邵璐瀅，劉四新，劉曉蘭，蔡坤，李從發(fā)，鄧健，*

（1.海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，海南?？?70228；2.海南大學(xué)理學(xué)院，海南?？?70228）

椰子（Cocos nucifera L.）是世界上最重要且生長最 廣泛的棕櫚科樹種，它主要生長于熱帶和亞熱帶環(huán)境中，是這些地區(qū)國家的重要經(jīng)濟(jì)植物[1]。椰子水是椰子的液體胚乳，被歐盟果蔬汁飲料工業(yè)協(xié)會（European Fruit Juice Association，AIJN）認(rèn)證為一種果汁[2]，主要成分是糖類、礦物質(zhì)、維生素和氨基酸等，已經(jīng)有研究證實其在藥物和健康領(lǐng)域的作用[3]：抗氧化，改善炎癥[4]等，盡管如此，目前對椰子水的加工利用還是研究較少，而且大部分成熟椰子水作為椰肉的加工副產(chǎn)物利用率低[5]，目前由于國內(nèi)的椰纖果發(fā)酵產(chǎn)業(yè)已消失，椰子水除很少量被作為“原味椰子雞”的餐飲店做湯料外、暫無有效途徑可進(jìn)行大規(guī)模利用，以致于被傾倒、遺棄既浪費資源又污染環(huán)境，是目前海南椰子產(chǎn)業(yè)中亟待解決的課題。本研究著眼于天然椰子水富含營養(yǎng)素、是微生物天然培養(yǎng)基的優(yōu)勢，結(jié)合乳酸菌的各種健康特性，研究幾株不同乳酸菌對椰子水的發(fā)酵特性，為乳酸菌發(fā)酵椰子水飲料制備提供基礎(chǔ)支持。

近幾年，國外已有學(xué)者對椰子水的加工關(guān)注于發(fā)酵椰子水飲料的研發(fā)，因為椰子水是一種非乳制品基質(zhì)，特別是對素食主義者和乳糖不耐受的消費者而言，可作為功能性培養(yǎng)飲料的新型載體引入[6]；而且，椰子水無需任何添加就是微生物的天然培養(yǎng)基；發(fā)酵果汁的開發(fā)已被證明具有相當(dāng)大的市場價值和消費者接受度[7]。Kantachote等[8]利用植物乳桿菌DW12，Lee等[9]使用嗜酸乳桿菌L10和干酪乳桿菌L26，Giri等[10]用篩選出的干酪乳桿菌L4發(fā)酵椰子水研制飲料，結(jié)果表明乳酸菌非常適合用來發(fā)酵椰子水飲料的制備，而且不同的乳酸菌對椰子水的發(fā)酵特性不同，這方面目前國內(nèi)外的研究都還不全面，無論是公認(rèn)的加利亞乳桿菌等、還是新分離出來的乳酸菌，用來制備新型發(fā)酵椰子水飲料的研究都是有一定價值的。乳酸菌是一類可以促進(jìn)宿主腸道內(nèi)的微生態(tài)平衡，對宿主健康產(chǎn)生有益作用的活性微生物，具有促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸收、緩解乳糖不耐受、降低人體血清膽固醇含量、水解腸胃脹氣因子、延長產(chǎn)品保質(zhì)期等功效[11]。

乳酸菌及其種子液可以轉(zhuǎn)化發(fā)酵底物的生化和感官特征，產(chǎn)生各種代謝物，并用微量營養(yǎng)素如礦物質(zhì)、維生素、氨基酸、益生菌、益生元和消化酶來豐富飲料[12]。近年來，乳酸菌在發(fā)酵飲料中應(yīng)用廣泛，以椰子水為基質(zhì)，相比于乳制品、谷物等，口感更加獨特。本研究中所用野生乳酸菌株為前期從自然發(fā)酵椰子水和諾麗汁中篩選分離得到，證實有良好的抑菌活性和腸道耐受性，為發(fā)酵椰子水飲料的制備提供參考意義，也為提高椰子水的附加值獻(xiàn)策。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

