賀 云, 汲廣博, 葉禮卉, 劉 健, 屈 瑋, 汪 璐

(合肥工業(yè)大學 食品與生物工程學院,安徽 合肥 230601)

金銀花(Honeysuckle)為忍冬科植物的干燥花蕾,是一味傳統(tǒng)的中藥[1-3],據(jù)報道金銀花中含有綠原酸、異綠原酸、木樨草素、皂苷類、揮發(fā)油類等許多功能活性成分,具有許多生物藥理作用，如抗病菌、抗氧化、抗炎性、清除自由基和清熱解毒等功效[4-6]。

中草藥在生產(chǎn)成中成藥的進程中以及對中藥飲片加工過程都會產(chǎn)生大量的藥渣[7]。早期常見的處理方式有焚燒、堆放等,這不僅對環(huán)境造成了污染,而且造成了浪費,植物類藥材經(jīng)過提取后剩下的藥渣依然含有豐富的活性成分,經(jīng)過一些相應的熱解技術(shù)可以變廢為寶,提升其經(jīng)濟價值。如今提倡綠色可持續(xù)發(fā)展的理念,工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的中藥藥渣都將廣泛應用于培養(yǎng)食用菌,用于畜禽動物飼料和飼料添加劑,用于發(fā)酵生產(chǎn)以及作為生物質(zhì)能源等領(lǐng)域[8]。

目前有文獻報道經(jīng)常用于黃酮提取的方法有傳統(tǒng)的熱回流提取(heat reflux extraction, HRE)和超聲波提取(ultrasound extraction, UE),而這會耗費更多的時間且回收率不好[9-10]。微波輔助提取(microwave assisted extraction,MAE)是指使用適合的溶劑在微波反應器中從天然藥用植物、礦物、動物組織中提取各種化學成分的技術(shù)和方法,其能夠快速升溫和破壞植物的細胞膜[11]。

本文采用響應曲面優(yōu)化法(response surface methodology,RSM)對金銀花藥渣總黃酮提取工藝條件進行優(yōu)化,期望進一步地開發(fā)利用金銀花藥渣的經(jīng)濟價值。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

金銀花(安徽省邦泰醫(yī)藥有限公司),甲醇(優(yōu)級純)、蘆丁、木樨草素、槲皮素、綠原酸(美國Sigma公司)、無水乙醇、95%乙醇、Al(NO3)3、NaNO2、NaOH均為分析純,購于國藥集團化學試劑有限公司。微波裝置(上海新沂微波化學科技有限公司),酶標儀(美國Bio-Red公司),超聲波清洗器(上?？茖С晝x器有限公司),高速粉碎機(上海頂帥電器有限公司),冷凍干燥機(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司),旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司),臺式吸引器(紹興衛(wèi)星醫(yī)療設(shè)備公司),純水儀(英國ELGA公司),液相色譜儀(安捷倫公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 金銀花藥渣中總黃酮的測定方法

本實驗采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法檢測總黃酮的量,以蘆丁作為標準品。

1.2.2 金銀花藥渣總黃酮提取工藝流程

稱取烘干粉碎的金銀花10.0 g,甩濾紙包好后置于索氏提取器中,水浴加熱,以70%乙醇作為提取液,80 ℃下提取6 h,將提取后的藥渣置于40 ℃烘箱烘干備用。準確稱取烘干后的金銀花藥渣5.00 g,進行乙醇-微波提取,將提取后的濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后進行冷凍干燥。

1.2.3 標準曲線的制作

準確稱取蘆丁10 mg用75%乙醇溶解并定容至10 mL。分別取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于10 mL比色管中,分別于各管中加入5% NaNO20.4 mL,靜置6 min,再加入10% Al(NO3)30.4 mL靜置6 min,最后加入5% NaOH 4 mL,用乙醇定容靜置15 min。以空白液做參比,然后吸取200 μL于酶標儀中,在510 nm檢測OD值[12]。以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標,OD值為縱坐標,繪制蘆丁標準曲線。標準曲線方程為:

Y=0.002 5X+0.025 8,R2=0.999 4。

1.2.4 金銀花藥渣總黃酮提取率測定

準確稱取冷凍干燥后的黃酮提取物0.1 g用75%乙醇定容于5 mL,于510 nm檢測OD值得出黃酮質(zhì)量濃度，然后根據(jù)公式X=ρVF/m計算總黃酮提取率。其中,ρ為總黃酮質(zhì)量濃度;V為待測液體積;F為稀釋倍數(shù);m為原料質(zhì)量。

1.3 金銀花藥渣總黃酮提取條件單因素試驗

以總黃酮的提取率為考察指標,分別選取料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)、乙醇體積分數(shù)(40%、50%、60%、70%、80%)、提取溫度(30、40、50、60、70 ℃)、微波功率(100、200、300、400、500 W)作為單因素進行試驗,考察其對金銀花藥渣總黃酮提取率的影響。

