李春林，李春陽

（1.江蘇連云港中等專業(yè)學(xué)校，江蘇連云港222000；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇南京210014）

近年來，乳酸菌發(fā)酵果蔬飲料得到了許多研究者的關(guān)注，番木瓜[1]、懷山藥[2]、小麥苗[3]等均采用乳酸菌發(fā)酵被加工為發(fā)酵飲料。發(fā)酵后的果蔬飲料不僅具有更好的風(fēng)味和獨(dú)特的口感，而且可以增加果蔬飲料維生素含量，提高其營養(yǎng)價(jià)值[4]。蠶豆（Vicia faba L.）屬豆科蠶豆屬作物，別名胡豆、佛豆、羅漢豆、野豌豆等，起源于亞洲的西部和中部[5]。蠶豆有著悠久的食用歷史，營養(yǎng)價(jià)值高，其中的蛋白質(zhì)含量非常豐富，含量高達(dá)21%，在所有的豆科類植物中，含量只略低于大豆[6]。中醫(yī)認(rèn)為，蠶豆性平，可以促進(jìn)腸胃的吸收功能，對(duì)水腫、喉部出血、高血壓、食欲底下、中氣不足等癥狀有治療功效[7]。蠶豆在我國栽培歷史悠久，是我國目前種植面積和產(chǎn)量位居第三的食用豆類作物，常年播種面積在100萬公頃左右，產(chǎn)量在150萬～200萬噸之間，分別占世界蠶豆種植面積和總產(chǎn)量的53%和61%，其中很大一部分用來以鮮莢形式直接進(jìn)入市場[8-9]。除此以外，蠶豆還可以被加工為罐頭[10]、膨化食品[11]、淀粉[12]以及功能性食品[13]。但以蠶豆為原料，利用乳酸菌制備發(fā)酵飲料尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)采用植物乳桿菌制備蠶豆發(fā)酵飲料，優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)，改善風(fēng)味，并分析發(fā)酵對(duì)蠶豆飲料抗氧化性的影響，為蠶豆的深加工提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蠶豆：市購；中溫 α-淀粉酶（50 000 U/g）：江蘇銳陽生物科技有限公司；直投式植物乳桿菌：常州益菌加生物科技有限公司；白砂糖：廣州華糖食品有限公司；黃原膠、羧甲基纖維素鈉（sodium carboxymethyl cellulose，CMC-Na）、結(jié)冷膠等均為食品級(jí)：市售；1，1-二苯基-2-苦基肼：美國Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

WK-801榨汁機(jī)：佛山微格電器有限公司；L550臺(tái)式低速離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；HPX-9052 MBE培養(yǎng)箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；721S可見分光光度計(jì)：上海棱光技術(shù)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蠶豆發(fā)酵飲料的制備

選擇顆粒飽滿，無雜質(zhì)、霉變和蟲蛀的蠶豆，用水沖洗3遍除去原料中的雜質(zhì)，然后在75℃的水浴中浸泡60 min。將浸泡后的蠶豆以料水比1∶12（g/mL）的比例打漿，加入中溫α-淀粉酶，在70℃下酶解50 min。酶解液采用200目濾布雙層過濾，煮沸10 min，立即冷卻至25℃?zhèn)溆谩?/p>

蠶豆酶解液加入直投式植物乳桿菌，攪拌均勻，在培養(yǎng)箱中發(fā)酵一定時(shí)間，加入白砂糖，0.04%黃原膠、0.15%CMC-Na、0.06%結(jié)冷膠，加熱至60℃，25 MPa均質(zhì)2次后灌裝，95℃殺菌10min，取出后分段冷卻。工藝流程如下：

蠶豆→清洗去雜→浸泡→打漿→酶解→過濾→煮沸→冷卻→接種→發(fā)酵→配料→均質(zhì)→灌裝→殺菌→冷卻

1.3.2 植物乳桿菌發(fā)酵單因素試驗(yàn)

以發(fā)酵后的酸度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，固定接種量為0.5%，發(fā)酵時(shí)間為 16 h，設(shè)置發(fā)酵溫度為 30、35、40、45 ℃，考察發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵的影響；固定發(fā)酵溫度35℃，發(fā)酵時(shí)間16 h，設(shè)定植物乳桿菌的接種量分別為0.05%、0.1%、0.2%、0.5%、1.0%，考察接種量對(duì)發(fā)酵的影響；固定植物乳桿菌接種量0.5%，發(fā)酵溫度35℃，將蠶豆料液分別發(fā)酵 16、24、32、40、48 h，考察發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵的影響。

1.3.3 發(fā)酵工藝優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以發(fā)酵液酸度為指標(biāo)，采用Box-Behnken Design響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)。響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface methods

