蔣 滔，韋秀麗，肖 璐，劉 科，張 凱，李 平，王 冰

·農(nóng)業(yè)資源循環(huán)利用工程·

玉米秸稈固態(tài)和液態(tài)厭氧發(fā)酵產(chǎn)氣性能與微生物種類比較研究

蔣 滔1，韋秀麗1，肖 璐1，劉 科2，張 凱2，李 平1，王 冰1※

（1. 重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，重慶 401329；2. 農(nóng)業(yè)部農(nóng)村可再生能源開發(fā)利用南方科學(xué)觀測實驗站，重慶 401329）

厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣是中國綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展過程處理農(nóng)業(yè)廢棄物的重要手段，該文以玉米秸稈為研究對象，開展液態(tài)、固態(tài)厭氧發(fā)酵產(chǎn)氣性能、微生物系統(tǒng)多樣性及演替規(guī)律的比較研究，得出如下結(jié)論：固態(tài)發(fā)酵總固體（TS）產(chǎn)氣率及甲烷轉(zhuǎn)化率略低于液態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后，前者沼液中N、P、C的含量要低于后者；乙酸是兩發(fā)酵體系揮發(fā)性脂肪酸（VFAs）的主要組成，占總VFAs的70%以上。高通量測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2個發(fā)酵系統(tǒng)中細菌主要以、、、、及為主，這6類菌群占總克隆數(shù)的80%以上。而，，以及是兩系統(tǒng)優(yōu)勢古菌，并且隨消化過程的進行，古菌群落呈現(xiàn)由乙酸型向氫營養(yǎng)型轉(zhuǎn)變的趨勢。發(fā)酵結(jié)束后，上述2類古菌在群落中的占比基本持平。對微生物多樣性的聚類分析結(jié)果顯示，在發(fā)酵第4天和第8天后，2個系統(tǒng)中細菌與古菌群落結(jié)構(gòu)的差異逐漸明顯。進一步分析表明，影響玉米秸稈液態(tài)發(fā)酵微生態(tài)結(jié)構(gòu)的主要環(huán)境因子為乙酸，秸稈纖維素水解可能是制約物能轉(zhuǎn)化率的關(guān)鍵過程；總磷（TP）是影響固態(tài)發(fā)酵系統(tǒng)微生態(tài)結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵環(huán)境因子，而如何增加產(chǎn)甲烷古菌的生物量是提高原料產(chǎn)氣率的關(guān)鍵。該研究結(jié)果為調(diào)控玉米秸稈厭氧發(fā)酵過程、提高其生物降解效率提供了科學(xué)依據(jù)。

秸稈；發(fā)酵；甲烷；玉米秸稈；固態(tài)厭氧發(fā)酵；液態(tài)厭氧發(fā)酵；微生物群落

0 引 言

厭氧發(fā)酵生產(chǎn)沼氣是中國綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展過程處理農(nóng)業(yè)廢棄物的重要手段[1]，不僅解決了農(nóng)村燃料短缺問題[2]，而且實現(xiàn)了廢棄物無害化處理及多層次資源化利用[3-4]。厭氧發(fā)酵按底物含固率不同可分成液態(tài)厭氧發(fā)酵（L-AD，TS<15%）和固態(tài)厭氧發(fā)酵（SS-AD，TS≥15%）[5]。L-AD料液流動性好，便于輸送和攪拌，傳熱傳質(zhì)效果好，產(chǎn)生的沼氣釋放快，有利于厭氧生物過程的快速進行[6]。而SS-AD具有容積產(chǎn)甲烷率高、系統(tǒng)保溫-加熱的能量需求低、沼液產(chǎn)量少、沼渣水分低且易處理等優(yōu)點[7]，是國內(nèi)外研究熱點。目前中國秸稈沼氣工程仍以L-AD為主，SS-AD在江蘇、黑龍江等地都有較為成功的工程案例。研究證明，接種來自L-AD的沼液可以成功啟動SS-AD，它可以提供豐富的微生物，水分及營養(yǎng)元素[8]。SS-AD的物能轉(zhuǎn)化率與底物/接種物比（S/I比）相關(guān)，該值越低，系統(tǒng)穩(wěn)定性越好，緩沖能力越強，有機物利用率越高[9]；當S/I值為2時，秸稈SS-AD可獲得最高的甲烷產(chǎn)量[10]，而當?shù)孜?接種物大于4.4，系統(tǒng)酸化的風(fēng)險較高[11]。秸稈厭氧發(fā)酵系統(tǒng)微生物多樣性研究表明，細菌類的（厚壁菌門）、（擬桿菌門）、（變形菌門）是主要的優(yōu)勢種群[12]；甲烷古菌主要隸屬（廣古菌門），包括（甲烷桿菌屬）、甲烷鬃菌屬等[13]。發(fā)酵溫度、底物類型、接種物來源等宏觀調(diào)控均會對秸稈厭氧發(fā)酵微生態(tài)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，而微觀上厭氧微生物種類及演替過程又會反作用于系統(tǒng)揮發(fā)性脂肪酸（VFAs）、甲烷產(chǎn)量等發(fā)酵系統(tǒng)的宏觀指標。但目前固、液態(tài)秸稈厭氧發(fā)酵微生物群落結(jié)構(gòu)的微觀規(guī)律性及特異性差異尚不明晰，發(fā)酵代謝產(chǎn)物（如VFAs、產(chǎn)氣量）與微生態(tài)系統(tǒng)之間的關(guān)聯(lián)性尚待研究。

