàn)的最高響應(yīng)值點(diǎn)為中心點(diǎn)進(jìn)行中心組合設(shè)計(jì)，運(yùn)用Design-Expert軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合[18-19]，試驗(yàn)因素與水平如表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)自變量因素與水平

1.2.3 高產(chǎn)果膠酶突變菌株的篩選

1）初篩

將適當(dāng)濃度孢子懸液[20]進(jìn)行照射處理，取100L孢子懸液涂布于篩選培養(yǎng)基上。30 ℃錫箔紙避光培養(yǎng)3 d，用未處理的孢子液涂布篩選培養(yǎng)基進(jìn)行對(duì)照[21]，每組做3個(gè)平行。觀察透明圈與菌落直徑的（/）比值，選擇（/）值較大的菌株進(jìn)行復(fù)篩[22]。

2）復(fù)篩

將初篩菌株進(jìn)行液體發(fā)酵，對(duì)粗酶液進(jìn)行果膠酶活力測(cè)定[23]，選取果膠酶活力高的菌株。

1.2.4 酶活的測(cè)定

采用3,5-二硝基水楊酸比色（DNS法）測(cè)定[24]。底物為0.4%果膠溶液。酶活力單位（U）：在pH值為4.0，45 ℃條件下，每分鐘催化果膠水解生成1mol半乳糖醛酸所需酶量為1個(gè)酶活力單位。

1.2.5 突變菌株遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將突變菌株連續(xù)傳代6代，同時(shí)進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)[25]，測(cè)定每一代菌株產(chǎn)酶活性，比較其產(chǎn)酶活性變化。

1.2.6 果膠酶酶學(xué)性質(zhì)研究

試驗(yàn)將菌株發(fā)酵液經(jīng)離心取上清液為粗酶液，加入(NH4)2SO4飽和度為60%，經(jīng)冷凍離心取沉淀，溶于緩沖液，4 ℃透析12 h。通過Cellulose DE-52陰離子交換柱層析，收集酶活部分。再經(jīng)SepHadex G-100凝膠過濾柱層析，二次純化，收集酶活部分。采用SDS-PAGE電泳進(jìn)行純化結(jié)果的驗(yàn)證。

1）果膠酶最適作用pH值

用醋酸-醋酸鈉緩沖溶液配制pH值分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0和6.5的底物，測(cè)定果膠酶在不同pH環(huán)境中的酶活。

2）果膠酶最適作用溫度

將最適pH環(huán)境下的果膠酶活測(cè)定體系分別置于30、35、40、45、50、55、60、65 ℃的不同溫度環(huán)境中，測(cè)定果膠酶在不同溫度環(huán)境中的酶活。

3）果膠酶的pH穩(wěn)定性

將粗酶液用不同pH值的緩沖液（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5）處理1 h后與底物反應(yīng)，在最適條件下測(cè)定其酶活，以未經(jīng)處理的酶液活性為100%，計(jì)算相對(duì)酶活，分析果膠酶pH穩(wěn)定性。

4）果膠酶的熱穩(wěn)定性

將粗酶液置于不同溫度（40、50、60、70 ℃）恒溫水浴鍋中水浴保溫，每隔20 min取少量酶液迅速在冷水浴中降溫冷卻，測(cè)定酶活，以未處理的果膠酶活力以100%計(jì)。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均平行測(cè)定3次，測(cè)定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示，使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析[26]。

2 結(jié)果與分析

2.1 脈沖強(qiáng)光對(duì)黑曲霉誘變效果研究

脈沖強(qiáng)光誘變黑曲霉是一個(gè)多因素作用的復(fù)雜過程，以透明圈與菌落直徑的比值（/）為指標(biāo)，通過統(tǒng)計(jì)分析得出脈沖強(qiáng)光誘變黑曲霉的最佳優(yōu)化條件。前期試驗(yàn)結(jié)果表明，菌液量對(duì)（/）值無顯著性影響，因此將脈沖電壓、脈沖次數(shù)和脈沖距離作為試驗(yàn)因素，通過最陡爬坡試驗(yàn)以快速逼近最佳產(chǎn)酶區(qū)域，最后以最陡爬坡試驗(yàn)的最高點(diǎn)為中心點(diǎn)進(jìn)行中心組合設(shè)計(jì)。運(yùn)用Design-Expert軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得出最優(yōu)誘變條件[27-28]。

