段偉萍，李新蕊，司明東，李可昕，溫子帥，馬東來，*

（1.河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河北石家莊050200；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京210023）

山藥為薯蕷科植物薯蕷（Dioscoreaopposita Thunb.）的塊莖，為多年生纏繞草木植物，屬藥食兼用材料[1-2]。山藥富含蛋白質(zhì)、粗纖維、淀粉、多糖、尿囊素、皂苷等多種化學(xué)成分，現(xiàn)代藥理研究結(jié)果表明其具有降血糖、抗氧化、抗衰老、調(diào)節(jié)免疫等作用[3-5]。山藥中的有效成分之一是多糖，研究表明，山藥多糖具有較強(qiáng)的自由基清除作用、抗氧化作用，這與其組分、結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[6]，如朱嬌嬌等[7]報(bào)道了山藥多糖提取物能夠顯著抑制α-葡萄糖苷酶活性，可達(dá)到60%。山藥多糖常用提取方法有回流提取法、超聲提取法和微波提取法等，如李培[8]報(bào)道了酶法提取山藥多糖，并探討了山藥多糖對α-葡萄糖苷酶抑制作用條件：山藥多糖濃度40 mg/mL，溫度 40℃，時(shí)間 10 min，pH 7.2 時(shí)，山藥多糖對α-葡萄糖苷酶具有較強(qiáng)抑制作用，抑制常數(shù)Ki為65.78 mg/mL。

本試驗(yàn)以山藥為原料，利用Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化山藥多糖的超聲輔助提取工藝，再經(jīng)過醇沉、Sevag法脫蛋白和透析等步驟，得到山藥多糖。考察不同產(chǎn)地山藥多糖對α-葡萄糖苷酶酶活的抑制和體外抗氧化活性，以期為山藥的綜合開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器設(shè)備

1.1.1 材料

祁山藥、廣西山藥、河南懷山藥、安國懷山藥樣品：河北安國東方中藥材市場，經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院鄭玉光教授鑒定均為薯蕷科植物薯蕷（Dioscorea opposita Thunb.）的塊莖。

1.1.2 試劑

羥自由基試劑盒、超氧陰離子試劑盒：南京建成生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）試劑、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl β-D-glucopyranoside，PNPG）、阿卡波糖：美國Sigma公司；甲醇、乙酸等試劑均為分析純：天津市永大化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 儀器設(shè)備

島津UV-2450紫外可見分光光度計(jì)：日本島津公司；ME204E型十萬分之一電子天平：德國SARTORIUS公司；KQ-300DE型數(shù)控超聲波提取器：昆山市超聲儀器有限公司；索氏提取器：北京欣維爾玻璃儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 山藥純多糖的制備

參照文獻(xiàn)方法[9-10]，精密稱取山藥細(xì)粉5.0 g，采用索氏提取器脫脂處理后，脫脂后固體置100 mL錐形瓶中，按不同料液比加入純水，在不同溫度和不同時(shí)間下超聲輔助提取山藥多糖，冷卻并過濾，濾液減壓濃縮至10 mL，加入95%乙醇40 mL，在4℃下靜置醇沉48 h，過濾，真空冷凍干燥后，得山藥粗多糖。

將上述山藥粗多糖溶解在5 mL純水中，利用Sevag法脫蛋白，加入氯仿∶正丁醇（體積比為4∶1）混合溶液，進(jìn)行多次脫蛋白處理，直至無蛋白層。脫蛋白后多糖水液體裝入透析袋（截留分子量3 500 Da），在72 h內(nèi)用純水不斷更換透析。將透析后的山藥多糖水溶液放入真空冷凍干操器內(nèi)干燥，得到山藥多糖M mg，并計(jì)算山藥多糖的提取率：

1.2.2 多糖含量的測

采用苯酚-硫酸法[6]。以葡萄糖對照品為基準(zhǔn)，繪制以濃度X（mg/mL）為橫坐標(biāo)和吸光度Y為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=64.931X-0.001 8，R2=0.999 1。

1.2.3 Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化工藝條件

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以超聲提取溫度（X1）、超聲提取時(shí)間（X2）和液料比（X3）為自變量，山藥多糖提取率為因變量，并利用Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)組，共17 組[11-12]，見表 1。

1.2.4 山藥多糖對α-葡萄糖苷酶抑制作用

參照Anastasia方法[13]，在10 mL容量瓶中加入0.1 U/mL α-葡萄糖苷酶0.4 mL，不同濃度山藥多糖溶液0.2 mL或0.5 mg/mL阿卡波糖溶液0.1 mL，搖勻，置37℃水浴中保溫20 min。分別加入2 mmol/L PNPG溶液0.1 mL后，搖勻，置37℃水浴中保溫15 min，取出冷卻后，分別加入0.5 mol/L Na2CO3溶液1 mL，用純水定容。分別于405 nm波長下測定吸光度A1。用等量的純水替代山藥多糖溶液作為空白組。計(jì)算α-葡萄糖苷酶抑制率公式如下：