1.3.4 白砂糖添加量對(duì)蠶豆發(fā)酵飲料感官品質(zhì)的影響

蠶豆料液發(fā)酵后的酸度很高，需要加入白砂糖來調(diào)節(jié)酸甜比。在發(fā)酵后的蠶豆飲料中分別添加不同的白砂糖，考察加糖量對(duì)飲料感官評(píng)分的影響。感官評(píng)價(jià)由15位人員進(jìn)行，根據(jù)對(duì)飲料的喜好程度分別打分（非常不喜歡為1，不喜歡為2分，一般喜歡為3分，喜歡為4分，非常喜歡為5分）。

1.3.5 酸度的測(cè)定

采取NaOH滴定法測(cè)蠶豆發(fā)酵飲料的酸度[14]。

1.3.6 抗氧化性的測(cè)定

配制濃度為50 μg/mL的VC，將發(fā)酵前后的樣液在3 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心10 min，取上清液，將上清液稀釋5倍后作為待測(cè)液，測(cè)定VC與蠶豆飲料羥基自由基清除率[15]、DPPH自由基清除率[16]以及還原力[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌發(fā)酵最佳工藝參數(shù)

2.1.1 發(fā)酵溫度對(duì)酸度的影響

發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酸的影響如圖1所示。

由圖1可見，發(fā)酵溫度為35℃時(shí)，蠶豆發(fā)酵飲料的酸度最高，過低或者過高的發(fā)酵溫度都會(huì)抑制植物乳桿菌產(chǎn)酸。這是由于植物乳桿菌的最佳適用溫度為30℃～40℃，在此溫度下有利于乳桿菌的生長繁殖。在植物乳桿菌發(fā)酵黃秋葵、柚子汁等研究中也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)發(fā)酵溫度增加到35℃時(shí)，飲料中的活菌數(shù)達(dá)到最大值，產(chǎn)酸較多[18-19]。因此，選擇發(fā)酵溫度為35℃。

圖1 發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酸的影響Fig.1 Influence of fermentation temperature on acid production

2.1.2 接種量對(duì)蠶豆飲料酸度的影響

接種量對(duì)產(chǎn)酸的影響如圖2所示。

圖2 接種量對(duì)產(chǎn)酸的影響Fig.2 Effect of inoculation on acid production

由圖2可見，隨著接種量的增加，酸度隨之增大。當(dāng)接種量大于0.5%以后，酸度增加速率減小。乳桿菌價(jià)格昂貴，本著節(jié)約成本的原則，選取接種量較低、酸度較高的發(fā)酵條件，后期可以通過添加糖中和酸對(duì)感官品質(zhì)的影響。因此，對(duì)接種量與酸度進(jìn)行min-max標(biāo)準(zhǔn)化，統(tǒng)一評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化求和，結(jié)果如圖3所示。

圖3 Min-max標(biāo)準(zhǔn)化求和Fig.3 Min-max standardized summation

由圖3可見，在接種量為0.5%時(shí)，min-max標(biāo)準(zhǔn)化求和的值最高。因此，選擇0.5%為較適宜的接種量。

2.1.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酸度的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酸的影響如圖4所示。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酸的影響Fig.4 Influence of fermentation time on acidity

由圖4可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，蠶豆發(fā)酵飲料的酸度逐漸上升。在發(fā)酵時(shí)間到達(dá)40 h后，產(chǎn)酸量增加的幅度慢慢趨于恒定。這是由于植物乳桿菌利用原料中的碳水化合物不斷產(chǎn)酸，一直升高的酸度及其代謝產(chǎn)物對(duì)菌的生長具有抑制和殺滅作用，從而抑制了其生長，飲料的酸度基本保持不變[3]。綜合考慮，初步確定發(fā)酵時(shí)間在40 h左右。

2.1.4 發(fā)酵工藝響應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以蠶豆發(fā)酵飲料的酸度為指標(biāo)，對(duì)接種量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and result of response surface optimization test

利用Design-Expert軟件對(duì)表2中的酸度進(jìn)行回歸擬合，得到二次多項(xiàng)回歸方程：酸度/%=15.5A+0.107 5B+4.442 5C－1.026 96×10-14AB+0.02AC+0.017 5BC－13.25A2－0.007 656 25B2－0.069 5C2。

對(duì)上述響應(yīng)面模型進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果如表3所示。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

表中模型p=0.000 5，說明該模型非常顯著。在模型中，一次項(xiàng) A（p＜0.05）顯著，B、C 和二次項(xiàng) C2非常顯著（p＜0.01）；各發(fā)酵因素對(duì)酸度的影響次序是 C＞B＞A。相關(guān)系數(shù)R2=0.9845，表明此模型的擬合度十分好，能很好地描述因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，可以解釋98.45%的變化。R2Adj=0.956 5，說明試驗(yàn)誤差小，可信度較高。因此，此模型較為可靠。

