李佳婷，王敏

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西楊凌712100）

乳狀液通常由一種液體以液滴的形式均勻的分散在另一種液體中，具有熱力學(xué)穩(wěn)定性，容易受到乳脂、沉淀、絮凝或凝聚等機(jī)制的影響，在儲存過程中發(fā)生破乳，導(dǎo)致相分離現(xiàn)象的發(fā)生[1]。此外，由于乳狀液中具有較大面積的油水界面，在貯藏的過程中會產(chǎn)生油脂氧化等問題。分散的脂質(zhì)相和含有水溶性促氧化劑的水相之間較大的界面面積，增加了它們對氧化的敏感性，并且由于氧分子、金屬離子等促氧化劑的存在會進(jìn)一步降低體系的氧化穩(wěn)定性[2]。而對抗油脂氧化最好的方式就是在乳狀液中加入抗氧化劑以抑制氧化反應(yīng)?，F(xiàn)階段，我國食品工業(yè)上主要是采用人工合成的抗氧化劑來提高乳化型食品的穩(wěn)定性，雖然人工合成的抗氧化劑較為高效，但此類抗氧化劑對人體存在著潛在的危害，不利于人體的健康。因此，尋求健康、安全、綠色的天然抗氧化劑應(yīng)用到食品工業(yè)中，成為當(dāng)下研究的熱點。

近年來，蛋白質(zhì)水解物作為天然抗氧化劑同時還具有乳化效果而受到學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注。蛋白質(zhì)經(jīng)過酶解后導(dǎo)致肽鍵的斷裂，自由氨基和羧基的濃度增加，從而能夠增加蛋白質(zhì)的溶解度[3]。已有研究表明對蛋白進(jìn)行重度水解能夠產(chǎn)生較多的游離氨基酸和小分子的多肽，使得蛋白質(zhì)具有較強(qiáng)的抗氧化活性，但此時蛋白質(zhì)已經(jīng)喪失了原有的乳化特性[4]。然而，蛋白質(zhì)在適度水解的情況下，二級和三級結(jié)構(gòu)的部分展開和一級結(jié)構(gòu)發(fā)生最小離解。此時，蛋白質(zhì)水解物能夠?qū)⑷闋钜喝榛尚》肿拥囊旱?，減小乳化液滴的粒徑，還能夠通過終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、螯合金屬離子對抗油脂的氧化[5]。雖然，適度水解的蛋白質(zhì)乳化性增強(qiáng)，但抗氧化活性卻遠(yuǎn)不如重度水解后的蛋白質(zhì)。多酚類化合物（如單寧酸、綠原酸、植物提取物等）能夠通過共價鍵或非共價鍵與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，改善蛋白的功能特性。蘋果提取物是一種從蘋果中提取出來的生物活性物質(zhì)，含有原花青素、酚酸及黃酮類物質(zhì)等。蘋果提取物具有良好的保健效果，如預(yù)防高血壓、抗氧化、防衰老、抗過敏、促進(jìn)排毒等。蘋果提取物具有較強(qiáng)的自由基清除能力和抗氧化能力，能夠抑制脂質(zhì)氧化，延長食品的儲藏期。這類植物提取物的抗氧化活性主要與酚類化合物的存在有關(guān)，如肌酸和肌醇，它們是其主要的抗氧化成分。蘋果提取物與多肽能夠通過多酚中的芳香環(huán)和肽中的脯氨酸殘基形成可溶性聚集體，提高其抗氧化活性[6]。因此，本試驗以花生蛋白水解物（peanut protein hydrolysate，PPH）為主要研究對象，研究了蘋果提取物（apple extract，AE）對花生蛋白水解物制備乳狀液氧化穩(wěn)定性的影響，為制備品質(zhì)穩(wěn)定的乳狀液類型產(chǎn)品提供試驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生蛋白粉：宜城天鑫油脂有限公司；大豆油：益海嘉里食品有限公司；十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfonate，SDS）：Sigma公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉：天津市巴斯夫化工有限公司；硫代巴比妥酸、三氯乙酸、過硫酸鉀：美國Fisher公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JB-2恒溫磁力攪拌器：上海雷磁新徑儀器有限公司；TU-1800紫外可見光分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；Ultra-Turrax T18高速分散器：德國IKA公司；AH-basic高壓均質(zhì)機(jī)：上海ATS公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 花生蛋白水解物的制備

