方衛(wèi)飛，李銘紅，趙 青

1.金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 金華 321017

2.浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321000

植物育種是以品種改良為目的，方式有很多種，有傳統(tǒng)育種和非傳統(tǒng)育種。其中傳統(tǒng)育種包括雜交育種和遠(yuǎn)緣雜交；非傳統(tǒng)育種包括誘變育種，單-多倍體育種，細(xì)胞工程育種，基因工程育種等。誘變育種相比于其他育種方式，有著方便、快捷、效率高等特點(diǎn)，被廣泛使用。誘變育種主要是指通過(guò)物理或者化學(xué)手段，誘發(fā)植物發(fā)生遺傳性基因突變，然后從中選優(yōu)，從諸多變異體中選擇優(yōu)良品種進(jìn)行培育。非化學(xué)手段的輻射誘變育種為當(dāng)下主要的誘變育種方式，主要采用放射源（X 射線，α射線，γ射線，β射線等），中子輻射，離子輻射，紫外輻射，激光輻射，電子輻射，微波輻射等物理方法誘發(fā)基因突變。1927 年，美國(guó)科學(xué)家穆勒發(fā)現(xiàn)X 射線可以誘發(fā)果蠅產(chǎn)生突變，并且這種突變是可以遺傳的。隨后，很多著名生物學(xué)家都研究了輻射誘變育種的很多實(shí)例，比如1950 年以后，美國(guó)利用X 射線和熱中子等方法，輻射誘變育種培育成了用常規(guī)育種方式無(wú)法獲取的抗枯萎病的優(yōu)良品種Todd's Mitcham 等。我國(guó)輻射誘變育種研究工作起步于上個(gè)世紀(jì)50～60 年代，建立了輻射誘變育種研究機(jī)構(gòu)和研究院所，舉辦了全國(guó)輻射誘變育種研究學(xué)術(shù)研討會(huì)，并為我國(guó)接下來(lái)的相關(guān)研究工作奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。到了上個(gè)世紀(jì)70～80 年代，隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，與輻射育種相關(guān)的學(xué)科領(lǐng)域發(fā)展迅速，比如核技術(shù)與應(yīng)用等，輻射育種研究和技術(shù)應(yīng)用不僅僅停留在農(nóng)作物上，而且在園林等方面也得到了發(fā)展。上個(gè)世紀(jì)80 年代至今，是我國(guó)輻射誘變育種研究發(fā)展最為迅速的時(shí)期，這主要得以與生物工程，基因工程，細(xì)胞工程等技術(shù)的迅猛發(fā)展，多學(xué)科熔合，多領(lǐng)域合作，使得輻射育種的研究和應(yīng)用達(dá)到了一個(gè)全新的高度。本文主要研究不同劑量輻射對(duì)園林植物育種及生長(zhǎng)的影響，并且以法國(guó)梧桐為例進(jìn)行論述。本文利用60Co 鈷源對(duì)法國(guó)梧桐種子進(jìn)行γ射線照射，通過(guò)調(diào)節(jié)輻照的劑量大小，從幼苗中選出優(yōu)良品種。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

法國(guó)梧桐種子樣本采集于中國(guó)法國(guó)梧桐苗木之鄉(xiāng)——山東濟(jì)寧法桐基地，樣本采自15 年生的健壯植株的自然成熟的種子。樣品采集地濟(jì)寧市的年平均氣溫13.5°C，無(wú)霜期為198 d，年平均降水量為590 mm。

本文實(shí)驗(yàn)所用的60Co 鈷源輻照是在山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院與山東泉港輻射科技發(fā)展有限公司共建的“山東省輻照中心”完成的，位于濟(jì)南市長(zhǎng)清區(qū)晶恒路沃德大道，60Co 鈷源放射源為進(jìn)口源，放射源能量為7.4×1015Bq。

1.2 材料的處理

用于實(shí)驗(yàn)所采集的法國(guó)梧桐種子樣本，采用隨機(jī)采樣的方式，任意20 件，每件含有種子100 顆。然后將樣本放在樣品培養(yǎng)托盤中，托盤底面需要將大小一致的吸水性濾紙鋪滿，再注入適量的水使其浸濕。接著將樣品培養(yǎng)托盤放在培養(yǎng)箱中（暗箱環(huán)境，環(huán)境溫度在25°C±1°C）。定期在樣品培養(yǎng)托盤中加水，以保證種子樣本可以發(fā)芽。詳細(xì)記錄種子樣本的發(fā)育情況。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

