張述偉，宗營杰，方春燕，黃賽華，李靜，許建華，王亦菲，*，劉成洪，*

（1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，上海201106；2.上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海201106；3.光明種業(yè)有限公司，上海202171）

大麥（Hordeum vulgare L.）是全球第四大禾谷類作物[1]，種植分布廣，適應(yīng)性強(qiáng)，耐干旱和貧瘠，耐寒和耐鹽性也較好[2]，具有重要的經(jīng)濟(jì)價值。大麥?zhǔn)轻勗炱【坪蜕a(chǎn)飼料的重要原料，大麥籽粒營養(yǎng)成分豐富，富含纖維、蛋白質(zhì)、糖等，具有較高的食用價值[3]，大麥秸稈可作為畜牧飼料，提高動物肉質(zhì)[4]，大麥嫩葉可加工成功能性食品麥綠素（barley grass）等，具有很好的營養(yǎng)與保健價值[5-6]。可溶性糖作為信號分子在植物體內(nèi)調(diào)節(jié)植物生長，在植物的生長發(fā)育及形態(tài)構(gòu)成過程中起重要作用[7-9]。植物組織中可溶性糖含量測定是一項(xiàng)常規(guī)檢測指標(biāo)[10]，因此建立快速準(zhǔn)確的檢測方法對于科研和生產(chǎn)具有重要意義。蒽酮法是目前常用的糖定量測定方法[11]，其原理是糖在濃硫酸作用下，脫水反應(yīng)生成糠醛或甲基糖醛與蒽酮反應(yīng)，生成藍(lán)綠色化合物，在一定范圍內(nèi)，顏色深淺與可溶性糖含量成正比[12]。蒽酮比色法顯色穩(wěn)定，準(zhǔn)確性高，操作簡便快捷，廣泛應(yīng)用于各種植物組織中的可溶性糖含量測定[13]。但經(jīng)典蒽酮法測定反應(yīng)體系用量大，不能適應(yīng)快速微量測定與篩選的需要。

目前還未見蒽酮比色法微量測定方法的報(bào)道，本研究對經(jīng)典蒽酮比色法反應(yīng)體系中蒽酮與濃硫酸用量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、測定時間以及葉片取樣部位等條件進(jìn)行優(yōu)化研究，以期建立適合微孔板批量測定篩選的方法，為品質(zhì)育種和基礎(chǔ)研究提供可溶性糖指標(biāo)的檢測手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料

大麥：品種“花30”，上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所植物細(xì)胞工程研究室提供。2017年11月播種于上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)田，條播種植，正常水肥管理，至4葉期～5葉期進(jìn)行取樣。

1.1.2 主要儀器

Multiskan FC型多功能酶標(biāo)儀：賽默飛世爾儀器（上海）有限公司；96孔透明板：康寧公司；GL2241-1SCN電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；HWS26型水浴鍋：上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.1.3 試劑

葡萄糖（分析純）：西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；蒽酮（分析純）、乙酸乙酯（分析純）：生工生物工程（上海）股份有限公司；濃硫酸（分析純，1.84 g/cm3）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 顯色反應(yīng)溫度優(yōu)化

準(zhǔn)確吸取 400 μL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.5 μg/μL）于2.0 mL離心管中，加入100 μL超純水，混勻后，依次加入 100 μL 蒽酮乙酸乙酯溶液（20 mg/mL）和 1 000 μL濃硫酸，蓋緊并充分混勻后，分別置于16℃（金屬?。?、25℃（水?。?、80℃（水浴）、100℃（水?。┫逻M(jìn)行顯色反應(yīng)，每個溫度設(shè)置3個重復(fù)，加熱計(jì)時10 min，取出試管架置于濕冰水浴中迅速冷卻至16℃，10 min后取出，置于96孔透明板中，使用酶標(biāo)儀在620 nm波長下測定其吸光度。

1.2.2 顯色反應(yīng)時間優(yōu)化

分別在 5、10、15、20、25 min 后進(jìn)行顯色反應(yīng)，每個時間點(diǎn)設(shè)置復(fù)管，同上在620 nm波長下測定其吸光度。

1.2.3 顯色反應(yīng)體系優(yōu)化

采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對顯色反應(yīng)所使用的蒽酮和濃硫酸用量進(jìn)行了優(yōu)化，其中蒽酮（20 mg/mL）體積采用 4 個水平（10、50、100、150 μL），濃硫酸體積采用3個水平（100、500、1 000 μL），在最優(yōu)顯色反應(yīng)溫度和最優(yōu)時間條件下進(jìn)行反應(yīng)，測定其吸光度。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

稱取干燥后葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶于超純水，配制500 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)品母液，吸取相應(yīng)體積母液配制10 μg～200 μg的總體積為500 μL的不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入蒽酮溶液（溶于乙酸乙酯，母液濃度20 mg/mL）100 μL 和濃硫酸（密度 1.84 g/cm3）1 000 μL，放入沸水浴，取出離心管，放在濕冰上冷卻10 min。取100 μL顯色液置于96孔透明板中，采用Thermo FC多功能酶標(biāo)儀，在620 nm波長下測定其吸光度，讀取數(shù)據(jù)，以吸光度A為縱坐標(biāo)，以糖含量C為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出標(biāo)準(zhǔn)線性方程和相關(guān)系數(shù)R；由標(biāo)準(zhǔn)線性方程可求出測定糖量，計(jì)算原樣品中的可溶性糖含量。