1）最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

最陡爬坡試驗(yàn)是考察某一因素的變化來確定其在試驗(yàn)中的具體影響，為響應(yīng)面試驗(yàn)提供一個(gè)合理數(shù)據(jù)范圍。試驗(yàn)的設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。

表2 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

注：/為透明圈與菌落直徑的比值，下同。

Note:is the ratio of transparent circle to colony diameter, the same below.

由表2可知，0+1Δ號(hào)試驗(yàn)組的比值響應(yīng)值達(dá)到最大1.57，之后開始下降。因此，選取此拐點(diǎn)試驗(yàn)條件作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)中心點(diǎn)。

2）響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

利用Design-Expert10軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)，進(jìn)行3因素3水平的Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)。試驗(yàn)的設(shè)計(jì)及結(jié)果與方差分析分別如表3、表4所示。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表4 試驗(yàn)結(jié)果方差分析

注：**表示對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有極顯著影響（＜0.01）；*表示對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著性影響（＜0.05）。

Note: ** means significant influence on the test results (< 0.01);* means significant impact on test results (< 0.05).

由表3、4可知，菌株的水解圈與菌落直徑比值（）對(duì)脈沖電壓（）、脈沖次數(shù)（）和脈沖距離（）的多元二次回歸方程為：

該模型回歸項(xiàng)極顯著（<0.01），失擬項(xiàng)不顯著（>0.05），決定系數(shù)為0.978 9，校正后決定系數(shù)0.940 9，說明該模型成立，可有效反映出菌株水解圈/菌落直徑比值與脈沖電壓、脈沖次數(shù)和脈沖距離之間的關(guān)系，能夠較真實(shí)地反映試驗(yàn)結(jié)果，具有實(shí)際應(yīng)用意義。由以上可知，、、、2、2、2為顯著影響因素，各因素兩兩交互作不顯著。如圖1所示。

利用Design-Expert10軟件計(jì)算，確定誘變條件為：脈沖電壓2 074.3V、脈沖次數(shù)36.338次、脈沖距離5.41cm，最大比值為1.612。結(jié)合實(shí)際操作，即脈沖電壓2 075V、脈沖次數(shù)36次、脈沖距離5.4 cm。在此最優(yōu)條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，比值為1.58，比預(yù)測(cè)值略低，且致死率達(dá)到76.67%，說明用該回歸方程分析得到的最優(yōu)誘變條件具有可信度。

2.2 脈沖強(qiáng)光誘變選育

在脈沖強(qiáng)光的最佳誘變條件下進(jìn)行高產(chǎn)果膠酶突變菌株的選育，初篩選結(jié)果如圖1所示。

注：Y為原始菌株。

由圖1可知，以值為初篩指標(biāo)，挑選60個(gè)單菌落，從中選取10株酶活力較原始菌株（）顯著提高（<0.05）的突變菌株進(jìn)行復(fù)篩，即突變菌株L4、L6、L8、L9、L18、L28、L37、L38、L45、L46。

脈沖強(qiáng)光突變菌株的復(fù)篩結(jié)果如表5所示。

表5 突變菌株的復(fù)篩結(jié)果

注：試驗(yàn)數(shù)據(jù)均平行測(cè)定3次，測(cè)定結(jié)果以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示，下同。

Note: All experimental data were measured three times in parallel, and the results were expressed as mean ± standard deviation (SD), the same below.