處理好的法國(guó)梧桐幼芽需要在60Co 鈷源下進(jìn)行輻照，參考半致死輻射劑量的計(jì)算方法，60Co 鈷源γ射線輻照量分別設(shè)置為0 Gy、30 Gy、40 Gy、50 Gy、80 Gy、100 Gy、120 Gy，將20 件樣本分別進(jìn)行輻照，輻照順序按照劑量從低到高的順序。在輻照過(guò)程中，要持續(xù)詳細(xì)記錄樣本的發(fā)芽生長(zhǎng)情況，記錄時(shí)間為30 d。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同劑量輻射對(duì)法國(guó)梧桐種子發(fā)芽的影響

按照前述的材料處理方法和實(shí)驗(yàn)方法，將法國(guó)梧桐種子樣本進(jìn)行不同劑量γ射線輻照，將7 d 發(fā)芽率和14 d 發(fā)芽率結(jié)果記錄在表1 中。

表1 γ射線輻照量對(duì)發(fā)芽的影響Table 1 Effect of γ-ray irradiation on germination

從表1 的數(shù)據(jù)中，總體來(lái)看，發(fā)芽率與γ射線輻照劑量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系，即輻照劑量在增加的時(shí)候，發(fā)芽率是不斷降低的。分段來(lái)看，從開始到第7 d，30 Gy～50 Gy 輻照劑量下種子樣本的發(fā)芽率，低于同條件下第8 d 到第14 d 的發(fā)芽率，而第8 d 到第14 d 的發(fā)芽率與無(wú)輻照樣本的發(fā)芽率基本相同。當(dāng)輻照劑量增加到80 Gy～120 Gy 時(shí)，種子樣本的發(fā)芽率出現(xiàn)了大幅度的下降。因此，從這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，可以看出γ射線輻照的劑量達(dá)到一定強(qiáng)度以后，會(huì)阻滯種子的發(fā)芽。但是，當(dāng)γ射線輻照的劑量相對(duì)較小時(shí)，隨著時(shí)間的增加，種子發(fā)芽情況未受到明顯的影響，見圖1。

圖1 0 Dy～120 Dyγ射線輻照劑量與種子發(fā)芽率的關(guān)系圖Fig.1 Relationship between 0 Dy～120 Dy γ-ray irradiation doses and seed germination rates

2.2 不同劑量輻射對(duì)法國(guó)梧桐種子根系生長(zhǎng)的影響

法國(guó)梧桐種子樣本根系生長(zhǎng)情況的重要指標(biāo)之一是根長(zhǎng)，在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中，不同γ射線輻照劑量條件下，詳細(xì)觀察并記錄樣本的根長(zhǎng)情況，見表2。

表2 γ射線輻照量與根系生長(zhǎng)的關(guān)系Table 2 Relationship between γ-ray irradiation and root growth

圖2 顯示的是γ射線輻照劑量與種子根長(zhǎng)的關(guān)系圖，從圖中可以明顯的看出，隨著輻照劑量的增大，根長(zhǎng)越來(lái)越短，這兩者之間存在顯然的負(fù)向關(guān)系。而且還有一個(gè)現(xiàn)象是，輻照劑量達(dá)到80 Dy時(shí)，種子幾乎沒有生根，這說(shuō)明大劑量輻照對(duì)種子生根的影響是決定性的。

圖2 0 Dy～120 Dyγ射線輻照劑量與種子根系生長(zhǎng)的關(guān)系圖Fig.2 Relationship between 0 Dy～120 Dy γ-ray irradiation doses and seed root growth

2.3 不同劑量輻射對(duì)法國(guó)梧桐種子成苗率的影響

表3 記錄的是實(shí)驗(yàn)環(huán)境下，γ射線輻照量與法國(guó)梧桐的幼芽和成苗率的關(guān)系，從數(shù)據(jù)情況，可以看到γ射線對(duì)幼芽的成苗是有很強(qiáng)影響的，當(dāng)γ射線達(dá)到50 Dy 時(shí)，幼芽成苗率只有56%，當(dāng)γ射線再增加時(shí)，幼芽成苗率下降幅度非常明顯。這說(shuō)明大強(qiáng)度的γ射線會(huì)損壞幼芽，甚至導(dǎo)致幼芽的死亡。

