郝 督，陳 琛，張小鶯*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中 723000）

從醫(yī)學(xué)角度來(lái)看，大腸桿菌（E.coli）主要是一種存在于肝腸菌內(nèi)的科埃希菌，從菌群性質(zhì)上來(lái)看，屬于革蘭氏陰性無(wú)芽孢直桿菌，全身密布鞭毛，具有可活動(dòng)性，無(wú)明顯的芽孢（張炳亮等，2018）。大腸桿菌主要危害豬、牛、羊、雞、鴨、鵝、兔等多種幼畜（禽）。從傳染途徑來(lái)看，消化道及呼吸道等都是大腸桿菌的直接傳染途徑，幼畜或者幼禽一旦發(fā)生感染往往具有急性特點(diǎn)，且有較高的致死率，常見(jiàn)的大腸桿菌病主要包括豬黃、白痢、雛雞大腸桿菌等。

隨著畜牧業(yè)快速發(fā)展，大腸桿菌病癥日益凸顯，抗菌藥物發(fā)揮了無(wú)可替代的作用（高海濤等，2017）。但如果無(wú)節(jié)制的使用過(guò)量抗菌藥物容易激發(fā)或擴(kuò)散動(dòng)物源設(shè)耐藥病原菌，并引起藥物殘留和耐藥性增加等附加問(wèn)題，在人和動(dòng)物間引起嚴(yán)重的耐藥現(xiàn)象，嚴(yán)重阻礙臨床治療活動(dòng)的開(kāi)展。因此，尋找對(duì)大腸桿菌作用效果明顯的中草藥，研制出廉價(jià)高效的抗菌新藥物對(duì)防治該病具有重要意義。

隨著現(xiàn)代藥理學(xué)的發(fā)展，在相關(guān)理論和技術(shù)支持下，大量植物源抑菌、抗菌化學(xué)成分和殺菌化等一系列具有較大開(kāi)發(fā)潛力的化學(xué)成分被發(fā)現(xiàn)（紀(jì)曉宇等，2015；李仲興等，2004），經(jīng)過(guò)反復(fù)研究與實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，部分中草藥聯(lián)合其他抗菌藥不但可以全面提升抗菌藥自身抗菌活性，而且能在一定程度上有效限制耐藥菌的生長(zhǎng)（劉云寧等，2015）。

從傳統(tǒng)中草藥中提取天然化合物，拓展其應(yīng)用范圍，尋求替代抗菌藥物對(duì)抗多重耐藥菌已成為全球關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題（植嬋萍等，2015），具有重大意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 黃連、夏枯草、茵陳、大青葉、甘草、山楂、女貞子、蒲公英、五倍子、艾葉采購(gòu)于楊凌同康醫(yī)藥超市。硫酸慶大霉素粉末、硫酸大觀霉素粉末；硫酸慶大霉素注射液；硫酸阿米卡星注射液；硫酸卡那霉素注射液，酵母提取物；胰蛋白胨；瓊脂粉。

1.1.2 試驗(yàn)菌株 試驗(yàn)所采用的菌株主要是由西北農(nóng)林科技大學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)室提供的標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌和耐藥大腸桿菌。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；超聲波清洗儀；SW-CJ-1D型超凈工作臺(tái)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱。

1.2 方法

1.2.1 中草藥制劑的制備 以研磨器材粉碎所有藥材，每種藥材各取50 g，以高于藥材10倍左右的蒸餾水進(jìn)行為期24 h的浸泡，并采取超聲技術(shù)對(duì)其進(jìn)行破碎。經(jīng)過(guò)靜置沉淀后，將其中殘?jiān)M(jìn)行過(guò)濾篩除，將藥液以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮，將其濃度控在1 g/mL，3000 r離心15 min，提取產(chǎn)生的清液，4℃儲(chǔ)存。

1.2.2 抗菌藥溶液的制備 大觀霉素和慶大霉素粉末各40.96 mg，添加10 mL的蒸餾水進(jìn)行溶解，使其溶液達(dá)到4096 μ g/mL，儲(chǔ)存溫度以4℃為最佳。將慶大霉素注射液、阿米卡星注射液、卡那霉素注射液濃度調(diào)至4096 μ g/mL，制備成儲(chǔ)備液，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 菌懸液的制備 以LB液體作為培養(yǎng)基，接種菌株，在溫度恒定（37℃）的振蕩培養(yǎng)箱有效培養(yǎng)，利用滅菌生理鹽水調(diào)整菌液濁度，得到1.5×107～ 1.5×108CFU/mL的菌懸液（董自艷等，2014），備用。

1.2.4 中草藥提取物的抑菌圈測(cè)定 采用牛津杯法（葉文初等，2016）測(cè)定中草藥提取物的抑菌圈，主要判斷依據(jù)分為低度敏感、中度敏感、高度敏感及極度敏感，具體標(biāo)準(zhǔn)如下：

