張亮亮，張展諾，閆可婧，額日赫木，張麗芳，徐建國(guó)，*

（1.山西師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，山西臨汾041004；2.山西師范大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，山西臨汾041004；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西太谷030801）

山楂（Crataegus pinnatifida Bunge），又名紅果、山里紅等，屬薔薇科，是一種多年生木本植物，在我國(guó)北方廣泛種植。山楂是衛(wèi)生部批準(zhǔn)的藥食兩用水果，營(yíng)養(yǎng)豐富，具有消食健胃、行氣散瘀的功效[1-2]。許多研究表明，山楂富含維生素C（890 mg/kg FW）、多糖（10.23%～14.25%）、多酚（61.84 mg RE/g）、黃酮（33.56 mg GAE/g）等功能性物質(zhì)，具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗菌、降血糖、降血脂和神經(jīng)保護(hù)等活性作用[1-6]。鐘麗霞等[6]優(yōu)化了山楂多糖的提取條件，并表明山楂粗多糖具有一定的降血糖、降血脂活性；何彩梅等[7]研究了山楂70%乙醇提取物的組成成分及抗氧化能力；張曉波等[8]研究了不同品種山楂80%丙酮提取物的抗氧化能力；努爾阿麗耶·阿卜力米提等[4]研究了新疆山楂水和乙醇提取物的清除自由基能力及抑菌作用。除此之外，研究表明山楂原花青素可通過(guò)影響抗氧化酶活力和細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白來(lái)抑制人肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[5]。

但目前有關(guān)不同溶劑對(duì)山楂提取物的活性物質(zhì)含量及其生物活性影響的研究還未見(jiàn)詳細(xì)報(bào)道。為有效開(kāi)發(fā)山楂資源，本文對(duì)山楂不同溶劑提取物的抗氧化活性進(jìn)行了初步研究。本研究以山楂為材料，采用甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、石油醚等6種不同極性的溶劑分別提取山楂中的總黃酮、總多酚類(lèi)物質(zhì)，分析其主要的化學(xué)成分，研究不同溶劑提取物的抗氧化能力及其對(duì)DNA和蛋白質(zhì)氧化損傷的保護(hù)作用，為山楂資源的開(kāi)發(fā)利用及功能食品開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

大金星山楂：10月上旬采摘于本地果園，經(jīng)去核、晾干后粉碎，密封低溫保存?zhèn)溆?。兒茶素、綠原酸、原花青素B2、表兒茶素、槲皮素、對(duì)苯二甲酸、金絲桃苷、異槲皮苷：上海源葉生物科技有限公司；1，1苯基-2-苦 肼 基 自 由 基 （1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2-聯(lián)氮-3-乙苯-二噻唑-6 磺酸[2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]、Fe3+-三吡啶三吖嗪[2，4，6-tris（2-pyridyl）-s-triazine，TPTZ]：Sigma公司；pBR322質(zhì)粒DNA：大連寶生物公司；甲醇、乙腈（色譜純）：天津市科密歐化學(xué)有限公司。

RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；Centrifuge 5804R型冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；Agilent 1100型高效液相色譜儀：美國(guó)Agilent公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 提取物制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥的山楂，粉碎過(guò)40目篩，按照1∶10（g/mL）的料液比，分別加入不同溶劑，25℃振蕩2 h，收集上清液，重復(fù)3次。將上清液混合后減壓濃縮，將得到的浸膏經(jīng)真空冷凍干燥，分別得到甲醇提取物（methanol extract，ME）、乙醇提取物（ethanol extract，EE）、丙酮提取物（acetone extract，AE）、乙酸乙酯提取物（ethyl acetate extract，EAE）、氯仿提取物（trichloromethane extract，TE）和石油醚提取物（petroleum ether extract，PE）。

1.2.2 總黃酮含量測(cè)定

參照文獻(xiàn)[9]的試驗(yàn)方法，稱(chēng)取一定量的提取物，溶解，取0.1mL樣液，加入0.15mL5%NaNO2溶液，25℃放置6 min后加入0.15 mL濃度為10%的Al（NO3）3溶液，反應(yīng)6 min，加入4%的NaOH溶液2 mL，并用蒸餾水定容到5 mL，反應(yīng)3 min后，測(cè)定混合液在508 nm處的吸光度值。同時(shí)以蘆丁標(biāo)品溶液做標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合的回歸方程y=2.403 5x+0.004 9（R2=0.999 2）。總黃酮含量測(cè)定結(jié)果以每克山楂中所含的蘆?。╮utin）的量表示（mg RE/g）。