1.4 響應曲面優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素實驗的結(jié)果,確定優(yōu)化因素及其范圍如下：乙醇體積分數(shù)(A)為50%～70%;微波功率(B)為200～400 W;提取溫度(C)為40～60 ℃;提取時間(D)為15～25 min。根據(jù)以上數(shù)據(jù),采用Box-Behnken設(shè)計軟件設(shè)計優(yōu)化實驗,實驗設(shè)計見表1所列。

表1 響應曲面實驗設(shè)計表

1.5 HPLC檢測

本文采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)檢測藥渣中各成份的質(zhì)量分數(shù)。液相條件:SB-C18柱子,流動相為甲醇和水(體積比為65∶35),檢測波長為350 nm,流速為1 mL/min,柱溫為25 ℃,上樣量為20 μL。標準曲線的繪制:分別配制1.0 mg/mL 的綠原酸、木樨草素、槲皮素和蘆丁的儲備液,然后稀釋配置梯度質(zhì)量濃度的工作液5、10、20、40、80 μg/mL。繪制相應的質(zhì)量濃度與面積的標準曲線如下:

Y綠=35.18X-26.782,R2=0.999；

Y木=92.037X-107.93,R2=0.999 3；

Y槲=46.684X+89.139,R2=0.998 0；

Y蘆=25.78X+21.712,R2=0.999。

通過標準曲線計算出相應產(chǎn)物的質(zhì)量分數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果分析

2.1.1 提取時間對藥渣總黃酮提取率的影響

準確稱取5.00 g 的金銀花藥渣粉,用體積分數(shù)為 50% 的乙醇溶液溶解,按料液比1∶20,微波功率 400 W,溫度 50 ℃提取。測定藥渣總黃酮的提取率,結(jié)果如圖1所示。

圖1 提取時間對總黃酮提取率的影響

由圖1可知,總黃酮提取率隨著提取時間的延長先增大后減小,在20 min時其提取率最大。這是由于提取時間太短,黃酮不能充分被浸提出來,而微波加熱時間太長會破壞黃酮的結(jié)構(gòu),使黃酮分解為其他副產(chǎn)物，從而導致其提取率降低。

2.1.2 乙醇體積分數(shù)對藥渣總黃酮提取率的影響

按1∶20的料液比稱取 5.00 g 的金銀花藥渣粉末,分別加入40%、50%、60%、70%、80% 的乙醇溶液,微波功率 400 W,在50 ℃下進行提取 20 min。測定藥渣中總黃酮的提取率,結(jié)果如圖2所示。

圖2 乙醇體積分數(shù)對總黃酮提取率的影響

由圖2可知，隨著乙醇體積分數(shù)的增大，藥渣黃酮的提取率隨之呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢,當乙醇體積分數(shù)達到60%時,其提取率達到最大值。造成這種現(xiàn)象的原因是由于在植物體內(nèi)黃酮類化合物常與蛋白質(zhì)等大分子以氫鍵和疏水鍵形式結(jié)合,而有機溶劑能夠破壞這些鍵的結(jié)合,溶劑對物料的滲透性和對細胞膜的破壞性增大了[13],因此隨著乙醇體積分數(shù)的增大黃酮提取率也提高,但是當乙醇體積分數(shù)太大時,會導致乙醇不能夠向金銀花細胞內(nèi)滲入,從而影響提取率。

2.1.3 提取溫度對藥渣總黃酮提取率的影響

按料液比為 1∶20,稱取 5.00 g 的藥渣粉末于三口燒瓶中,然后加入50%的乙醇溶液,分別用30、40、50、60、70 ℃的溫度在400 W微波功率下進行提取 20 min。測定藥渣中總黃酮的提取率,結(jié)果如圖3所示。

圖3 提取溫度對總黃酮提取率的影響

由圖3可知，隨著微波提取溫度的升高，總黃酮提取率先增大后減小,溫度為50 ℃時總黃酮的提取率最大。造成這種情況的原因是溫度的高低會影響黃酮向溶劑的傳質(zhì)過程,隨著溫度的升高,傳質(zhì)速率增大,有利于黃酮的浸出。但溫度過高會促進部分受熱不均勻的黃酮分解[14],因此提取溫度為50 ℃左右為宜。

2.1.4 微波功率對藥渣總黃酮提取率的影響

按料液比為1∶20,準確稱取 5.00 g 的藥渣粉末于三口燒瓶中,然后加入50%的乙醇溶液,分別用功率為100、200、300、400、500 W的微波裝置,在50 ℃下提取 20 min。測定藥渣中總黃酮的提取率,結(jié)果如圖4所示。

從圖4可以看出，藥渣總黃酮的提取率隨著微波功率的增大先增大后減小,提取功率達到300 W時黃酮的提取率最大。這是由于微波提取功率主要是影響了升溫的速率[15],功率越大,升溫速率越大,越能促進黃酮類化合物的浸出；但功率過大反而會導致藥渣中活性成分的降低,致使提取率下降。

圖4 提取功率對總黃酮提取率的影響

2.2 響應面優(yōu)化試驗結(jié)果分析

2.2.1 響應曲面優(yōu)化實驗模型

根據(jù)Box-Behnken方法設(shè)計的結(jié)果,使用Design-Expert 11.0軟件設(shè)計優(yōu)化試驗,試驗結(jié)果見表2所列。

