王晶，張勇，畢萌菲，李福森，劉春明

（長春師范大學(xué)中心實驗室，吉林長春130032）

五加科人參屬中重要的3種植物人參、西洋參、三 七均為名貴中藥材，現(xiàn)代藥物化學(xué)研究表明，三者中主要的有效成分均為皂苷類化合物，迄今為止，從人參中分離得到近百種皂苷單體化合物[1-3]，從西洋參和三七中也分離得到了數(shù)十種人參皂苷[4-6]。3種中藥有效成分中含有多個相同的單體皂苷類化合物，但也有其特征的皂苷成分，例如擬人參皂苷F11為西洋參特征性成分，三七皂苷R1為三七特征成分[7]。現(xiàn)代藥理作用研究表明，人參皂苷類化合物具有廣泛的藥理活性，如延緩衰老、提高免疫力、抗腫瘤、益智、抗氧化、抗高血壓、抗高血糖以及防治阿爾茲海默癥等作用[8-10]，廣泛應(yīng)用于食品、藥品、保健品及化妝品等領(lǐng)域。

人參于2012年被審批為新資源食品后，在食品工業(yè)中發(fā)展迅速，近年來出現(xiàn)大量與人參相關(guān)的各種食品；而西洋參因為被廣泛認為“溫補”的特性，在保健品市場中常有銷售；而被稱為“銅皮鐵骨”的三七近年來更是備受矚目中藥藥效研究發(fā)現(xiàn)有效成分決定了其藥理活性，而人參、西洋參和三七作為同科同屬的植物，較多的成分是比較相似的，而作為其中最重要組分的皂苷類成分，諸多的學(xué)者進行大量的研究。本研究選購市售人參根部切片、西洋參根部切片和三七根部藥材，以其中主要皂苷類化合物為研究對象，考察3種不同的提取方法（回流、超聲輔助、溫浸）對皂苷類化合物的提取效果，應(yīng)用高效液相色譜（high perfor mance liquid chromatography，HPLC）分析3種藥材中8種主要單體皂苷含量，考察市售人參、西洋參和三七藥材中主要成分（皂苷類化合物）在不同藥材中的分布情況以及主要皂苷含量差異。

1 試驗部分

1.1 藥品與儀器

1.1.1 試劑與材料

液相色譜所用試劑（乙腈為色譜純）：加拿大Caledon LaboratoriesL公司；超純水：長春師范大學(xué)中心實驗室自制；0.45 μm濾膜：美國Agilent公司；乙醇、甲醇（均為分析純）：北京精細化學(xué)品有限公司。人參切片、西洋參切片、三七根部藥材：同仁堂大藥房；人參皂苷 Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2、Rc、Rd、三七皂苷 R1對照品：中國藥品生物制品檢定所。

1.1.2 儀器設(shè)備

高效液相色譜為Agilent 1100（配備四元梯度泵、自動在線脫氣機）、Agilent1200系列柱溫箱，色譜柱型號為 Extend-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），采用 DAD檢測器：美國安捷倫有限公司；Advantage A10密理博超純水凈化系統(tǒng)：法國密理博科技有限公司；Hei-VAP旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：中國上海EYELA公司；BS-124S電子天平：德國賽多利斯有限公司；S180H超聲清洗器：德國Elma公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制備

將人參、西洋參、三七藥材粉碎，過80目篩，采用不同提取方法進行樣品制備。

超聲輔助提取法：分別精密稱取人參粉末1.0008g、西洋參粉末1.000 7 g和三七粉末1.000 4 g置于100 mL具塞錐形瓶中，用30 mL 95%乙醇浸泡30 min，超聲輔助提取30 min，重復(fù)上述提取過程3次。將乙醇提取液合并后過濾，減壓回收溶劑至干，色譜甲醇溶解殘渣，定容至10 mL容量瓶中，過0.45 μm濾膜，得到人參、西洋參、三七樣品超聲輔助提取物（主要為皂苷類化合物），4℃保存，待用。

分別精密稱取人參粉末1.000 6 g、西洋參粉末1.000 8 g、三七粉末1.000 9 g置于100 mL具塞錐形瓶中，90 mL 95%乙醇浸泡 30 min，70℃回流提取120 min。將乙醇提取液過濾，減壓回收溶劑至干，色譜甲醇溶解殘渣，定容至10 mL容量瓶中，過0.45 μm濾膜，得到人參、西洋參、三七回流提取物溶液，4℃保存，待用。