稱取一定量的花生蛋白將其配制成底物濃度為4%的溶液，經(jīng)90℃預(yù)熱5min用堿性蛋白酶分別水解1 h，酶與底物之比為2∶100（質(zhì)量比），保持pH值不變。水解完成后，置于90℃水浴中加熱5 min滅活，用1mol/LHCl將pH值調(diào)成中性后在4500g下離心15min后凍干備用。

1.3.2 乳狀液的制備

將10 wt%的大豆油與90 wt%的PPH（質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%）用高速均質(zhì)機(jī)在13 500 r/min下乳化2 min后添加不同濃度AE（0、50、100和150 μg/mL，終濃度）混勻，在40 MPa下高壓均質(zhì)兩次。加入NaN3（0.02%）抑制微生物。

1.3.3 絮凝指數(shù)和凝結(jié)指數(shù)的測定

絮凝指數(shù)（flocculation index，F(xiàn)I）和凝結(jié)指數(shù)（coagulation index，CI）的測定參照 Castellani等[7]的方法，計算方式如下：

式中：d4，3-water為乳狀液分散在超純水中，μm；d4，3-SDS為乳狀液分散在 1%SDS 中，μm；d4，3-24h和 d4，3-0h分別為乳狀液放置0 h和24 h的粒徑，μm。

1.3.4 熒光光譜分析

取乳狀液100 μL加入到5 mL磷酸鹽緩沖溶液稀釋（pH 7.0，0.01 mol/L）中。激發(fā)波長分別為283 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度設(shè)置為10 nm，以240 nm/min的速率收集數(shù)據(jù)。

1.3.5 過氧化值（peroxide value，POV）的測定

POV測定參考硫代硫酸鈉滴定法[8]。0.5 mL樣品加入到10 mL乙酸/氯仿溶液（3∶2，體積比）震蕩混勻后加0.5 mL飽和碘化鉀溶液，混合后暗反應(yīng)3 min，用超純水終止反應(yīng)。加入0.5 mL 0.5%淀粉溶液，用2 mmol/L Na2S2O3滴定至藍(lán)色消失。

式中：A和B分別為樣品和空白所消耗的Na2S2O3的體積，mL；C 為 Na2S2O3的濃度，mol/L；m 為樣品的質(zhì)量，g。

1.3.6 硫代巴比妥酸值的測定

根據(jù)Mei等[9]的方法并稍作改動。硫代巴比妥酸溶液的配制：將0.375 g硫代巴比妥酸、15 g的三氯乙酸，12 mol/L的鹽酸1.76 mL和82.9 mL水混勻，再加入3 mL 2%的丁基羥基茴香醚（butyl hydroxyani sole,BHA）溶液。將1 mL樣品與4 mL上述溶液以及1 mL水進(jìn)行混合，沸水加熱15 min，冷卻25℃后，過0.45 μm濾膜，濾液在532 nm測吸光值，確定樣品中丙二醛的含量。

1.3.7 PPH在乳狀液中分布

乳狀液在15 000 g下離心45 min，吸取下層乳清液15 000 g離心30 min后過0.22 μm濾膜。所得濾液稀釋后用雙縮脲法測蛋白含量，計算分配系數(shù)：

式中：PC 為分配系數(shù)；VW為水的體積，mL；Vl為油的體積，mL；Wt為總的蛋白含量，mg/mL；WW為水相中的蛋白含量，mg/mL。計算當(dāng)中油的密度（g/mL）為0.922。

水相中蛋白占總的蛋白的比例計算公式為：

水相中PPH/%=（WW/Wt）×100。

1.4 統(tǒng)計分析

每個試驗重復(fù)3次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用Statistix 8.1（分析軟件，St Paul，MN）軟件包中Linear Models程序進(jìn)行，差異顯著性（P＜0.05）分析使用Tukey HSD程序，采用Sigmaplot 11.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 絮凝指數(shù)和凝結(jié)指數(shù)的測定