本文以玉米秸稈為研究對象，應(yīng)用分子生物學(xué)手段對L-AD、SS-AD系統(tǒng)微生物多樣性及演替規(guī)律進行比較研究；利用生態(tài)因子綜合分析法，揭示2種發(fā)酵系統(tǒng)宏觀環(huán)境因子與微觀生態(tài)結(jié)構(gòu)之間的相關(guān)性，以期為更好的調(diào)控玉米秸稈厭氧發(fā)酵過程、提高其生物降解效率提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

玉米秸稈采自重慶市白市驛鎮(zhèn)九里村農(nóng)田，采集后用清水洗凈，自然風(fēng)干后，將其剪短至2～5 cm，置干燥箱中55 ℃烘6 h；厭氧消化液取自豬場沼氣罐，并測定各自的理化指標（見表1）。

表1 玉米秸稈及沼液主要理化指標

1.2 試驗設(shè)計

試驗分別在固態(tài)、液態(tài)發(fā)酵2種裝置中進行，其中液態(tài)發(fā)酵裝置為全混式厭氧反應(yīng)罐，固態(tài)發(fā)酵裝置為滲濾床反應(yīng)器[14]。先將320 g玉米秸稈分別放入6個8 L的恒溫厭氧反應(yīng)器中，加入2 L稀釋后的沼液，拌勻使秸稈完全浸潤，蓋上罐蓋以減少沼液的蒸發(fā)，每天人工翻堆一次，保持微好氧狀態(tài)，7 d預(yù)處理結(jié)束后進行厭氧消化實驗。分別在3個液態(tài)發(fā)酵罐中加入4 L完全發(fā)酵后的沼液，控制TS濃度約5%；另外3個固態(tài)反應(yīng)器中加入2.5 L沼液，在秸稈床滲濾作用下，發(fā)酵TS濃度約為15%，每隔2 h將滲濾后的沼液回流噴淋一次。利用循環(huán)水浴控制發(fā)酵溫度為35 ℃，沼氣通過5 L鋁箔集氣袋收集，每種處理做3次重復(fù)。定期采集發(fā)酵過程中的沼液進行理化指標及微生物多樣性分析。

1.3 理化指標測定

沼液pH值采用臺式pH計（PHSJ-4F）測定，每次測量前用pH值為6.86和9.18的標準液校準?？偟═N）及總有機碳（TOC）采用multi N/C?2100總碳總氮分析儀測定；總磷（TP，以P計）采用過硫酸鉀氧化-鉬銻抗分光光度法測定；乙酸、丙酸、丁酸及戊酸通過氣相色譜（Agilent 7820A）進行定量分析。沼氣中CH4及CO2體積分數(shù)采用GEM 2000 plus便攜式沼氣分析儀測定，使用前用標準氣體進行校正；產(chǎn)氣量采用100 mL的針筒抽取測定。

1.4 微生物多樣性測定

沼液離心沉淀后，棄上清液，采用mobio土壤微生物DNA提取試劑盒PowerSoil?DNA Isolation Kit 進行提取。PCR所用引物為覆蓋16S rRNA基因V3+V4區(qū)域的細菌、古菌通用引物338F（5′- ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）、806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）以及Arch349F（5′-GYGCASCAGKCGMGAAW-3′）、Arch806R（5'-GGACTACVSGGGTATCTAAT-3'）這對引物對細菌和古菌的覆蓋率很高，可準確反映微生物群落的多樣性結(jié)構(gòu)[15-17]。擴增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳，試劑盒回收，分別采用NanoDrop及Agilent2100測定DNA純度及濃度[18]，最后按等摩爾比例混合成測序文庫，混合好的16S rRNA擴增子文庫用Hiseq2500測序儀測序（Illumina Inc., San Diego, CA）。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