椰子水（NCW）：?？谑惺畚牟镜匾樱茪と∷?，4層紗布過濾，混勻，迅速分裝于潔凈礦泉水瓶，置于-21℃冰柜備用，pH5.0左右，可溶性固形物含量5.0～6.0。

乳酸菌株：發(fā)酵乳桿菌L20、面包乳桿菌32-2-2、短乳桿菌64-1、植物乳桿菌A33由海南大學(xué)食品學(xué)院應(yīng)用微生物學(xué)實驗室提供；嗜熱鏈球菌IFFI6038、德氏乳桿菌保加利亞亞種CICC6045：廣東省微生物菌種保藏中心。

大腸桿菌ATCC25922、沙門氏菌ATCC14082、金黃色葡萄球菌ATCC25923、李斯特菌ATCC19111、銅綠假單胞菌ATCC9027：海南大學(xué)食品學(xué)院應(yīng)用微生物學(xué)實驗室。

有機酸標(biāo)準(zhǔn)品：上海索萊寶生物科技有限公司；白砂糖為食品級；試驗所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（1260）：美國安捷倫公司；紫外分光光度計（Evolution 300）：美國賽默飛公司；立式雙層恒溫培養(yǎng)箱（SKY-2112B）：金壇市盛藍(lán)儀器有限制造公司；pH計（Delta320-S）：梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 接種發(fā)酵椰子水飲料工藝路線

種子液制備：從菌種保藏試管斜面上挑取一環(huán)菌體接種于MRS液體培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，活化兩代后，活化液離心取菌體，用無菌水洗滌2次～3次，制成種子液。

1.3.2 樣品的處理和保存

取發(fā)酵 0、24、48、72、96 h 時間點的椰子水發(fā)酵液50 mL，4 000 r/min低溫離心15 min，取上清液進(jìn)行檢測。樣品保存于-20℃冰箱備用。

1.3.3 生長曲線的繪制

將種子液按3%接種量接種于50 mL新鮮椰子水中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2 h測量菌株的生長量OD660 nm值，設(shè)置3組平行。以發(fā)酵時間為橫坐標(biāo)，生長量OD660 nm值為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。

1.3.4 理化指標(biāo)的測定

總酸：參照GB/T 12456-2008《食品中總酸的測定》，以乳酸計量；pH值：采用pH酸度計測定；還原糖：采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）比色法。

1.3.5 有機酸的測定

參照Sabokbar等[13]的方法稍作改進(jìn)，采用高效液相色譜儀測定樣品中的有機酸含量。將發(fā)酵液樣品解凍，4℃、8 000 r/min離心15 min。采用液相色譜儀：安捷倫1260，配有紫外檢測儀；色譜柱：安捷倫 Zorbax SB-aq（250 mm×4.6 mm，5 μm）；色譜條件：流動相：0.02 mol/L磷酸二氫鉀（pH=2.50）∶甲醇（體積比）=98 ∶2；柱溫：30 ℃；流速：0.6 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；檢測波長：210 nm；洗脫時間：20 min；洗脫方式為等度洗脫。根據(jù)保留時間定性并分別配制不同濃度的酒石酸、草酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸和延胡索酸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6 菌株抑菌活性測試

參照蔣欣容等[14]方法，稍作修改。

指示菌制備：將指示菌分別接種于普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)4 h，并用無菌生理鹽水調(diào)節(jié)菌懸液至107CFU/mL。

單層瓊脂擴(kuò)散打孔法[15]：傾注法將制備107CFU/mL的指示菌菌懸液取200 μL傾入冷卻至45℃的15 mL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（瓊脂含量1.8%），輕搖充分混勻后，水平放置待其凝固。在對平板瓊脂打孔過程中采用直徑為6 mm的無菌打孔器，用無菌鑷子取出孔中央菌層培養(yǎng)基，形成直徑6mm的圓孔，并向孔內(nèi)注入50 μL乳酸菌發(fā)酵上清液，待測試，以無菌水作為空白對照，放置37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，觀察有無抑菌圈，并測量其抑菌直徑，試驗設(shè)置3組平行。

1.3.7 感官評分

參照GB/T 31121-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)果蔬汁類及其飲料》的相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行品評，具體評價指標(biāo)見表1。