1.2.3 總多酚含量測(cè)定

參照文獻(xiàn)[9]的試驗(yàn)方法，準(zhǔn)確移取0.1 mL樣液，向其中加入2.8 mL蒸餾水，0.1 mL 1 mol/L的Folin-酚試劑，混勻，25℃避光反應(yīng)8 min，再加入2 mL 7.5%Na2CO3，避光2 h，測(cè)其在765 nm處的吸光度值。以沒(méi)食子酸標(biāo)品溶液做標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合回歸方程為y=1.558 2x+0.008 2（R2=0.999 6）?？偠喾雍康臏y(cè)定結(jié)果以每克山楂中所含的沒(méi)食子酸的量表示（mg GAE/g）。

1.2.4 組成成分分析

提取物的成分分析方法參照文獻(xiàn)[10]略作修改。選用 C18色譜柱（5 μm，250 mm×4.6 mm），采用三氟乙酸（1%）作為流動(dòng)相 A，用乙腈/甲醇（80∶20，體積比）作為流動(dòng)相B。進(jìn)樣量為10 μL，柱溫保持在35℃，流動(dòng)相下洗脫流速1 mL/min，洗脫過(guò)程為：0～5 min，3%B；5min～12min，3%～10%B；12min～25min，10%～18%B；25 min～35 min，18%～20%B；35 min～40 min，20%～80%B；40 min～45 min，80%～3%B；45 min～50 min，3%B。各組分在280 nm的吸光度值被檢測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)品兒茶素、綠原酸、原花青素B2、表兒茶素、槲皮素、對(duì)苯二甲酸、金絲桃苷、異槲皮苷在同樣的條件下進(jìn)行高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析，并以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品成分根據(jù)對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間定性，含量根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。

1.2.5 DPPH自由基清除能力測(cè)定

參考文獻(xiàn)[11]的方法，量取500 μL不同濃度的山楂提取物于試管中，添加2.5 mL的DPPH溶液，避光反應(yīng)30 min，測(cè)量其在517 nm波長(zhǎng)處的吸光度值，計(jì)算DPPH自由基清除率，清除能力以IC50（自由基清除率為50%時(shí)添加的提取物的濃度）表示。

1.2.6 ABTS自由基清除能力測(cè)定

參考文獻(xiàn)[11]的方法，量取100 μL不同濃度的山楂提取物于試管中，添加3.8 mL的ABTS溶液，避光反應(yīng)6 min，在734 nm處測(cè)定吸光度值，計(jì)算ABTS自由基清除率，清除能力以IC50（自由基清除率為50%時(shí)添加的提取物的濃度）表示。

1.2.7 鐵還原能力（ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）測(cè)定

參考文獻(xiàn)[11]的方法，量取100 μL山楂提取物于試管中，加TPTZ溶液1.8 mL，37℃反應(yīng)30 min，立即記錄反應(yīng)體系在593 nm處的吸光度值。同時(shí)以FeSO4·7H2O 做標(biāo)準(zhǔn)曲線（100 μmol/L～1 000 μmol/L），得回歸方程為 y=0.000 6x+0.003 5（R2=0.993 8），鐵還原能力結(jié)果以每克山楂相當(dāng)于μmol Fe（II）表示（μmol Fe（II）/g）。

1.2.8 蛋白質(zhì)氧化損傷的保護(hù)試驗(yàn)

試驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)[12]，量取5 μL1 mg/mL的牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）溶液，依次加入5 μL 山楂提取物、5 μL 磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS） 緩沖溶液、2.5 μL10 mmol/L 的硫酸銅溶液和 2.5 μL 雙氧水（50 mmol/L），搖勻，放入 37℃水浴1 h。空白組用PBS緩沖液替代山楂提取物。采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測(cè)蛋白質(zhì)，在凝膠成像記錄儀中拍照，并通過(guò)灰度值計(jì)算其相對(duì)保護(hù)率。

1.2.9 DNA氧化損傷的保護(hù)試驗(yàn)

試驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)[11]，取1 μL的pBR322 DNA，加入 14 μL 的 PBS 緩沖溶液（pH 7.4），5 μL 山楂提取物，然后加入2.5 μL 1 mmol/L的硫酸亞鐵溶液和2.5 μL 1 mmol/L雙氧水，混合均勻并置于37℃水浴中反應(yīng)30 min，取出后立即進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)，在凝膠成像記錄儀中拍照，并通過(guò)灰度值計(jì)算其相對(duì)保護(hù)率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。數(shù)據(jù)采用Excel 2013、SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取物中總黃酮、總多酚含量