通過QIIME平臺去除原始數(shù)據(jù)中的低質(zhì)量序列，根據(jù)標簽序列區(qū)分來自不同樣品的序列[19-20]。利用Uchime軟件去除PCR過程中形成的嵌合體[21]，獲得的高質(zhì)量序列用Usearch方法進行聚類[22-23]，以16S rRNA序列97%相似度作為分類操作單元（operational taxonomic units，OTUs）的劃分標準。Coverage覆蓋度、Chao1豐度和Shannon多樣性指數(shù)的計算在QIIME平臺上完成，通過RDP Classifier 鑒定OTU 代表性序列的微生物分類地位（80%置信水平）[24]。用非加權(quán)平均算法（UPGMA）分析樣品之間的微生物群落結(jié)構(gòu)差異，利用Canoco 5.0軟件對微生物群落與理化指標之間的關(guān)聯(lián)性進行冗余分析（RDA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)氣量及物能轉(zhuǎn)化率

如圖1所示，L-AD及SS-AD日產(chǎn)沼氣均呈“雙峰”趨勢。發(fā)酵開始的第2天，兩發(fā)酵系統(tǒng)出現(xiàn)產(chǎn)氣峰值，其主要成分為N2及CO2（體積分數(shù)約為38%），但L-AD的CH4體積分數(shù)在發(fā)酵第3天便達到33.9%，高于SS-AD的17.8%。L-AD在第11～16天達到產(chǎn)氣高峰期，平均日產(chǎn)氣2 190 mL，平均CH4體積分數(shù)57.4%；SS-AD在第15～22天進入產(chǎn)氣高峰期，平均日產(chǎn)氣2 890 mL，平均CH4體積分數(shù)為51.5%。37 d發(fā)酵過程中，L-AD平均累積產(chǎn)氣量52 500 mL，其中CH4產(chǎn)量24 442 mL；SS-AD平均總產(chǎn)氣48 295 mL，其甲烷產(chǎn)量21 078mL；計算所得玉米秸稈L-AD平均TS產(chǎn)氣率為184.9 mL/(g·d)，產(chǎn)甲烷率86.1 mL/(g·d)；SS-AD的平均TS產(chǎn)氣率為170.1 mL/(g·d)，產(chǎn)甲烷率74.2 mL/(g·d)。初步得出如下結(jié)論：1）SS-AD產(chǎn)氣高峰較L-AD晚4 d左右；2）SS-AD的TS產(chǎn)氣率略低于L-AD；3）高峰期SS-AD系統(tǒng)CH4含量低于L-AD。

2.2 基本理化指標

圖2、圖3分別描述了L-AD、SS-AD沼液pH、TP、TN以及TOC的時序變化特征。結(jié)果表明，2個系統(tǒng)的pH值呈現(xiàn)先下降、后上升、而后趨于穩(wěn)定的整體趨勢，在發(fā)酵第6天基本達到最低值，其中SS-AD平均pH值略低于L-AD，其最低值約6.4。TP及TOC呈現(xiàn)先上升后趨勢下降的態(tài)勢，而TN則呈現(xiàn)先下降、后上升，而后振蕩下降的特征。進一步分析可知，酸化水解階段秸稈中有機物的溶出提高了沼液中TP及有機質(zhì)的含量，而此階段系統(tǒng)尚未完全厭氧，為反硝化脫氮創(chuàng)造了條件。當系統(tǒng)進入產(chǎn)甲烷階段，沼液中P濃度的降低可能因沉積、吸附作用所致。此階段伴隨脫C產(chǎn)氣過程的進行，沼液中TOC濃度下降，而N濃度則受微生物增殖N消耗速率及秸稈降解N補充速率共同影響[25]。發(fā)酵結(jié)束后，兩系統(tǒng)pH值基本穩(wěn)定在7.2～7.4之間，SS-AD沼液中TP、TN以及TOC濃度較初期分別下降73.0%，44.0%及27.1%，L-AD則分別下降了40.9%，3.0%和-42.8%。兩者相比較，玉米秸稈SS-AD沼液中N、P以及C的含量要低于L-AD。