表1 因素水平表Table 1 Factor and evel

式中：A0、A1分別為空白組和試驗(yàn)組的吸光度值。

1.2.5 山藥多糖的抗氧化性能

1.2.5.1 DPPH·清除能力

山藥多糖對DPPH·清除率的測定，參照葛明明等DPPH·清除率測定方法[14-15]。精密移取不同濃度的山藥多糖溶液0.2 mL，加入0.1 mmol/L DPPH的甲醇溶液0.2 mL，用甲醇定容于1 mL容量瓶中，混合均勻，放置10 min，在517 nm處測定吸光度A。按下式計(jì)算DPPH·的清除率。

式中：A樣品為不同濃度樣品的吸光度；A對照為用甲醇替代0.1 mmol/L DPPH的甲醇溶液的吸光度；A空白為用純水替代不同濃度樣品的吸光度。

1.2.5.2 OH·清除能力

山藥多糖對OH·清除率的測定，采用南京建成生物工程研究所提供的OH·自由基測定試劑盒。精密移取不同濃度的山藥多糖溶液0.2 mL，按試劑盒說明書操作，于550 nm處測定吸光度A。按下式計(jì)算OH·的清除活力：

式中：A樣品為不同濃度樣品的吸光度；A對照為用純水替代不同濃度樣品的吸光度。

1.2.5.3 O2-·清除能力

山藥多糖對O2-·清除率的測定，采用南京建成生物工程研究所提供的抑制超氧陰離子自由基測定試劑盒。精密移取不同濃度的山藥多糖溶液0.2 mL，按試劑盒說明書操作，于550 nm處測定吸光度A。按下式計(jì)算O2-·的清除率。

式中：A樣品為不同濃度樣品的吸光度；A對照為用純水替代不同濃度樣品的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均按照對應(yīng)的公式計(jì)算，平行測定3次（n=3），所得結(jié)果以平均值表示。數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分別采用軟件origin 9.0和Design Expert 8.0.6。

2 結(jié)果與分析

2.1 山藥多糖響應(yīng)面優(yōu)化分析

2.1.1 試驗(yàn)結(jié)果與模型建立

采用Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)獲得的結(jié)果見表2，并應(yīng)用Design Expert 8.0.6軟件對17個(gè)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析，得到以山藥多糖提取率為響應(yīng)值的回歸方程：Y=9.34+0.64 ×X1+0.18×X2+0.064×X3+0.16×X1X2+0.31×X1X3+0.60×X2X3-0.62×X12-1.24×X22-0.87×X32。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Table 2 Response surface design and experimental results

2.1.2 方差分析與顯著性檢驗(yàn)

方差分析表見表3。

由表3回歸方程方差分析結(jié)果可知，該模型P＜0.01表示差異具有顯著性，失擬項(xiàng)P＞0.05表示差異不顯著，說明該模型能較準(zhǔn)確地預(yù)測提取溫度、提取時(shí)間和液料比對山藥多糖提取率的影響。同時(shí)，模型的相關(guān)系數(shù)R2為0.949 0和RAdj2為0.883 3，表明該模型對多糖提取過程能較好的進(jìn)行分析和預(yù)測。變異系數(shù)C.V.值為4.61%，C.V.值越大表明該模型的置信度越高。由表3方差分析中各因素項(xiàng)的P值可知，一次項(xiàng)X1、二次項(xiàng) X12、X22、X32和交互項(xiàng) X2X3對山藥多糖提取率影響顯著，其余項(xiàng)影響不顯著，說明各因素與山藥提取率不是簡單的線性關(guān)系。

表3 方差分析表Table 3 Table of variance analysis

2.1.3 響應(yīng)面分析與最佳條件確定

圖1為以多糖提取率為響應(yīng)值的4個(gè)因素的趨勢圖，圖中等高線可直觀地反應(yīng)出兩變量間相互作用程度。

圖1C中響應(yīng)面坡度較陡，表明料液比和提取時(shí)間兩個(gè)因素對山藥多糖提取率的影響較大。而圖1A和1B中，提取溫度一側(cè)的響應(yīng)面坡度相對于料液比和提取時(shí)間要平緩，表明提取溫度對山藥多糖提取率的響應(yīng)不靈敏。圖1響應(yīng)面分析結(jié)果與回歸方差分析結(jié)果吻合。

圖1 響應(yīng)曲面3D圖Fig.1 Response surface 3D plots for interaction

由Design Expert 8.0.6軟件分析計(jì)算，獲得山藥多糖的超聲輔助提取工藝的最佳條件，為了方便操作對所獲得的最佳工藝條件進(jìn)行了修正：提取溫度為66℃，提取時(shí)間為 26 min，液料比 22 ∶1（mL/g），山藥多糖的預(yù)測提取率為9.55%。在在最佳條件下，重復(fù)平行驗(yàn)證試驗(yàn)5次，測得山藥多糖提取率為9.34%，與預(yù)測值偏差2.20%，表明所得模型能夠較好的預(yù)測山藥多糖的提取情況。