表5可知，相較于原始菌株，突變菌株產(chǎn)酶能力均有顯著提升。其中，突變菌株L9產(chǎn)酶能力最強(qiáng)，其酶活力高達(dá)（188.21±1.22）U/mL，比原始菌株（103.29± 0.31） U/mL提高了82.22%±0.18%。因此選取突變菌株L9進(jìn)行后續(xù)研究。

2.3 遺傳穩(wěn)定性研究

突變菌株L9遺傳穩(wěn)定性研究如表6所示。

表6 突變菌株遺傳穩(wěn)定性研究

由表6可知，傳代1～6次，突變菌株L9的產(chǎn)酶活性變化并不顯著，由此證明突變菌株L9的產(chǎn)果膠酶能力較穩(wěn)定，并具有較好的遺傳穩(wěn)定性，進(jìn)一步說明脈沖強(qiáng)光可應(yīng)用于產(chǎn)果膠酶能力強(qiáng)且能夠穩(wěn)定遺傳的突變菌株的誘變選育。

2.4 果膠酶性質(zhì)

誘變前后菌株所產(chǎn)果膠酶采用SDS-PAGE電泳進(jìn)行純化，有一條清晰條帶在29.0～44.3 kDa之間，并初步估計(jì)酶的分子量為35 kDa。誘變前后菌株所產(chǎn)果膠酶的最適pH、最適溫度如圖2a、2b所示。pH 值5.0、45 ℃時(shí)，L9與原始菌株果膠酶活力均達(dá)到最高，L9的果膠酶活分別為191.16、192.67 U/mL，與原始菌株相比分別提高了80.84%、71.68%。

突變菌株L9果膠酶的pH穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性結(jié)果如圖2c、2d、2e所示。在pH值在4～6時(shí)，原始菌株果膠酶出現(xiàn)不同程度的損失，L9果膠酶相對(duì)酶活均超過80%，明顯高于原始菌株。原始菌株果膠酶在40～50 ℃條件下處理活力呈現(xiàn)不同程度的損失，在60～70 ℃條件下僅保存80 min酶液基本失活。而突變菌株L9果膠酶在40～50 ℃條件下保存40 min后，酶活基本沒有損失；在60～70 ℃條件下保存100 min。酶液基本失活。因此，誘變菌株果膠酶的pH穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性有較明顯的提升，這可能是由于突變株所產(chǎn)酶亞基間的聚合度增強(qiáng)[29]。脈沖強(qiáng)光誘變黑曲霉菌株得到果膠酶高產(chǎn)菌株，與已有研究脈沖強(qiáng)光誘變?cè)黾泳臧l(fā)酵產(chǎn)酶性能結(jié)果一致[30]，說明了脈沖強(qiáng)光應(yīng)用黑曲霉誘變的可行性。Effect

注：圖a、c中溫度為45 ℃，圖b、d、e中pH值為5.0。

3 結(jié) 論

本文對(duì)產(chǎn)果膠酶的黑曲霉菌株進(jìn)行脈沖強(qiáng)光誘變處理，通過響應(yīng)面試驗(yàn)確定的最優(yōu)誘變條件為脈沖電壓2 075 V、脈沖次數(shù)36次、脈沖距離5.4 cm。在此誘變條件下，得到高產(chǎn)果膠酶突變菌株L9，其酶活力為（188.21±1.22）U/mL，比優(yōu)化前提高82.22%±0.18%。經(jīng)傳代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明，突變菌株產(chǎn)果膠酶能力穩(wěn)定，該酶最適pH值為5.0，最適溫度45 ℃。突變菌株L9所產(chǎn)果膠酶比原始菌株具有更高的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。綜上，脈沖強(qiáng)光可以應(yīng)用于菌株誘變，在工業(yè)酶制劑中應(yīng)用前景廣闊?？蛇M(jìn)一步探究脈沖強(qiáng)光技術(shù)誘變機(jī)理，開發(fā)脈沖技術(shù)在誘變領(lǐng)域的潛力。