注：L-AD、SS-AD分別為液態(tài)厭氧發(fā)酵和固態(tài)厭氧發(fā)酵，下同。

圖2 玉米秸稈L-AD的理化指標變化特征

圖3 玉米秸稈SS-AD的理化指標變化特征

2.3 揮發(fā)性脂肪酸

通常VFAs濃度超過10 000 mg/L會導(dǎo)致系統(tǒng)pH值的降低，進而抑制甲烷菌的活性。本研究過程中系統(tǒng)VFAs總量在2 000 mg/L以內(nèi)，因此2個系統(tǒng)均未發(fā)生酸抑制現(xiàn)象。L-AD乙酸在VFAs體系占比最大（見圖4），但隨著時間推移，濃度逐漸下降，由開始的734 mg/L降至發(fā)酵結(jié)束后的19 mg/L；丙酸及戊酸在發(fā)酵前6 d有少量的增加，其中丙酸由19 mg/L升至41 mg/L，戊酸由低于檢出限升至5.7 mg/L，但隨后被微生物降解利用。發(fā)酵11 d后，除乙酸外，其余三類脂肪酸均低于色譜檢出上限。SS-AD在裝罐后第6 天出現(xiàn)酸峰值，乙酸由393升至1 346 mg/L；丙酸由13升至51 mg/L，丁酸及戊酸分別由低于檢出限升至43.2、7.3 mg/L。丙酸在發(fā)酵第9天達到峰值124 mg/L，隨后逐漸下降至發(fā)酵結(jié)束。對比研究發(fā)現(xiàn)，乙酸是玉米秸稈L-AD及SS-AD體系VFAs的主要組成，占總VFAs的70%以上；SS-AD系統(tǒng)在水解酸化階段的VFAs濃度高于L-AD發(fā)酵，兩系統(tǒng)在發(fā)酵第11天后，除乙酸外其余脂肪酸均無法檢測出。

圖4 玉米秸稈L-AD及SS-AD的VFAs比較

2.4 細菌多樣性

根據(jù)序列相似性97%水平劃分得到的細菌OTU總數(shù)分別為SS-AD 5364個，L-AD 5 614個。細菌多樣性結(jié)果表明（表2），2系統(tǒng)無論在Chao1豐度指數(shù)還是shannon多樣性指數(shù)上，均沒有明顯的差異（Sig.值分別為0.379及0.213），但發(fā)酵結(jié)束后細菌的豐度及多樣性較發(fā)酵前略有下降。在門分類水平上的細菌群落組成如圖5所示，兩發(fā)酵系統(tǒng)中細菌主要以擬桿菌門（）、厚壁菌門（）、變形菌門（）、、疣微菌門（）、互養(yǎng)菌門（）為主，這6類菌群占總克隆數(shù)的80%以上。其中為第一大菌群，分別占L-AD、SS-AD細菌總克隆數(shù)的31.0%～39.2%和22.2%～27.7%，在整個消化階段其相對豐度較穩(wěn)定；為第二大門，兩系統(tǒng)中的相對豐度分別為13.5～27.4%和12.4%～26.8%。是纖維素降解及乙酸形成的主要參與者，而在降解多糖類物質(zhì)中起關(guān)鍵作用[26]。研究表明忍耐不利環(huán)境的能力較強，在發(fā)酵系統(tǒng)中其相對豐度有先增加后下降的趨勢[27]，這與本研究的結(jié)果一致；同時高豐度期2系統(tǒng)中的乙酸濃度較高，在SS-AD系統(tǒng)尤為明顯。為第三大菌群，在兩系統(tǒng)中的相對豐度分別為6.9%～15.9%（L-AD）及12.5%～40.4%（SS-AD），該類菌群能夠利用乙酸等簡單的有機物，其中的假單胞菌可以在無氧條件下進行反硝化作用，2系統(tǒng)中該菌群的相對豐度隨消化時間逐漸降低。屬于未完全確定的一個細菌門類，研究表明該類菌群可以通過代謝氨基酸等獲得碳源和能量[28]，本研究中的相對豐度隨消化時間逐漸上升，其中SS-AD系統(tǒng)由初期1.0%升至20.1%，L-AD系統(tǒng)由0.7%升至8.8%。及分別為第五、第六大菌群，前者是一種新型的甲烷氧化菌，甲烷是其唯一的能量來源；后者是中溫嚴格厭氧氨基酸及丙酮酸降解菌，可能在秸稈厭氧降解中間產(chǎn)物的去除方面發(fā)揮作用[29]。兩者相對豐度總和隨發(fā)酵過程逐漸增大，其中L-AD由發(fā)酵前8.2%上升至發(fā)酵后20.3%，SS-AD由發(fā)酵前5.6%上升至發(fā)酵后13.8%。

表2 沼液中細菌群落多樣性指數(shù)（序列相似性97%水平）

注：W為L-AD，D為SS-AD，其后數(shù)字代表消化時間，d。下同。

Note :W is L-AD,D is SS-AD, the number behind is digestion time, d. The same as below.