分別精密稱取人參粉末1.000 8 g、西洋參粉末1.000 3 g、三七粉末1.000 1 g，30 mL 95%乙醇浸泡30 min后60℃水浴溫浸提取60 min，提取3次。合并乙醇提取液，過濾，濾液減壓回收至干，色譜甲醇溶解殘渣，定容至10 mL容量瓶中，過0.45 μm濾膜，得到人參、西洋參、三七樣品溫浸提取物，4℃保存，待用。

1.2.2 皂苷標準溶液配制

分別精密稱取三七皂苷R1標準品、人參皂苷標準品 Rg1、Re、Rb1、Rb2、Rc、Rd 各 1.00 mg，色譜純甲醇溶解，得到濃度為約1 000 μg/mL的儲備液，-20℃的冰箱保存，待用。

1.3 HPLC分析條件

高效液相色譜分析條件如下：流動相組成為乙腈（A），0.05%的磷酸水溶液（B），流動相梯度：0～2 min，75%B；2 min～50 min，75%～50%B，流速為 0.5 mL/min。樣品總運行時間為50 min，柱溫選擇35℃，樣品進樣量為 10 μL。

2 結(jié)果分析與討論

2.1 標準曲線的繪制

由于不同皂苷單體在相同的濃度下出峰的情況有所差異，因此在配制皂苷混合標準品樣品時，皂苷單體的濃度各不相同，根據(jù)前期試驗結(jié)果，分別移取人參皂苷 Rb10.20 mL，三七皂苷 R1、人參皂苷 Re、Rg1、Rb2、Rd各0.10 mL，人參皂苷Rf和Rc各0.05 mL，配制皂苷混合標準品溶液。應(yīng)用HPLC對皂苷標準品混合溶液進行分析，其中人參皂苷Re+Rg1合并出峰，其他各皂苷均得到較好的分離。以各皂苷的色譜峰面積為縱坐標，進樣濃度為橫坐標繪制標準曲線，得到不同皂苷的回歸方程，分別為人參皂苷Rd方程為y=556.6x+5.2169，回歸系數(shù)r為1；人參皂苷Rc方程為y=460.47x+25.155，回歸系數(shù)r為0.999 9；三七皂苷R1標準曲線方程為y=314.57x+134.66，回歸系數(shù)r為0.9998；人參皂苷Rb1方程為y=479.74x+25.155，回歸系數(shù)r為0.999 8；人參皂苷Rb2方程為y=592.31x-6.623 3，回歸系數(shù)r為0.999 8；人參皂苷Re+Rg1（合并出峰）方程為y=457.08x+303.81，回歸系數(shù)r為0.993 9；人參皂苷Rf方程為y=313.62x+7.227 2，回歸系數(shù)r為0.999 4。

2.2 HPLC分析的方法學(xué)考察

2.2.1 精密度

按1.3HPLC分析條件，對皂苷混合標準品重復(fù)測定5次，分別記錄8種皂苷（Rg1和Re合并出峰）色譜峰峰面積和保留時間，計算二者的標準偏差，結(jié)果表明7個色譜峰峰面積相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）值分別為0.21%、0.40%、0.25%、0.24%、0.28%、0.36%、0.29%和0.34%，而保留時間RSD值在0.11%～0.37%范圍之內(nèi)，表明儀器方法的精密度較好。

2.2.2 穩(wěn)定性

按1.3中HPLC分析條件檢測人參超聲輔助提取物（人參提取物中含有皂苷種類較多，具有代表性），分別于制備樣品后的 0、2、6、10、16、24 h 進行 HPLC 分析。結(jié)果表明各主要皂苷的色譜峰面積的RSD值均小于1.34%，樣品穩(wěn)定性在24 h內(nèi)較好。

2.2.3 重現(xiàn)性

取人參藥材粉末按1.2.1超聲輔助提取方制備5份供試液，應(yīng)用HPLC進行分析。結(jié)果表明，各主要皂苷峰面積的RSD均小于1.21%，儀器方法重現(xiàn)性較好。

2.2.4 回收率

取人參藥材粉末按1.2.1超聲輔助提取方制備3份供試液，分別加入適量的7種人參皂苷（人參中不含有三七皂苷R1，因此沒有在人參提取物中添加三七皂苷R1），應(yīng)用HPLC檢測加樣回收率。結(jié)果表明，主要皂苷的平均加樣回收率分別為100.22%、98.35%、97.20%、99.39%、100.27%和98.28%，RSD值在0.19%～0.45%范圍內(nèi)，說明人參皂苷加標回收率良好。