表2 響應曲面優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)表2進行二次回歸響應曲面分析,并建立如下模型:

Y=14.320 0+0.240 0A+0.575 8B+
0.401 7C-0.070 8D+0.842 5AB+
0.355 0AC-0.152 5AD-0.442 5BC+
0.092 5BD+1.750 0CD-1.950 0A2-
2.190 0B2-1.700 0C2-0.694 5D2。

其金銀花藥渣總黃酮提取方差分析見表3所列,而相對應的藥渣總黃酮提取回歸模型系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果見表4所列。

表3 金銀花藥渣總黃酮提取方差分析

表4 金銀花藥渣總黃酮提取回歸模型系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果

從表3的結(jié)果可以看出,該模型P<0.05,表明其具有顯著性；從失擬項可以看出該模型的失擬度不顯著,因此可用此模型對金銀花藥渣總黃酮提取工藝進行優(yōu)化與預測。

從表4可以看出該模型的一次項不顯著,交互項BC和CD最為顯著,二次項A2、B2、C2、D2極顯著,表明在微波提取條件下各因素對藥渣總黃酮提取率的作用是更為復雜的非線性影響。

2.2.2 響應面優(yōu)化與預測

根據(jù)已確定的方程為模型,繪制三維曲面圖和對應的等高線圖,結(jié)果如圖5所示。從圖5可以看出，乙醇體積分數(shù)和微波功率對總黃酮提取率的影響效果相近,響應曲面較為平緩,等高線均勻(圖5a)；同樣乙醇體積分數(shù)和提取溫度的效果類似(圖5b)；微波功率和提取時間相比,其對藥渣總黃酮提取率影響更顯著,曲面較陡,提取時間相對較小,曲面比較平緩，兩者的交互作用顯著,其等高線近乎橢圓形(圖5c)；乙醇體積分數(shù)和提取時間交互的等高線呈橢圓形,交互作用較強(圖5d)；微波功率顯著影響其提取率,提取溫度作用較小,曲面較緩(圖5e)；提取溫度和提取時間對藥渣總黃酮提取率影響顯著，曲面較陡,等高線呈橢圓形(圖5f)；通過方差分析顯示,微波功率對提取率的影響最大,提取時間次之,然后是乙醇體積分數(shù),提取溫度對提取率的影響最小。

通過Design-Expert11.0分析,可以看出金銀花藥渣總黃酮提取工藝的最優(yōu)條件如下：乙醇體積分數(shù)為61.12%,微波功率為312.59 W,提取溫度為54.40 ℃,提取時間為22.93 min?？紤]到實際操作選取最優(yōu)條件為乙醇體積分數(shù)60%,微波功率300 W,提取溫度54 ℃,提取時間23 min。在此最優(yōu)條件下藥渣總黃酮提取率的預測值為14.41%。

圖5 各個單因素之間的交互作用對提取率的影響

2.3 驗證試驗

為考察響應曲面優(yōu)化試驗的穩(wěn)定可行性,按料液比為1∶20準確稱取5.00 g凍干的金銀花藥渣粉末于三口燒瓶中,按照上述的微波提取優(yōu)化的條件(乙醇體積分數(shù)60%,微波功率300 W,提取溫度54 ℃,提取時間23 min)進行微波提取,重復3次。按2.1.4節(jié)檢測黃酮提取率,得到最終提取率為14.24%。說明響應面法適用于金銀花藥渣總黃酮的微波-乙醇提取工藝進行回歸分析和參數(shù)優(yōu)化。

2.4 金銀花藥渣提取物中有效成分分析

在最優(yōu)化的微波提取條件下,根據(jù)HPLC的檢測結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),藥渣提取物中還有綠原酸、木樨草素、槲皮素和蘆丁等有效成分,其質(zhì)量分數(shù)分別為2.98%、0.95%、0.51%和0.70%。

3 結(jié) 論

本文選取了微波輔助法提取金銀花藥渣中的總黃酮,采用Box-Behnken設(shè)計方法經(jīng)過響應面回歸模型和方差分析可知,乙醇體積分數(shù)、微波功率、提取時間和提取溫度這4種因素的交互作用對黃酮的提取率有顯著影響，且建立的模型P<0.05,說明二次方程擬合顯著,其中失擬項P>0.05,即失擬項差異不顯著,該方程對試驗的結(jié)果有較好的擬合性。驗證性試驗的結(jié)果也表明微波輔助提取金銀花藥渣總黃酮的提取率達到14.24%。因此乙醇體積分數(shù)60%,微波功率300 W,提取溫度54 ℃,提取時間23 min是金銀花藥渣總黃酮提取工藝的最優(yōu)條件。而且在該條件下所提取的綠原酸、木樨草素、槲皮素和蘆丁的質(zhì)量分數(shù)分別為2.98%、0.95%、0.51%和0.70%。本文研究也為金銀花藥渣的再利用提供了依據(jù)。