圖5 沼氣工程系統(tǒng)中細菌在門分類水平上的群落結(jié)構(gòu)

2.5 古菌多樣性

古菌多樣性結(jié)果表明（見表3），SS-AD及L-AD的shannon指數(shù)沒有明顯差異（Sig.=0.434），但Chao1豐度指數(shù)存在顯著差異（Sig.=0.022）。在屬分類水平上的古菌群落結(jié)構(gòu)如圖6所示，2發(fā)酵系統(tǒng)中已鑒定的產(chǎn)甲烷古菌主要以甲烷鬃毛菌屬（），甲烷螺菌屬（），甲烷粒菌屬（），以及甲烷囊菌屬（）為主，這4類古菌在SS-AD中占總克隆數(shù)的24.4%～39.6%，在L-AD系統(tǒng)中占27.9%～48.0%。其中以及是乙酸營養(yǎng)型古菌，其余2者為氫營養(yǎng)型古菌。時間尺度上，2系統(tǒng)總體呈現(xiàn)由乙酸型產(chǎn)甲烷菌向氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌轉(zhuǎn)變的趨勢。如：SS-AD中及兩者相對豐度總和由13.3%（4 d）降至9.5%（18 d），及總豐度由11.1%（4 d）升至15.9%（18 d）；而L-AD系統(tǒng)乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌占比由25.6%（4 d）降至20.6%（18 d），氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌占比由10.0%（4 d）升至17.6%（18 d）。至發(fā)酵后第25天，2類古菌在系統(tǒng)中的占比基本平衡，SS-AD中乙酸營養(yǎng)型占比13.0%，氫營養(yǎng)型占比14.7%；L-AD中乙酸營養(yǎng)型占比24.8%，氫營養(yǎng)型占比23.2%，可見玉米秸稈L-AD產(chǎn)甲烷古菌總克隆數(shù)的相對豐度略高于SS-AD。

表3 沼液中古菌群落多樣性指數(shù)（序列相似性97%水平）

圖6 沼氣工程系統(tǒng)中古菌在屬分類水平上的群落結(jié)構(gòu)

2.6 差異性與相關(guān)性比較

通過對樣品細菌及古菌群落差異的UPGMA聚類分析，得到發(fā)酵不同階段層次聚類樹（如圖7）。對于細菌群落，在發(fā)酵前4天SS-AD與L-AD的群落結(jié)構(gòu)差異性較小，之后迅速變大，呈現(xiàn)明顯的聚類差異性；而對于古菌群落，系統(tǒng)OTU結(jié)構(gòu)之間的相似度在發(fā)酵第8天后顯著降低。

圖7 細菌及古菌群落的UPGMA聚類樹

采用RDA對2系統(tǒng)宏觀環(huán)境指標及微觀群落結(jié)構(gòu)進行分析（由于丁酸、戊酸部分數(shù)據(jù)低于檢測下限，故不納入分析），結(jié)果見圖8。對于L-AD系統(tǒng)，Axis1軸和Axis2軸分別解釋了55.17%和29.99%的變異性，其中日產(chǎn)氣量對Axis1軸的貢獻量最大，而VFAs、TN、TP對Axis2軸的貢獻較大?？傮w上微生物群落演變解釋度由大到小分別是乙酸＞產(chǎn)氣量＞TN＞pH＞丙酸＞TOC，因此影響L-AD微生態(tài)結(jié)構(gòu)的主要環(huán)境因子為乙酸，對L-AD群落演替的解釋度為29.1%。從樣方分布看來，穩(wěn)定產(chǎn)氣階段主要分布于第二、第三象限，發(fā)酵第11、16、18及25天4個樣方的群落結(jié)構(gòu)相似度較高。物種與環(huán)境因子的相關(guān)性表明，及與TOC正相關(guān)，與TOC呈極顯著負相關(guān)，說明前者是TOC降解的關(guān)鍵微生物，而后者則是TOC的主要貢獻者。與乙酸、丙酸及TP均呈明顯正相關(guān)，說明該菌群承擔了揮發(fā)性脂肪酸降解的主要任務(wù)，同時沼液中P是其生長的限制性因子。L-AD系統(tǒng)產(chǎn)氣量與、正相關(guān)，與及呈負相關(guān)，而與其它微生物相關(guān)性不明顯，推測對于L-AD，水解酸化是限制玉米秸稈產(chǎn)氣的關(guān)鍵過程。對于SS-AD系統(tǒng)，Axis1軸和Axis2軸分別解釋了63.57%和18.87%的變異性，其中TP、TN對Axis1軸的貢獻量最大，TOC、pH值、乙酸對Axis2軸的貢獻量最大。環(huán)境因子對SS-AD群落結(jié)構(gòu)演變的結(jié)構(gòu)度排序是：TP＞pH值＞TOC＞乙酸＞丙酸＞TN，可見，TP是影響SS-AD系統(tǒng)微生態(tài)結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵環(huán)境因子，其解釋度為38.9%。與L-AD相似，SS-AD穩(wěn)定產(chǎn)氣階段也主要分布在第二、第三象限。物種與環(huán)境因子的分布方位可知，及是TOC、乙酸及丙酸的主要生產(chǎn)者，TN是與生長的限制因子。與L-AD不同的是，SS-AD的日產(chǎn)氣量與及呈明顯正相關(guān)，與負相關(guān)，可見甲烷古菌的數(shù)量是影響玉米秸稈SS-AD產(chǎn)氣的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