表3 γ射線輻照量與成苗率的關(guān)系Table 3 Relationship between γ-ray irradiation and seedling rate

2.4 半致死劑量的確定

半致死劑量是指植物在生長(zhǎng)過(guò)程中，遭受放射性輻照，致使50%植株死亡（50%植株存活）的輻照劑量。半致死劑量對(duì)于輻射誘變育種研究工作意義非凡，當(dāng)輻照劑量大于半致死劑量時(shí)，會(huì)導(dǎo)致50%以上的植株發(fā)生死亡，從而使得存活植株不足以進(jìn)行研究；當(dāng)輻照劑量小于半致死劑量時(shí)，植株所遭受的輻照影響較小，無(wú)法獲得優(yōu)異的基因突變植株，也就失去了進(jìn)行輻射誘變育種的意義。圖3 和圖4 顯示的分別是輻照劑量與成苗率和根長(zhǎng)的關(guān)系圖，從這2 個(gè)圖中，看得到輻照劑量大于50 Dy 時(shí)，成苗率和根長(zhǎng)都呈現(xiàn)斷崖式下滑趨勢(shì)，可以初步確定50 Gy 是法國(guó)梧桐種子的半致死劑量。

圖3 γ射線輻照劑量與成苗率的關(guān)系圖Fig.3 Relationship betweenγ-ray irradiation doses and seedling rates

圖4 γ射線輻照劑量與14 d 根長(zhǎng)的關(guān)系圖Fig.4 Relationship betweenγ-ray irradiation doses and 14d root lengths

3 討論

本文是討論不同劑量輻射對(duì)植物種子即發(fā)芽生長(zhǎng)的影響，其關(guān)鍵是γ射線輻照劑量的確定，為了確定這一劑量，需要引入輻射誘變育種領(lǐng)域常用的半致死劑量。因此，半致死劑量的確定是輻射誘變的一個(gè)核心問(wèn)題。由于關(guān)于法國(guó)梧桐輻射誘變半致死劑量的研究相對(duì)較少，而采用何種輻照方式（X 射線，α射線，γ射線，β射線等）會(huì)得到最優(yōu)的基因突變，以及半致死劑量的數(shù)值界定等，這些問(wèn)題都需要大量的實(shí)驗(yàn)支撐。本文所采用的0Co 鈷源輻照是輻射誘變育種領(lǐng)域最為常用的方式之一，但并不一定是最適合法國(guó)梧桐的，至于其他輻照方式能否得到更加合理的結(jié)果，需要建立另一套實(shí)驗(yàn)方法和流程得以驗(yàn)證才行。法國(guó)梧桐半致死劑量的厘定，本文是通過(guò)增加輻射劑量，詳細(xì)觀察并記錄種子發(fā)芽，根系生長(zhǎng)和成苗率等參數(shù)，通過(guò)比對(duì)植株在某一輻照劑量的前后，是否發(fā)生了根本變化，最終確定法國(guó)梧桐半致死劑量為50Dy。這一數(shù)值的確定，可以很好的為法國(guó)梧桐種子得到可利用的優(yōu)秀的基因突變，帶來(lái)數(shù)據(jù)上的支撐，也為這一行道旁經(jīng)濟(jì)作物的研究做出了探索性的貢獻(xiàn)。

4 結(jié)論

4.1 法國(guó)梧桐半致死劑量

經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析，法國(guó)梧桐種子樣本的輻照半致死劑量為50 Dy。

4.2 不同輻照劑量對(duì)種子發(fā)芽，根系生長(zhǎng)以及成苗率的影響

當(dāng)γ射線輻照的劑量達(dá)到半致死劑量以后，會(huì)阻滯種子的發(fā)芽，抑制根系生長(zhǎng)和成苗。但是，當(dāng)γ射線輻照的劑量小于半致死劑量時(shí)，隨著時(shí)間的增加，種子發(fā)芽情況未受到明顯的影響，根系生長(zhǎng)和成苗率的影響幅度有限，在保證植株存活率的情況下，可以獲得有益的突變植株。