1.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取大麥品種“花30”鮮葉（剪碎混勻）可溶性糖提取液10份，同時進(jìn)行顯色反應(yīng)，測定其吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品可溶性糖含量，在16℃下放置不同時間（0、20、30、40、60 min 和 120 min）測定樣品的可溶性糖含量。

1.2.6 樣品提取時間優(yōu)化

取大田生長的大麥幼嫩葉片（4葉期～5葉期），剪碎后稱取約100 mg，放入2.0 mL離心管中；同時稱取大麥莖葉干粉約100 mg，放入2.0 mL離心管中。加入少許液氮，用小研磨棒迅速研磨成碎片，加入1 000 μL超純水，采用沸水?。?00℃）提取不同時間（10、20、30、40、50、60 min），每個時間點(diǎn)設(shè)置 3 個重復(fù)，相同處理測定吸光度。

1.2.7 取樣部位選擇優(yōu)化

取大麥品種“花30”大田生長幼苗（4葉期～5葉期）的頂葉（完全展開葉）、倒二葉、倒三葉和莖段中可溶性糖含量，另外將倒二葉和倒三葉按葉長順序平均分為3段，分別裝入2.0 mL離心管中，向其中加入少許液氮，用研磨棒迅速研磨成粉；待液氮揮發(fā)完全，加入1.0 mL超純水，混勻放入沸水浴（100℃）加熱，10 min后取出離心管冷卻至16℃，10 000 r/min離心3 min；小心吸取上清溶液50 μL到另一干凈的2.0 mL離心管中，依次加入450 μL超純水，100 μL蒽酮（20 mg/mL）和 1 000 μL 濃硫酸，混勻；沸水浴加熱7 min；同上在620 nm波長下測定其吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用DPS 7.05軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Microsoft Excel軟件作圖，顯著水平 P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對顯色反應(yīng)產(chǎn)物吸光度的影響

通過葡萄糖與蒽酮硫酸溶液在4個不同溫度下進(jìn)行顯色反應(yīng)，比較不同反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度值（A）大小，結(jié)果見圖1。

圖1 不同溫度對顯色反應(yīng)產(chǎn)物吸光度值的影響Fig.1 Effects of different temperatures on the absorbance of the reaction products

結(jié)果表明采用100℃沸水浴溫度時反應(yīng)完全，測定吸光度值最高，因此顯色反應(yīng)溫度采用100℃沸水浴。

2.2 水浴時間對顯色反應(yīng)產(chǎn)物吸光度的影響

通過葡萄糖與蒽酮硫酸溶液在100℃沸水浴進(jìn)行顯色反應(yīng)，得到水浴時間對顯色反應(yīng)產(chǎn)物吸光度的影響見圖2。

結(jié)果表明，隨著時間的延長吸光值逐步下降（圖2A），反應(yīng)時間5 min時顯色反應(yīng)測定吸光度值最高，但與10 min相比差異不顯著；因此進(jìn)一步比較了5個更短時間（1、3、5、7 min和9 min）反應(yīng)吸光度值（圖2B），隨著時間的變化，吸光度呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，5 min和7 min之間差異不顯著但是7 min顯色反應(yīng)測定吸光度值最高，因此顯色反應(yīng)時間確定為7 min。

圖2 沸水浴反應(yīng)時間對吸光度的影響Fig.2 Absorption values at different reaction temperatures

2.3 蒽酮-硫酸反應(yīng)體系的優(yōu)化

為了縮小反應(yīng)體系體積，減少蒽酮與濃硫酸用量，采用正交設(shè)計(jì)對蒽酮-濃硫酸反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果見表1和圖3。

表1 不同蒽酮-濃硫酸反應(yīng)體系對吸光度的影響Table 1 Effects on absorbance of different anthrone-sulfuric acid reaction system

由表1可看出，當(dāng)濃硫酸從100μL增加到1000μL，蒽酮溶液從10 μL增加到50 μL以上時，顯色反應(yīng)產(chǎn)物吸光度值大幅度提高，數(shù)值均在1.0以上。在濃硫酸1 000 μL和蒽酮150 μL時吸光度值達(dá)到最大，但是與在濃硫酸1 000 μL和蒽酮100 μL吸光度值相比差異不顯著。由圖3可看出當(dāng)濃硫酸用量大于1 000 μL時，吸光度值逐漸降低。因此，最優(yōu)的蒽酮和濃硫酸顯色反應(yīng)體系確定為 100 μL 蒽酮（20 mg/mL）和 1 000 μL濃硫酸。

圖3 反應(yīng)體系中不同濃硫酸體積對吸光度的影響Fig.3 Effects on absorbance of different concentrated sulfuric acid volumes in reaction system