山楂不同溶劑提取物的總多酚和總黃酮含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同溶劑提取物中總黃酮和總多酚含量Fig.1 Contents of total phenolics and flavonoids of different solvents extracts

由圖1得知，不同提取物中的總黃酮含量存在明顯差異，其中ME中總黃酮的含量最高（61.84mgRE/g），其次為 EE（44.42 mg RE/g）、AE（12.78 mg RE/g）、EAE（3.08 mg RE/g）、TE（2.59 mg RE/g），PE中總黃酮含量最低為0.59 mg RE/g。與總黃酮含量的變化相似，ME中總多酚含量最高為38.40 mg GAE/g，EE中多酚含量為37.99 mg GAE/g，但ME和EE二者之間總多酚含量無(wú)顯著差異；其余提取物中總多酚含量由高到低依次為 AE（33.56 mg GAE/g）、EAE（17.12 mg GAE/g），TE（4.48 mg GAE/g）和 PE（2.66 mg GAE/g）。試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著提取溶劑極性的不斷增加，山楂中總黃酮和總酚類(lèi)物質(zhì)的溶解程度也隨之增加，這與一些以前的研究報(bào)道相一致[9，13]，符合酚類(lèi)物質(zhì)主要為溶解在中等和高極性溶劑中的特征。然而提取劑極性與酚類(lèi)物質(zhì)含量并非一一對(duì)應(yīng)，如田強(qiáng)等[14]報(bào)道厚樸葉的乙醇提取物中的總酚含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其甲醇提取物；陸健等[15]報(bào)道大麥的丙酮提取物中多酚的含量大于甲醇提取物。這些差異可能與原料種類(lèi)、產(chǎn)地、提取方法及其酚類(lèi)物質(zhì)的組成成分有關(guān)。

2.2 不同提取物的成分組成

不同提取物成分含量見(jiàn)表1。

表1 不同提取物成分含量Table 1 Chemical components in extracts of different solvents mg/100 g DW

由表1可知，不同溶劑提取物中含有的物質(zhì)種類(lèi)和含量存在明顯差異，在ME、EE和AE中檢測(cè)到全部8種物質(zhì)，EAE未檢測(cè)到異槲皮苷，TE中檢測(cè)到6種物質(zhì)，而PE中只檢測(cè)到原花青素B2、表兒茶素和金絲桃苷3種物質(zhì)?？偟膩?lái)看，每種提取物中，表兒茶素和原花青素B2的含量較高，其次為綠原酸、槲皮素。EE中含有最高的兒茶素，其次為ME和AE；而對(duì)于其他每種物質(zhì)成分，其含量最高的被發(fā)現(xiàn)在ME中，其次為EE、AE、EAE、TE 和 PE。

2.3 不同提取物清除DPPH自由基和ABTS自由基能力

山楂不同提取物的DPPH自由基和ABTS自由基清除能力結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同溶劑提取物的自由基清除能力Table 2 DPPH and ABTS free radicals scavenging ability of different solvent extracts

不同提取物對(duì)DPPH自由基和ABTS自由基具有不同程度的清除作用，在測(cè)定濃度范圍內(nèi)均呈線性關(guān)系。ME和EE清除DPPH自由基能力顯著強(qiáng)于其它提取物，其 IC50值分別為 2.43、3.22 mg/mL，其次為 AE、EAE、TE和PE。不同提取物對(duì)ABTS自由基的清除能力與DPPH自由基的清除能力相一致，清除能力由強(qiáng)到弱依次為 ME＞EE＞AE＞EAE＞TE＞PE。

2.4 山楂提取物的鐵還原能力

山楂不同溶劑提取物的鐵還原能力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 不同溶劑提取物鐵還原能力Fig.2 FARP value of different solvent extracts

由圖2可以看出，提取溶劑對(duì)提取物的鐵還原能力有顯著的影響。ME的鐵還原能力最強(qiáng)，為2.88 mmol Fe（II）/g，其次為 EE（2.17 mmol Fe（II）/g）和AE（0.91 mmol Fe（II）/g）；EAE、TE 和 PE 的鐵還原能力沒(méi)有顯著差異，分別為 1.74、1.12、1.08 mmol Fe（II）/g，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其它提取物。