通過粒徑大小評估乳狀液在儲存期間是否存在絮凝和聚結(jié)的最常用方法之一。絮凝狀態(tài)可能受到不同因素的影響，如界面吸附蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)/油比率、酸堿度、溫度和離子強(qiáng)度。不同濃度AE對PPH穩(wěn)定乳狀液的絮凝指數(shù)（FI）和凝結(jié)指數(shù)（CI）的影響見表1。

未添加AE的乳狀液，F(xiàn)I和CI分別為32.85%和99.95%。與對照組相比，隨著AE用量的增加，F(xiàn)I和CI顯著降低（P＜0.05），這表明AE的加入顯著提高了乳狀液的穩(wěn)定性。在乳狀液中，加入100 μg/mL AE的乳狀液比其他添加量都具有更高的穩(wěn)定性。乳狀液的穩(wěn)定性通常由靜電和空間穩(wěn)定性控制，通過油水界面上的蛋白質(zhì)含量。靜電穩(wěn)定主要是由于液滴表面存在電荷，而空間穩(wěn)定則是由于液滴表面的聚合物屏障的附著而產(chǎn)生的，而增加空間穩(wěn)定性有助于減緩絮凝和聚結(jié)[10]。研究結(jié)果表明，AE的加入可能會在界面周圍形成界面膜，從而導(dǎo)致更高的空間穩(wěn)定性。因此，與單獨應(yīng)用PPH制備的乳狀液相比，AE的加入可以在很大程度上抑制PPH在油滴表面聚集的發(fā)生。但是，當(dāng)AE的添加濃度為150 μg/mL時，F(xiàn)I和CI增大，乳狀液的絮凝和凝結(jié)穩(wěn)定性都出現(xiàn)了不同程度的下降、穩(wěn)定性降低。這可以解釋為蛋白水解物的結(jié)構(gòu)比較松散，并會與AE在界面上形成競爭吸附競爭吸附破壞了蛋白與多酚化合物的相互作用。

表1 不同濃度AE對PPH制備乳狀液的FI和CI的影響Table 1 Effect of different concentrations of AE on FI and CI of PPH emulsion

2.2 熒光光譜分析

乳狀液貯藏后會逐漸導(dǎo)致氨基酸發(fā)生氧化降解導(dǎo)致色氨酸熒光強(qiáng)度減弱，進(jìn)而能夠反應(yīng)出蛋白質(zhì)的氧化情況。乳狀液樣品在283 nm處激發(fā)，并在340 nm～360 nm具有最大峰值。不同濃度AE對PPH制備乳狀液色氨酸熒光發(fā)射光譜的影響見圖1。

圖1 不同濃度AE對PPH制備乳狀液色氨酸熒光發(fā)射光譜的影響Fig.1 The effect of different concentrations of AE on the fluorescence emission spectrum of tryptophan from PPH emulsion

添加不同濃度的AE都導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低，濃度越高熒光強(qiáng)度越弱。這可能是多酚類化合物能夠與色氨酸發(fā)生反應(yīng)，致使熒光強(qiáng)度降低。由于金屬離子的存在，可使色氨酸分解為自由基并于氧接觸發(fā)生氧化，從而導(dǎo)致脂質(zhì)氧化。可見脂質(zhì)氧化的越劇烈，色氨酸被分解的越多，熒光強(qiáng)度越弱。因此，過氧化物和丙二醛含量的變化趨勢與色氨酸熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)的變化趨勢。

2.3 POV和硫代巴比妥酸反應(yīng)物（thiobarbituric acid reactant，TBARS）的變化趨勢

不同濃度AE對PPH制備乳狀液貯藏期的POV含量的影響見圖2，不同濃度AE對PPH制備乳狀液貯藏期的TBARS含量的影響見圖3。

圖2 不同濃度AE對PPH制備乳狀液貯藏期的POV含量的影響Fig.2 Effect of different concentrations of AE on POV content in emulsion prepared by PPH during storage

圖3 不同濃度AE對PPH制備乳狀液貯藏期的TBARS含量的影響Fig.3 Effect of different concentrations of AE on TBARS content in emulsion prepared by PPH during storage