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用上述優(yōu)化的反應(yīng)條件，測定并繪制了葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖4。

圖4 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of glucose

由圖4可以看出，利用微孔板測定法在葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品濃度 10 μg/mL～200 μg/mL 的相關(guān)系數(shù)為 R2=0.998 3，范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為y=0.007 5x+0.022 3，式中：y為吸光度；x為葡萄糖含量。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

對于顯色反應(yīng)產(chǎn)物吸光度測定的穩(wěn)定性，采用同一測定樣品溶液放置2 h內(nèi)進(jìn)行多個時間點(diǎn)（0、20、30、40、60 min 和 120 min）測定，結(jié)果見表 2。

由表2可看出10個樣品不同時間點(diǎn)測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）均小于3%，說明測定樣品溶液2 h內(nèi)測定結(jié)果比較穩(wěn)定。

2.6 大麥葉片樣品提取時間的優(yōu)化

為了對大麥葉片中可溶性糖進(jìn)行快速提取，采用葉片鮮樣或干樣按1∶10（g/mL）的料液比進(jìn)行水加熱提取，對不同浸提時間（10、20、30、40 min 和 50 min）的可溶性糖含量進(jìn)行了測定比較。結(jié)果見圖5。

表2 同一測定樣品溶液放置不同時間后的測定穩(wěn)定性結(jié)果Table 2 Determination of stability after the same sample solution was placed at different times

圖5 大麥嫩苗同一葉片樣品不同提取時間的可溶性糖含量比較Fig.5 Comparison of soluble sugar content in the same leaf samples of barley grass at different extraction time

結(jié)果表明，在該料液比體系中沸水浴10 min提取可溶性糖，與其它更長水浴時間相比，提取含量均不存在顯著性差異，因此本體系的水浴時間采用10 min。

2.7 大麥葉片取樣部位的優(yōu)化

為了減少葉片取樣部位的可溶性糖含量差異，對不同葉片位置和同一葉片不同部位的可溶性糖進(jìn)行了測定比較。結(jié)果見圖6。

由圖6可看出，大麥不同位置的葉片可溶性糖含量依次為：倒三葉＞倒二葉＞頂葉；倒三葉、倒二葉的同一葉片不同部位可溶性糖含量依次為：頂部＞中部＞基部。為了方便取樣，可統(tǒng)一選取倒二葉的頂部葉片進(jìn)行可溶性糖含量測定。

圖6 大麥嫩苗不同組織部位和葉片部位可溶性糖含量比較Fig.6 Comparison of soluble sugar content in different tissue parts and leaf parts of barley grass

3 結(jié)論與討論

糖是高等植物的主要代謝產(chǎn)物之一，參與了植物生長、發(fā)育與抗性反應(yīng)的多個生理過程[14-15]。同時，可溶性糖還是植物果實(shí)風(fēng)味的重要物質(zhì)[16-17]。因此，植物可溶性糖含量是植物生理與品質(zhì)研究中的一個重要測定指標(biāo)。常用的測定方法有比色法[18]、近紅外光譜法[19]、高效液相色譜法[20]等。蒽酮硫酸比色法是可溶性糖測定中簡單快捷的方法之一，本研究在此基礎(chǔ)上對提取方法和測定體系做了進(jìn)一步優(yōu)化，以滿足對植物葉片新鮮樣品的可溶性糖含量進(jìn)行微量化快速篩選的需求。與現(xiàn)有測定方法相比，本試驗(yàn)建立方法的優(yōu)點(diǎn)在于：建立了合適的反應(yīng)體系，大大減少了蒽酮和硫酸的用量，節(jié)約試劑，方便操作大批量測定；樣品直接微量取樣，對植株影響較小，取樣方便，重復(fù)誤差小，且可多次取樣對植株含糖量變化進(jìn)行追蹤；樣品處理操作簡單，使用液氮處理磨樣不需要使用干樣，簡單提取后采用酶標(biāo)板快速測定方法，減少試驗(yàn)步驟，節(jié)省時間；使用的酶標(biāo)板測定，儀器操作簡單，測量過程快速，可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模測量，適合于針對大批量材料采用高通量的篩選，可行性高。該方法不僅適用于大麥，同樣可用于小麥、青稞、水稻等，為植物活體葉片中可溶性糖含量的時空分布規(guī)律研究提供了簡便有效的評估手段，為植物的耐逆性研究和品質(zhì)改良提供有效的參考價值。

本試驗(yàn)通過優(yōu)化蒽酮-濃硫酸反應(yīng)體系、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間以及大麥葉片部位和提取方法，建立了針對大麥嫩苗中可溶性糖含量微量化快速測定方法：采用蒽酮-濃硫酸（用量分別為100 μL和1 000 μL），反應(yīng)溫度為100℃，反應(yīng)時間為7 min，顯色反應(yīng)充分；測定大麥嫩葉取倒二葉片頂部，液氮磨碎后用水（100 mg鮮樣∶1 000 μL超純水）加熱提取10 min即可完成葉片可溶性糖提取。