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Effect of Aspergillus Niger induced by intense pulsed light on pectinase-producing activity

Zhang Baiqing, Ge Xinyu, Ma Fengming, Ma Yichao, Zhang Shihao, Xie Jiahao

(,,110866,)

Intense pulse light (IPL) technology is a new non-toxic and environmentally friendly cold treatment technology, which can be applied to mutation breeding of microorganisms and to obtain high-producing strains. Aspergillus Niger is the main strain producing pectinase in food industry at present, but its pectinase yield is low. In order to verify the feasibility of applying intense pulse light technology to mutagenize Aspergillus Niger strains for high yield of pectinase, this experiment used intense pulse light technology to mutagenize Aspergillus Niger. With pulse voltage, pulse number and pulse distance as independent variables and ratio of transparent circle to colony diameter as dependent variables, steepest slope moving tests, response surface tests and result analysis are carried out to determine the optimum conditions for high-yield pectinase induced by the intense pulse light. At the same time, secondary screening of mutant strains was carried out and the genetic stability of the mutant strain was determined and the enzymatic properties of the mutant strain with high pectinase production were explored. The results showed that the multiple quadratic regression equation of transparent circle and colony diameter ratio () against impulse voltage (), pulse number () and pulse distance () is as follows:=1.59+0.068+0.048?0.033? 0.011?0.019?0.022?0.0712?0.0872?0.132.All the factors in the response surface design test were significant, and the interaction between two factors was not significant. The optimum mutagenesis conditions were when the pulse voltage was 2 075 V, the pulse number 36 times and the pulse distance 5.4 cm. Under the optimum conditions, the ratio of transparent circle to colony diameter could reach 1.58, which was in good agreement with the predicted value of response surface fitting equation, indicating that the model was credible. Induce mutation to the Aspergillus Niger under such optimized condition, screen mutant strains using transparent circle for 60 mutant strains with bigger ratio of transparent circle to colony diameter. The mutant strain L9 with high pectinase production was finally selected by re-screening the above-mentioned 60 strains by determining pectinase activity, which was as high as (188.21+1.22) U/mL, which was 82.2% higher than that of the original strains. The results of genetic stability analysis showed that the mutant strain L9 had stable pectinase performance within 6 generations and no significant changes were seen in terms of pectinase activity, which indicated that the mutant strain L9 had good genetic stability. The optimum pH value and temperature for producing pectinase were 5.0 and 45℃. Compared with the original strain, the mutant strain L9 produced pectinase with better activity at the optimum pH and temperature. The range of the pH stability and thermal stability of the mutant strain were also significantly wider than that of the original strain, indicating that the mutant strain had good pH stability and thermal stability. Through the above experimental results, we can know that the application of intense pulse light technology to Aspergillus Niger mutation is feasible. After the intense pulse light induced mutation and secondary screening, a mutant strain of Aspergillus Niger with higher pectinase production with high enzymatic activity and good genetic stability can be obtained.

enzyme; agricultural products; electric field; pulsed light; mutagenesis; Aspergillus Niger; pectinase; response surface analysis

張佰清，葛新宇，馬鳳鳴，馬藝超，張士豪，謝加豪. 脈沖強(qiáng)光誘變對(duì)黑曲霉產(chǎn)果膠酶活力的影響[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2020，36(3)：296－301.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2020.03.036 http://www.tcsae.org

Zhang Baiqing, Ge Xinyu, Ma Fengming, Ma Yichao, Zhang Shihao, Xie Jiahao. Effect of Aspergillus Niger induced by intensepulsed light on pectinase-producing activity[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2020, 36(3): 296－301. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2020.03.036 http://www.tcsae.org

2019-09-03

2019-10-08

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助（31772011）

張佰清，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工。Email：sybaiqinggxl@sina.com

10.11975/j.issn.1002-6819.2020.03.036

TS201.3

A

1002-6819(2020)-03-0296-06