通過測定貯藏10 d乳狀液的POV和TBARS，評價了AE對PPH穩(wěn)定乳狀液的脂質(zhì)氧化的影響。眾所周知，油脂中富含多種多不飽和脂肪酸，對氧和溫度特別敏感。如圖2所示，所有乳狀液的POV值在儲存期間都顯著增加，增加的速度取決于AE的濃度。單用PPH制備的乳狀液在整個貯藏過程中的POV值最高，這說明盡管限制性水解的花生蛋白比完整的花生蛋白具有更強(qiáng)的還原能力和自由基清除活性，但PPH穩(wěn)定的乳狀液仍易發(fā)生氧化。但AE加入到乳狀液中后，比單獨添加PPH植被的乳狀液更能有效地抑制脂質(zhì)氧化。此外，AE附著在如花特地的表面可以誘導(dǎo)更多的羥基，增加PPH在水相中的供氫能力，從而防止乳狀液發(fā)生氧化。如圖3所示，TBARS的結(jié)果遵循POV相似的變化趨勢。在未含有AE的乳狀液樣品中，TBARS在10 d貯藏期間呈現(xiàn)顯著增加的變化趨勢。含有AE的乳狀液，TBARS都低于未添加AE的乳狀液。隨著AE含量的增加，乳狀液的TBARS值有更大程度的降低?？梢姡珹E能夠起到抑制油脂氧化的作用?？傊珹E能夠顯著降低乳狀液初級和次級產(chǎn)物的生成。并在界面膜上的AE和PPH發(fā)生協(xié)同作用，提供了改進(jìn)的物理屏障，使其具有更高的抗氧化活性，增強(qiáng)了乳狀液在儲存期間的氧化穩(wěn)定性[11]。

2.4 PPH在乳狀液中的分布

蛋白質(zhì)水解物在界面與水相中的具體位置或分配情況被認(rèn)為是促進(jìn)乳狀液穩(wěn)定性和抑制乳狀液體系中脂質(zhì)氧化速率的重要因素。不同濃度AE對蛋白質(zhì)在乳狀液中分布的影響見表2。

表2 不同濃度AE對蛋白質(zhì)在乳狀液中分布的影響Table 2 Effect of diffent concentrations of AE on the distribution of protein in emulsion

如表2所示，對于僅用PPH制備的乳狀液，大部分PPH（約88.7%）分布在水相中，只有11.3%存在于界面層。此外，隨著AE用量的增加，乳狀液的分配系數(shù)呈現(xiàn)先增高后降低的變化趨勢。AE的含量在100 μg/mL時乳狀液分配系數(shù)最大，這是因為此時AE與PPH能夠形成協(xié)同效應(yīng)，增加乳狀液界面上PPH的含量。PPH和AE在界面上的相互作用能夠在油滴表面形成物理屏障，防止自由基的的滲入，起到穩(wěn)定乳狀液的作用。但是當(dāng)AE的含量過高時，AE與PPH以競爭的方式將PPH從界面上解吸下來，使界面上的PPH含量降低，分配系數(shù)減小。但被解析下來的PPH依然可以在水相中清除自由基、螯合金屬離子，發(fā)揮其對抗脂質(zhì)氧化的作用[12]。說明在界面和水相中具有抗氧化活性的蛋白水解物可在乳狀液儲存期間延緩脂質(zhì)氧化[13]。

3 結(jié)論

蛋白質(zhì)與多酚化合物能夠形成共價結(jié)合，并且內(nèi)部的疏水基團(tuán)和極性基團(tuán)會暴露在表面，有助于分子間的相互作用，提高乳狀液的穩(wěn)定性。還能增加PPH在界面上的吸附量，有效的降低PPH制備的乳狀液在貯藏期間的過氧化物和丙二醛的生成量。界面膜上的AE和PPH協(xié)同作用提供了改進(jìn)的物理屏障，并且在水相中具有更高的抗氧化活性，促進(jìn)乳狀液在儲存期間的氧化穩(wěn)定性。添加AE濃度為100 μg/mL時，乳狀液在儲藏期間最為穩(wěn)定，但是AE的添加量超過100 μg/mL會與PPH形成競爭吸附，影響PPH在界面上的分布，導(dǎo)致穩(wěn)定性下降。