圖8 L-AD及SS-AD系統(tǒng)的冗余分析

3 討 論

研究表明滲濾液回流既可提高秸稈原料纖維素、半纖維素的降解率及利用率，還可通過滲濾液入滲作用強化傳熱傳質(zhì)，提高厭氧發(fā)酵系統(tǒng)的發(fā)酵效率[30]，因此本研究的SS-AD系統(tǒng)是完全合理可行的。通過計算本研究SS-AD及L-AD的S/I比在2～4之間，處于最佳的料泥比范圍內(nèi)[9,31]，其數(shù)據(jù)具有一定的代表性。Brown等研究發(fā)現(xiàn)[32]，以農(nóng)作物秸稈及多年生草本為原料，L-AD與SS-AD的原料產(chǎn)甲烷率沒有差異，但后者的容積產(chǎn)氣率是前者的2～7倍。對于糞稈混合厭氧發(fā)酵，平均值干物質(zhì)產(chǎn)氣率對應(yīng)的TS濃度依次為8%＞20%＞16%＞12%＞4%，并且存在顯著的差異性[33]?？赡苁且驗榧S稈混合發(fā)酵為微生物生長提供了充足的N源，而純秸稈發(fā)酵消化液中N素較少，微生物生長受限，故TS濃度對原料產(chǎn)氣率的影響不顯著。本文以純玉米秸稈為底物，得到SS-AD的TS產(chǎn)氣率略低于L-AD的結(jié)論，這與Brown的結(jié)果相似。

袁月祥等以玉米秸稈為原料，在中溫（TS約6.4%）的條件下進行厭氧發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢細菌種群為（相對豐度46.07%）、（相對豐度20.51%）和（相對豐度13.09%），并且不同細菌在發(fā)酵過程中的豐度變化趨勢不同，發(fā)酵開始后相對豐度迅速上升，并最終保持在50%以上，及在發(fā)酵后持續(xù)下降，最終穩(wěn)定在10%附近[34]。玉米秸稈SS-AD研究表明，（61.0%）相對豐度最大，其后依次為（17.9%）和（8.2%）[11]。本研究對比了不同發(fā)酵系統(tǒng)在不同階段的微生物群落結(jié)構(gòu)，與其它學(xué)者結(jié)果相比，上述3類細菌是玉米秸稈L-AD及SS-AD系統(tǒng)的優(yōu)勢菌群，但L-AD系統(tǒng)并未發(fā)現(xiàn)相對豐度上升的現(xiàn)象，可能是秸稈預(yù)處理方式不同所致，袁月祥以NaOH稀堿液為預(yù)處理手段，而本研究為稀釋后的沼液，在預(yù)處理7 d內(nèi)，相對豐度已發(fā)生改變。與袁月祥研究結(jié)果相似的是，無論是SS-AD還是L-AD，在消化結(jié)束后及2類菌群的最終相對豐度穩(wěn)定在10%附近。同時本研究還發(fā)現(xiàn)的相對豐度隨時間逐漸上升，消化結(jié)束后，其在SS-AD中的其相對豐度達到20.1%，超過了及