低度敏感——抑菌圈直徑＜10 mm；

中度敏感——抑菌圈直徑在10～14 mm；

高度敏感——抑菌圈直徑在15～19 mm；

極度敏感——抑菌圈直徑≥20 mm。

1.2.5 試管兩倍稀釋法測(cè)定中草藥、抗菌藥對(duì)耐藥大腸桿菌的最小抑菌濃度 依據(jù)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，在測(cè)定中草藥提取物或抗菌藥單獨(dú)抑菌和大腸桿菌的最小抑菌濃度時(shí)可采用試管二倍稀釋法（潘婕等，2015）。

1.2.6 中草藥與抗菌藥聯(lián)用對(duì)耐藥大腸桿菌微量抑制濃度指數(shù)測(cè)定 有效運(yùn)用微量肉湯棋盤(pán)稀釋法，在確保環(huán)境無(wú)菌性的情況下，按照96孔細(xì)胞培養(yǎng)板X(qián)軸、Y軸順序依次稀釋系列濃度的寒窯液體培養(yǎng)基（宋劍武，2014）。

表1 十種中草藥提取物對(duì)大腸桿菌抑菌圈測(cè)定

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果 由表1可知，采用牛津杯法測(cè)定8種中草藥煎液對(duì)大腸桿菌的敏感性，其中山楂、五倍子女貞子、夏枯草提取物對(duì)大腸桿菌的抑菌作用最強(qiáng)，為高度敏感，抑菌圈分別為20.4、22.8、15.1和 17.1 mm ；黃連、大青葉提取物對(duì)大腸桿菌的藥物敏感性均表現(xiàn)為中度敏感；其余4種中草藥提取物對(duì)大腸桿菌的抑菌作用均表現(xiàn)為低度敏感。

2.2 中草藥提取物MIC測(cè)定結(jié)果 由表2可知，在大腸桿菌抑菌過(guò)程中，不同中草藥提取物所產(chǎn)生的抑菌效果不盡相同，其中效果最為明顯的是五倍子相關(guān)提取物。最低抑菌濃度值為31.25 mg/mL；抑菌效果最差的數(shù)茵陳，最低抑菌濃度值僅為125 mg/mL。

2.3 抗菌藥MIC測(cè)定結(jié)果 由表3可知，氨基糖苷類(lèi)不同抗菌藥對(duì)大腸桿菌的抑菌效果不同，各抗菌藥的MIC值存在一定差異，所選的4種抗菌藥中，硫酸慶大霉素對(duì)大腸桿菌MIC值為8 μ g/mL，硫酸阿米卡星、硫酸卡那霉素的MIC值均為16 μ g/mL，而鹽酸大觀霉素比其他3種氨基糖苷類(lèi)抗菌藥對(duì)大腸桿菌有較弱的抑菌作用，MIC值高于 32 μ g/mL。

2.4 聯(lián)合抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果 由表4可知，中草藥與抗菌藥聯(lián)合作用時(shí)，除山楂與硫酸大觀霉素、五倍子與硫酸慶大霉素、女貞子與硫酸卡那霉素聯(lián)合表現(xiàn)為協(xié)同作用外，大部分中草藥與抗菌藥組合表現(xiàn)為相加作用，少數(shù)組合出現(xiàn)拮抗作用和無(wú)關(guān)作用。

表2 十種中草藥提取物對(duì)大腸桿菌MIC值測(cè)定

表3 抗菌藥對(duì)大腸桿菌MIC值測(cè)定

表4 中草藥聯(lián)合抗菌藥對(duì)大腸桿菌的體外聯(lián)合抑菌結(jié)果

3 討論

目前防治大腸桿菌病主要應(yīng)用抗菌藥，但抗菌藥的過(guò)量使用會(huì)破壞腸道先天免疫力，引起菌群失調(diào)癥，形成耐藥菌株，從而加大防治難度。中草藥作為中醫(yī)、中獸醫(yī)的重要一環(huán)，抗菌作用有著悠久的歷史。根據(jù)近期相關(guān)研究資料顯示，部分中草藥確實(shí)具有抗菌、細(xì)菌耐藥性延緩和消除等作用，不同于傳統(tǒng)抗菌藥，中草藥內(nèi)富含多種藥效成分，其作用為多靶點(diǎn)形式，無(wú)較為顯著的毒性特征，產(chǎn)生耐藥性的可能性相對(duì)較低。中草藥提取物不但能預(yù)防和抵抗大腸桿菌，且能有效促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，強(qiáng)化機(jī)體免疫力，有效抵抗各種疾病。周志遠(yuǎn)（2013）研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合應(yīng)用黃芩、黃連、恩若沙星等能有效提升抑菌活性，且能在某種程度上實(shí)現(xiàn)對(duì)大腸桿菌耐藥性的有效抑制。