根據(jù)上述二次多項(xiàng)回歸方程可得，當(dāng)接種量為0.6%，發(fā)酵溫度為37.09℃，酶解時(shí)間為40 h時(shí)，發(fā)酵飲料酸度的預(yù)測(cè)值達(dá)15.36%。為便于生產(chǎn)操作，將發(fā)酵溫度修正為37℃。在最優(yōu)條件下制備蠶豆發(fā)酵飲料，測(cè)得酸度為15.25%，與理論值相差不大，說明模型較為可靠，具有可行性。

2.2 加糖量對(duì)感官品質(zhì)的影響

加糖量對(duì)感官品質(zhì)的影響見圖5。

由圖5可見，當(dāng)白砂糖的添加量為8%時(shí)，飲料的感官評(píng)分最高，所制備的蠶豆發(fā)酵飲料酸甜可口，風(fēng)味優(yōu)良，因此，選擇白砂糖的添加量為8%。

2.3 發(fā)酵對(duì)蠶豆飲料抗氧化性的影響

2.3.1 發(fā)酵對(duì)蠶豆飲料清除OH·能力的影響

發(fā)酵對(duì)OH·清除能力的影響見圖6。

圖5 白砂糖添加量對(duì)飲料感官評(píng)分的影響Fig.5 Effect of sucrose addition on the sensory score of beverage

圖6 發(fā)酵對(duì)OH·清除能力的影響Fig.6 Effects of fermentation on OH·scavenging power of broad bean beverage

由圖6可見，蠶豆飲料發(fā)酵后對(duì)OH·清除能力增加，與濃度呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，但是清除能力小于濃度為50 μg/mL的VC。在取樣量達(dá)到0.6 mL后，發(fā)酵前后蠶豆飲料對(duì)OH·清除能力趨于平緩。李倩等[20]利用植物乳桿菌發(fā)酵辣木葉提取液后，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后OH·清除能力為先升后降的趨勢(shì)，但是整個(gè)發(fā)酵過程中的自由基清除能力均高于未發(fā)酵辣木葉提取液。復(fù)合乳酸菌發(fā)酵懷山藥的研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵前后飲料的OH·清除能力均高于VC，但是發(fā)酵前后并沒有顯著性差異[21]

2.3.2 發(fā)酵對(duì)蠶豆飲料清除DPPH·能力的影響

發(fā)酵對(duì)蠶豆飲料DPPH·清除率的影響見圖7。

圖7 發(fā)酵對(duì)蠶豆飲料DPPH·清除率的影響Fig.7 Effects of fermentation on DPPH·scavenging power of broad bean beverage

如圖7所示，蠶豆飲料對(duì)DPPH·清除率隨著取樣量的增加而增加，并且發(fā)酵后蠶豆飲料對(duì)自由基的清除能力提高，但是二者都低于濃度為50 μg/mL的VC。有研究表明，果蔬、谷物等食品對(duì)DPPH·清除能力隨著發(fā)酵時(shí)間的增加而提高，這與其中多酚類物質(zhì)的增加有關(guān)[21-22]。但是也有研究發(fā)現(xiàn)，果蔬飲料在發(fā)酵過程中可能由于黃酮類物質(zhì)的不穩(wěn)定性和發(fā)酵過程中產(chǎn)生了分解酚類物質(zhì)的酶，對(duì)DPPH·清除率隨時(shí)間變會(huì)呈現(xiàn)先增加后變化趨勢(shì)[23]。

2.3.3 發(fā)酵對(duì)蠶豆飲料還原力的影響

發(fā)酵對(duì)蠶豆飲料還原力的影響見圖8。

圖8 發(fā)酵對(duì)蠶豆飲料還原力的影響Fig.8 Effects of fermentation on reducing power of broad bean beverage

由圖8可見，還原力與取樣量呈一定的量效關(guān)系。隨著取樣量的增加，樣品的還原力也增加。發(fā)酵后飲料的還原力大于發(fā)酵前，但是二者的還原力都小于50 μg/mL 的 VC。

3 結(jié)論

植物乳桿菌可用于蠶豆發(fā)酵飲料的制備，最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為接種量0.6%，發(fā)酵時(shí)間40 h，發(fā)酵溫度37℃，在此條件下制備的飲料酸度為15.25%。在發(fā)酵液中添加8%的糖，所得蠶豆發(fā)酵飲料酸甜可口，風(fēng)味良好。發(fā)酵提高了蠶豆飲料的抗氧化性，但是始終小于50 μg/mL的VC。因此利用植物乳桿菌發(fā)酵蠶豆可改善飲料的風(fēng)味，得到抗氧化活性較高的蠶豆發(fā)酵飲料。但由于飲料中抗氧化體系較為復(fù)雜，對(duì)其抗氧化活性作用的機(jī)理尚不明確，有待于繼續(xù)深入研究其抗氧化機(jī)理，為蠶豆飲料產(chǎn)品的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。