2.5 不同提取物對(duì)蛋白質(zhì)氧化損傷的保護(hù)效果

Cu2+、Fe2+、Fe3+等金屬離子可以催化雙氧水，產(chǎn)生能與氨基酸反應(yīng)的·OH[16]，本試驗(yàn)通過(guò)Cu2+-H2O2體系產(chǎn)生·OH，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的氧化損傷，考察山楂提取物對(duì)蛋白質(zhì)損傷的保護(hù)作用，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同溶劑提取物對(duì)蛋白質(zhì)損傷的保護(hù)效果Fig.3 Protective effects of different solvent extracts on protein oxidative damage

在蛋白質(zhì)氧化損傷的反應(yīng)體系中，提取物可能會(huì)通過(guò)直接清除羥基自由基來(lái)保護(hù)蛋白質(zhì)[17]。不同溶劑提取物處理組中，ME對(duì)蛋白質(zhì)的保護(hù)率達(dá)到了55.78%，其次為EE、AE對(duì)蛋白質(zhì)的保護(hù)率分別為53.12%和37.25%，EAE對(duì)蛋白質(zhì)的保護(hù)率為25.94%，而TE和PE對(duì)蛋白質(zhì)的氧化損傷基本上起不到保護(hù)作用。

2.6 不同提取物對(duì)DNA氧化損傷的保護(hù)效果

天然存在的pBR322 DNA呈超螺旋結(jié)構(gòu)，受外界因素?fù)p傷導(dǎo)致其中一條鏈斷裂變?yōu)殚_(kāi)環(huán)形，兩條鏈斷裂變?yōu)榫€型，通過(guò)檢測(cè)pBR322 DNA構(gòu)象的改變，可反映DNA氧化損傷程度[18-19]。山楂提取物對(duì)DNA損傷的保護(hù)作用結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可知，ME、EE對(duì)DNA的氧化損傷具有較好的保護(hù)作用，保護(hù)率分別達(dá)到了74.14%、63.17%，AE對(duì)DNA氧化損傷的保護(hù)率為31.35%，EAE為17.06%，TE和PE對(duì)DNA氧化損傷沒(méi)有保護(hù)作用，保護(hù)率僅為2.41%和0.43%。

2.7 總多酚、黃酮含量與生物活性的相關(guān)性分析

山楂提取物中總多酚、總黃酮含量與其生物活性的相關(guān)性分析結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖4 不同溶劑提取物對(duì)DNA損傷的保護(hù)效果Fig.4 Protective effects of different solvent extracts on DNA oxidative damage

圖5 總多酚、黃酮及生物活性的相關(guān)性分析Fig.5 Correlation analysis of total polyphenols，flavonoids and biological activities

不同溶劑提取物中總酚含量、黃酮含量與其抗氧化能力、蛋白質(zhì)和DNA氧化損傷保護(hù)能力呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)均不小于0.794，且相關(guān)性顯著（P＜0.05）。這些結(jié)果與以前的一些報(bào)道相一致[14，20-21]，說(shuō)明山楂提取物總多酚、黃酮含量的多少可以反映其抗氧化能力及其對(duì)蛋白質(zhì)和DNA氧化損傷保護(hù)能力的強(qiáng)弱。除此之外，提取物的抗氧化能力、蛋白質(zhì)和DNA氧化損傷保護(hù)能力之間的相關(guān)性亦呈顯著正相關(guān)，說(shuō)明這幾種方法適合測(cè)定并能綜合反應(yīng)山楂提取物的抗氧化能力

3 結(jié)論

本研究比較了山楂不同溶劑提取物的總多酚和總黃酮含量，隨著提取溶劑極性的增強(qiáng)，提取物中總多酚和總黃酮的含量隨之增加，即ME＞EE＞AE＞EAE＞TE＞PE，表明山楂中極性多酚的含量較高。

分析測(cè)定了提取物的組成成分、體外生物活性及其相關(guān)性。通過(guò)5種評(píng)價(jià)體系可知，山楂的不同溶劑提取物中ME、EE和AE表現(xiàn)出較好的抗氧化能力及其對(duì)蛋白質(zhì)和DNA氧化損傷保護(hù)能力，而EAE、TE和PE的生物活性相對(duì)較弱，山楂提取物中總多酚和總黃酮含量與其生物活性具有顯著正相關(guān)性。本試驗(yàn)通過(guò)研究不同溶劑對(duì)山楂提取物活性成分及其生物活性的影響，為山楂資源的深度開(kāi)發(fā)提供參考，但其活性單體的分離純化、生物活性及其之間相互作用，均有待于進(jìn)一步深入研究和探討。