2.2 山藥多糖提取率與純度

利用山藥多糖最佳提取條件得到的不同產(chǎn)地的山藥多糖，按照“2.1”、“2.2”項(xiàng)下相關(guān)方法計(jì)算山藥多糖的提取率和純度見表4。

其中河南懷山藥的提取率最高為9.43%，純度為89.15%。山藥多糖是山藥品質(zhì)判定的重要理化指標(biāo)，其含量也直接影響到山藥的生物活性，河南懷山藥作為山藥的道地產(chǎn)區(qū)也可能與其多糖含量較高有關(guān)系。

表4 4個(gè)產(chǎn)地山藥多糖提取率與純度Table 4 Extraction rate and purity of Chinese yam polysaccharide

2.3 山藥多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制試驗(yàn)

表5為山藥多糖和陽性對照阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制試驗(yàn)結(jié)果。

4個(gè)產(chǎn)地的山藥多糖對α-葡萄糖苷酶都有一定抑制活性，隨著質(zhì)量濃度的增大，山藥多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制率不斷增加，并呈劑量依賴關(guān)系。在相同濃度下，4個(gè)產(chǎn)地山藥多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制率大小順序?yàn)椋汉幽蠎焉剿帲酒钌剿帲景矅鴳焉剿帲緩V西山藥。

表5 α-葡萄糖苷酶的抑制率Table 5 Inhibitory rate of α-glucosidase

2.4 山藥多糖的抗氧化性能

2.4.1 山藥多糖清除DPPH·能力

4種山藥多糖對DPPH·的清除率見圖2。

圖2 4種山藥多糖對DPPH·的清除率Fig.2 Removal ability of four Chinese yam polysaccharides toward DPPH·

由圖2可知，隨著山藥多糖質(zhì)量濃度的增加，山藥多糖對DPPH·的清除率增加，在山藥多糖質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL時(shí)，河南懷山藥多糖對DPPH·的清除率可達(dá)到71.25%，其次為祁山藥。

2.4.2 山藥多糖清除OH·能力

4種山藥多糖對OH·的清除能力見圖3。

圖3 4種山藥多糖對OH·的清除能力Fig.3 Removal ability of four Chinese yam polysaccharides toward OH·

由圖3可知，4種山藥多糖對OH·都有較好的抑制能力，隨著山藥多糖質(zhì)量濃度的增加，山藥多糖對OH·的清除率增加，當(dāng)質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL時(shí)，河南懷山藥對OH·的清除率可達(dá)到88.35%，其次為祁山藥。

2.4.3 山藥多糖清除O2-·能力

4種山藥多糖的O2-·清除能力見圖4。

圖4 4種山藥多糖的O2-·清除能力Fig.4 Removal ability of four Chinese yam polysaccharides toward O2-·

由圖4可知，4種山藥多糖對O2-·都有較好的清除能力，隨著質(zhì)量濃度的增大，多糖對O2-·都有較好的抑制能力不斷增加，當(dāng)質(zhì)量濃度為10.0 mg/mL時(shí)，山藥多糖對O2-·清除能力增長緩慢，廣西山藥對O2-·清除能力最高為69.81%，其次為祁山藥。

通過試驗(yàn)表明河南懷山藥多糖含量最高，對α-葡萄糖苷酶的抑制作用、對DPPH自由基的清除作用均最優(yōu)，其符合河南為山藥道地產(chǎn)區(qū)質(zhì)優(yōu)效佳的傳統(tǒng)認(rèn)知。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化了超聲輔助提取山藥多糖的工藝條件：提取溫度為66℃，提取時(shí)間為 26 min，液料比 22 ∶1（mL/g），在此條件下，山藥多糖提取率為9.34%。體外試驗(yàn)研究表明，山藥多糖對α-葡萄糖苷酶具有較顯著的抑制作用，并呈現(xiàn)一定的濃度依賴性，當(dāng)4個(gè)產(chǎn)地山藥多糖濃度為30 mg/mL，河南懷山藥多糖的α-葡萄糖苷酶抑制率達(dá)到44.03%，其次為懷山藥39.43%。與陽性對照阿卡波糖相比，山藥多糖的α-葡萄糖苷酶抑制作用均低于阿卡波糖，但山藥多糖也顯示出較強(qiáng)的抑制作用。山藥多糖抗氧化活性研究顯示，當(dāng)山藥多糖濃度為5.0 mg/mL時(shí)，河南懷山藥多糖對DPPH·的清除率可達(dá)到71.25%；當(dāng)山藥多糖質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL時(shí)，河南懷山藥對OH·的清除率可達(dá)到88.35%；當(dāng)山藥多糖濃度為為10.0 mg/mL時(shí)，廣西山藥對O2-·清除能力最高為69.81%。本試驗(yàn)結(jié)果顯示河南懷山藥和祁山藥的品質(zhì)好，符合河南懷山藥和祁山藥質(zhì)量優(yōu)良的道地產(chǎn)區(qū)傳統(tǒng)認(rèn)知。