對于古菌群落，研究發(fā)現(xiàn)、、、是玉米秸稈L-AD的優(yōu)勢群落，除外，其余4種古菌相對豐度隨著發(fā)酵時間逐漸增加[34]。Li等研究發(fā)現(xiàn)，在玉米秸稈L-AD系統(tǒng)中（29%），（19%）和（13%）是最豐富的屬，而對于SS-AD，（53%）則占絕對優(yōu)勢，其次分別為、以及[35]。而Rojas-Sossa等研究則發(fā)現(xiàn)，、及是玉米秸稈厭氧發(fā)酵主要的古菌群落[27]。上述研究結(jié)果的差異一方面可能是因接種物不同造成的，三位學(xué)者的發(fā)酵接種物分別為豬糞、牛糞以及城市污泥；另一方面，目前絕大多數(shù)研究結(jié)果只代表了1個發(fā)酵時間點，而實際上古菌在發(fā)酵過程中的相對豐度是變化的。本研究所得優(yōu)勢古菌群落與袁月祥相似，同時還發(fā)現(xiàn)隨厭氧消化過程的進行，古菌群落呈現(xiàn)由乙酸型向氫營養(yǎng)型轉(zhuǎn)變的趨勢，至發(fā)酵結(jié)束后，兩類古菌在系統(tǒng)中的占比基本持衡，Wachemo研究了水稻秸稈L-AD古菌群落演變過程，也得出相似的結(jié)論[36]。

眾多研究表明，隨著原料TS濃度的上升，原料產(chǎn)氣率會下降，主要是因為原料與微生物之間傳質(zhì)受阻，水解速率受限所致[37-38]。Riya則認為在L-AD系統(tǒng)中，當TS小于10%時，傳質(zhì)是影響原料產(chǎn)氣料的關(guān)鍵因素；而當TS升至10%～25%時，傳質(zhì)不再是影響發(fā)酵效率的重要因子，在此范圍中提高TS濃度對依賴傳質(zhì)的消化作用影響很微弱[39]。本研究通過滲濾液回流噴淋措施，很大程度上解決了秸稈SS-AD傳質(zhì)及水解速率問題，通過RDA分析得出日產(chǎn)氣量與等水解細菌呈負相關(guān)的結(jié)論，而與及呈明顯正相關(guān)，說明在SS-AD系統(tǒng)中秸稈纖維素水解不再是限制步驟，而如何增加產(chǎn)甲烷古菌的生物量才是提高原料產(chǎn)氣率的關(guān)鍵。但對于玉米秸稈L-AD系統(tǒng)，以及為代表的細菌群落對秸稈纖維素的水解可能是制約物能轉(zhuǎn)化率的關(guān)鍵過程。

4 結(jié) 論

本文以玉米秸稈為研究對象，應(yīng)用分子生物學(xué)手段對L-AD、SS-AD系統(tǒng)微生物多樣性及演替規(guī)律進行比較研究，并得出如下結(jié)論。

1）L-AD及SS-AD日產(chǎn)沼氣均呈“雙峰”趨勢，同時SS-AD產(chǎn)氣高峰期較L-AD晚約4 d，進入高峰期前者CH4含量也低于后者，統(tǒng)計得到的SS-AD的TS產(chǎn)氣率略低于L-AD。

2）玉米秸稈發(fā)酵結(jié)束后，SS-AD沼液中N、P、C的含量要低于L-AD，乙酸是兩發(fā)酵體系VFAs的主要成分，占總VFAs的70%以上。

3）2發(fā)酵系統(tǒng)中細菌主要以、、、、以及為主，這6類菌群占總克隆數(shù)的80%以上。為第一大菌群，在整個消化階段其相對豐度較穩(wěn)定；及兩類菌群豐度在發(fā)酵開始后逐漸下降，并最終穩(wěn)定在10%附近；而的相對豐度則隨發(fā)酵時間逐漸上升，在SS-AD中的最大相對豐度可達20.1%。

4），，以及是2個系統(tǒng)的優(yōu)勢古菌，并且隨消化過程的進行，古菌群落呈現(xiàn)由乙酸型向氫營養(yǎng)型轉(zhuǎn)變的趨勢，至發(fā)酵結(jié)束后，2類古菌在群落中的占比基本持平。

5）聚類分析結(jié)果顯示，在發(fā)酵第4天和第8天后，2個系統(tǒng)中細菌與古菌群落結(jié)構(gòu)的差異逐漸明顯。冗余分析表明，影響L-AD微生態(tài)結(jié)構(gòu)的主要環(huán)境因子為乙酸，以及為代表的細菌群落對秸稈纖維素的水解可能是制約物能轉(zhuǎn)化率的關(guān)鍵過程；TP是影響SS-AD系統(tǒng)微生態(tài)結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵環(huán)境因子，而如何增加產(chǎn)甲烷古菌的生物量是提高該系統(tǒng)原料產(chǎn)氣率的關(guān)鍵。