表1 感官評分細(xì)則Table 1 Sensory rating details

續(xù)表1 感官評分細(xì)則Continue table 1 Sensory rating details

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±sd）表示；采用 Origin（Version 8.6）進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌株發(fā)酵椰子水的生長曲線

不同乳酸菌的生長曲線見圖1。

圖1 不同乳酸菌的生長曲線Fig.1 Growth curves of the different lactic acid bacteria

由圖1可知，6種乳酸菌在椰子水中均呈現(xiàn)良好的生長狀況，說明椰子水營養(yǎng)成分豐富，適宜乳酸菌生長。其中，短乳桿菌64-1的生長速率顯著慢于其他乳酸菌，表明短乳桿菌64-1在椰子水中發(fā)酵性能較弱。發(fā)酵2 h～12 h，乳酸菌處于對數(shù)生長期，生長旺盛；12 h后，德氏乳桿菌保加利亞亞種CICC6045的生長速率顯著高于其他菌株，發(fā)酵乳桿菌L20、面包乳桿菌32-2-2和嗜熱鏈球菌IFFI6038的生長速率趨于穩(wěn)定；在發(fā)酵12 h～24 h，植物乳桿菌A33的發(fā)酵速率顯著慢于其他4株箘，發(fā)酵乳桿菌L20、面包乳桿菌32-2-2和嗜熱鏈球菌IFFI6038的生長速率基本相同；發(fā)酵36h后，植物乳桿菌A33和德氏乳桿菌保加利亞亞種CICC6045的生長速率顯著高于其他4株箘。

2.2 不同菌株發(fā)酵椰子水過程中總酸的變化

不同乳酸菌發(fā)酵對總酸含量的影響見圖2。

圖2 不同乳酸菌發(fā)酵對總酸含量的影響Fig.2 Effects of different lactobacillus fermentation on total acid

由圖2可知，椰子水初始總酸含量為（1.10±0.03）g/L，發(fā)酵過程中，發(fā)酵液的總酸含量一直呈增加趨勢，在發(fā)酵前期（48 h內(nèi)），這種趨勢較為明顯。不同菌種在椰子水中產(chǎn)酸能力不同，在初始總酸含量相同的情況下，在發(fā)酵過程中，0～48 h始終保持總酸含量：面包乳桿菌32-2-2＞發(fā)酵乳桿菌L20＞德氏乳桿菌保加利亞亞種CICC6045＞植物乳桿菌A33＞嗜熱鏈球菌IFFI6038＞短乳桿菌64-1；發(fā)酵48 h后，植物乳桿菌A33發(fā)酵椰子水繼續(xù)產(chǎn)酸。李俊等用乳酸菌發(fā)酵苦蕎麥苗飲料也得到相似結(jié)果[16]。

2.3 不同菌株發(fā)酵椰子水過程中pH值的變化

不同乳酸菌發(fā)酵對pH值的影響見圖3。

圖3 不同乳酸菌發(fā)酵對pH值的影響Fig.3 Effects of different lactobacillus fermentation on pH

由圖3可知，6株乳酸菌發(fā)酵椰子水的pH值變化一致，發(fā)酵0～24 h，pH值顯著下降，之后趨于平穩(wěn)，處于3.0～3.5之間，pH值：植物乳桿菌A33＜德氏乳桿菌保加利亞亞種CICC6045＜嗜熱鏈球菌IFFI6038＜面包乳桿菌32-2-2＜發(fā)酵乳桿菌L20＜短乳桿菌64-1。乳酸菌pH值是發(fā)酵特性的重要指標(biāo)，乳酸菌可以利用椰子水中的單糖產(chǎn)生酸，因此，pH值也可間接反映乳酸菌在椰子水中的生長狀況以及乳酸菌作為飲料的發(fā)酵菌種的潛質(zhì)[17]。

2.4 不同菌株發(fā)酵椰子水過程中還原糖的變化

不同乳酸菌發(fā)酵對還原糖含量的影響見圖4。

圖4 不同乳酸菌發(fā)酵對還原糖含量的影響Fig.4 Effects of different lactobacillus fermentation on reductive sugar