三七、西洋參、人參超聲輔助提取物及皂苷標準品HPLC指紋圖見圖1，皂苷結(jié)構(gòu)見圖2，圖2中不同皂苷的結(jié)構(gòu)式中R1、R2、R3代表的基團見表1。

圖1 人參、西洋參、三七提取物及皂苷標準品HPLC圖（λ=203 nm）Fig.1 HPLC of ginseng，Panax quinquefolium，Panax notoginseng extracts and mixture standard saponins（λ=203 nm）

圖2 主要皂苷結(jié)構(gòu)圖Fig.2 Structure of main saponins

2.3 不同提取方法的比較

人參皂苷的提取方法較多[11-14]，本文以五加科人參屬具有代表性的3種植物人參、西洋參和三七為研究對象，主要采用超聲輔助、回流和溫浸法對其中的皂苷類化合物進行提取，通過反相高效液相色譜（reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）方法分析3種藥材中的主要單體皂苷的含量，結(jié)果如表2所示。

從表2數(shù)據(jù)可知，不同方法對3種藥材中所提取的主要皂苷種類基本沒有影響，但對其含量影響較大。結(jié)果表明，3種藥材的超聲輔助提取物中主要皂苷的含量較高，回流提取物次之，溫浸提取物皂苷含量相對較低。相對于回流提取，超聲輔助提取物中雜質(zhì)較少，更便于過濾以及后續(xù)的分析檢測，且超聲輔助提取效率較高、方法便捷。

表2 不同提取物中主要皂苷的含量（n=3）Table 2 Contents of main saponins in different extracts（n=3）mg/g

2.4 3種藥材中的主要皂苷含量比較

3種藥材超聲輔助提取物中主要皂苷情況見圖3。

圖3 3種藥材超聲輔助提取物中主要皂苷情況Fig.3 The main saponins of the different ultrasonic extracts

從表2和圖3的數(shù)據(jù)可以看出，在3種五加科人參屬代表藥材中，人參提取物中含有的主要皂苷種類較多，但對于相同質(zhì)量的人參、西洋參和三七藥材來說，人參提取物中三者共有的主要皂苷含量相對較低；西洋參提取物中未檢測到人參皂苷Rf，但其他人參皂苷含量均高于人參提取物，其中，Re、Rg1、Rb1和Rd含量遠高于同質(zhì)量的人參提取物；三七皂苷R1為三七的特有成分，在三七提取物中含量較高；三七提取物中未檢測到人參皂苷Rf、Rc和Rb2，其他主要人參皂苷單體的含量均遠高于同質(zhì)量的人參和西洋參提取物。根據(jù)文獻報導(dǎo)，在人參的各部位中，參須中皂苷的含量相對較高，而在主根中其多分布于周皮與皮層中，相對的人參肉質(zhì)髓心的皂苷含量較低[15]，由于所購買的人參切片中沒有參須部位，可能導(dǎo)致了其人參皂苷含量較低。有研究對人參、西洋參和三七藥材中總皂苷含量進行比較，發(fā)現(xiàn)三七提取物中總皂苷含量較高，其次是西洋參提取物[16]。由于所購買的藥材為人參、西洋參的切片和三七的根部，因此，三七中主要皂苷的含量較高，而西洋參提取物中皂苷含量次之，人參切片提取物中主要皂苷含量相對較低，但符合藥典規(guī)定標準，2015版藥典規(guī)定人參中Rg1和Re的總量不低于0.3%，Rb1的含量不低于0.2%。

3 結(jié)論

以五加科人參屬代表藥材人參、西洋參和三七中皂苷類化合物對研究對象，采用超聲輔助、回流和溫浸法進行提取，應(yīng)用RP-HPLC方法對不同提取物中8種主要皂苷（其中Rg1和Re合并出峰）進行定量分析。結(jié)果表明，對比三種不同的提取方法，均為超聲輔助法對3種藥材中皂苷類化合物提取效果較好，且超聲輔助提取效率較高，提取物中雜質(zhì)較少。對比3種藥材中主要皂苷的分布，人參中皂苷種類較多，只有三七皂苷R1（三七特有成分）未檢測到，而西洋參提取物中未檢測到人參皂苷Rf和三七皂苷R1，三七提取物中未檢測到人參皂苷Rf、Rc和Rb2；對比不同提取物中主要皂苷含量，在3種藥材的共有皂苷中，三七根部藥材中主要皂苷含量較高，西洋參次之，人參切片藥材中的皂苷含量相對較低，但符合藥典規(guī)定。