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Comparison of biogas production and microbial species of corn straw in solid-state anaerobic digestion (SS-AD) and liquid anaerobic digestion (L-AD)

Jiang Tao1, Wei Xiuli1, Xiao Lu1, Liu Ke2, Zhang Kai2, Li Ping1, Wang Bing1※

(1.,401329,; 2.,,401329,)

Anaerobic digestion (AD) is an important method to dispose agricultural waste in the process of green agriculture development in China. It not only solve the problem of fuel shortages in rural areas, but also realize the harmless treatment and multi-level resource utilization of waste. Based on the total solids (TS) content of the feedstock, AD has been developed as liquid anaerobic digestion (TS＜15%) and solid-state anaerobic digestion (TS≥15%) technologies. In this paper, the gas production performance and micro-ecological succession law of corn straw in liquid and solid biogas fermentation were compared. The result showed that: The peak period of SS-AD biogas production was about 4 days later than that of L-AD, and the CH4volume fraction of the SS-AD was lower than that of the L-AD in stable biogas production period. The biogas production rate of TS and methane conversion rate in SS-AD system were slightly lower than that of L-AD. After the fermentation, the contents of N, P and C in the SS-AD biogas slurry were lower than that of the L-AD. Acetic acid is the main component of VFAs in the two digestion systems, accounting for more than 70% of the total VFAs. High-throughput sequencing results showed that the bacteria in the two disgestion systems were mainly composed of,,,,and, which accounted for more than 80% of the total number of clones.is the largest class of bacteria, and its relative abundance is stable throughout the digestive stage, but the relative abundances ofandwere decreased gradually after the start of fermentation, and eventually stabilized around 10%. The relative abundance ofincreases with digestion time, and the maximum value can reach 20.1% in SS-AD systems. The sum of the relative abundances ofandincreases with the anaerobic digestion process.andare the dominant archaea in the two fermentation systems. These four types of archaea accounted for 24.4%-39.6% of the total number of clones in SS-AD system and 27.9%-48.0% in L-AD system. With the progress of the digestion, the archaea community showed a trend of transition from acetic acid nutrition to hydrogen nutrition. After fermentation, the proportion of these two types of archaea in the community wasin balance. The results of cluster analysis on microbial diversity showed that the difference between the bacteria and archaea community structure of the two systems gradually became obvious after the 4th and 8th day of fermentation. Further analysis showed that the main environmental factor affecting the L-AD micro-ecological structure of corn straw is acetic acid, and the hydrolysis of straw cellulose may be the key process to limit the conversion rate of raw materials. Phosphorus is the most important environmental factor affecting the micro-ecological structure of SS-AD systems, and how to increase the biomass of methanogenic archaea is the key to raise the biogas production rate of raw materials. The results of this study provide a scientific basis for regulating the anaerobic digestion process of corn straw and improving its bio-degradation efficiency.

straw; fermentation; methane; corn straw; solid-state anaerobic digestion; liquid anaerobic digestion; Microbial community

蔣 滔，韋秀麗，肖 璐，劉 科，張 凱，李 平，王 冰. 玉米秸稈固態(tài)和液態(tài)厭氧發(fā)酵產(chǎn)氣性能與微生物種類比較研究[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2020，36(3)：227－235.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2020.03.028 http://www.tcsae.org

Jiang Tao, Wei Xiuli, Xiao Lu, Liu Ke, Zhang Kai, Li Ping, Wang Bing. Comparison of biogas production and microbial species of corn straw in solid-state anaerobic digestion (SS-AD) and liquid anaerobic digestion (L-AD)[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2020, 36(3): 227－235. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2020.03.028 http://www.tcsae.org

2019-10-25

2020-01-04

重慶市技術(shù)創(chuàng)新與應(yīng)用示范專項（cstc2018jszx-zdyfxmX0009）；重慶市技術(shù)創(chuàng)新與應(yīng)用發(fā)展專項（cstc2019jscx-gksbX0158）

蔣 滔，助理研究員，研究方向為農(nóng)業(yè)廢棄物資源化利用。Email：273021978@qq.com.

王 冰，副研究員，主要從事農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境保護研究。Email：565202729@qq.com.

10.11975/j.issn.1002-6819.2020.03.028

S216

A

1002-6819(2020)-03-0227-09