由圖4可知，不同乳酸菌發(fā)酵椰子水對還原糖含量的影響不同。發(fā)酵前期（0～24 h），還原糖含量顯著降低；發(fā)酵24 h～48 h，還原糖含量依然呈下降趨勢，但趨勢變化平緩；發(fā)酵48 h后，還原糖含量基本趨于穩(wěn)定。不同菌株消耗糖的能力不同，發(fā)酵48 h后，嗜熱鏈球菌IFFI6038和植物乳桿菌A33的還原糖含量約為30.511g/L，短乳桿菌64-1的還原糖含量約為25.692g/L，發(fā)酵乳桿菌L20和面包乳桿菌32-2-2的還原糖含量約為11.511 g/L，德氏乳桿菌保加利亞亞種CICC6045為0.34g/L。Lee et.al[9]用嗜酸乳桿菌L10和干酪乳桿菌發(fā)酵椰子水48 h，結(jié)果表明還原糖含量有消耗，與本試驗嗜熱鏈球菌IFFI6038和植物乳桿菌A33發(fā)酵結(jié)果相近。

2.5 不同菌株對有機酸含量的影響

有機酸不僅是構(gòu)成發(fā)酵液中風(fēng)味物質(zhì)的重要前提物質(zhì)，也是發(fā)酵程度的重要指標(biāo)，影響著發(fā)酵液的品質(zhì)[18]。發(fā)酵汁中的有機酸還可促進(jìn)消化腺的活動，有助于食物的吸收，具有開胃和促進(jìn)消化的作用[19]。

乙酸有刺激性酸味，其含量過高會使發(fā)酵飲料風(fēng)味協(xié)調(diào)性降低，不柔和，且引起飲料的苦味和口感硬[20]。酒石酸給人以些許澀感、酸味較強[21]。檸檬酸酸味清爽，口感溫和，后苦時間短；琥珀酸的味感較濃，又苦又咸，足以引起唾液的分泌，特征明顯，可增加飲料的醇厚感；蘋果酸酸度大，但味道柔和，具特殊香味，乳酸是乳酸菌發(fā)酵過程中使一部分碳水化合物代謝所生成的非揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[22]。不同菌株發(fā)酵椰子水有機酸含量見表2。

表2 發(fā)酵椰子水主要有機酸含量Table 2 Organic acids contents of fermented coconut water

有機酸是發(fā)酵汁中主要的風(fēng)味營養(yǎng)物質(zhì)，其含量高低與發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)有密切關(guān)系。研究表明發(fā)酵后，椰子水的有機酸含量有不同程度的變化，其中檸檬酸和琥珀酸的含量顯著增加；植物乳桿菌A33和德氏乳桿菌保加利亞亞種CICC6045發(fā)酵椰子水產(chǎn)生少量乙酸；發(fā)酵乳桿菌L20、面包乳桿菌32-2-2和植物乳桿菌A33發(fā)酵椰子水的乳酸含量高于未發(fā)酵椰子水和其他菌株，但不顯著。

2.6 不同菌株抑菌活性結(jié)果

不同菌株的抑菌圈結(jié)果見表3。

表3 不同乳酸菌抑制致病菌的能力Table 3 Resistance ability of different LAB on pathogenicbacteria

由表3可得，不同菌株對不同指示菌的抑制作用存在較大差別，這與蔣欣容等[14]得到的結(jié)果一致。表3結(jié)果表明，植物乳桿菌A33的抑菌譜較廣，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和李斯特菌均有抑制效果；面包乳桿菌32-2-2對大腸桿菌有顯著抑制作用，抑菌圈直徑為（15.3±0.06）mm，發(fā)酵乳桿菌L20和植物乳桿菌A33對沙門氏菌有顯著抑制作用，抑菌圈直徑分別為為（14.0±1.00）mm 和（15.1±2.15）mm；發(fā)酵乳桿菌L20、面包乳桿菌32-2-2、植物乳桿菌A33和德氏乳桿菌保加利亞亞種CICC6045對金黃色葡萄球菌有較強抑制作用。

2.7 乳酸菌發(fā)酵椰子水pH值和乳酸含量與抑菌活性的相關(guān)性分析

發(fā)酵椰子水pH值和乳酸含量與抑菌活性的相關(guān)性分析見表4。

如表4所示，乳酸菌發(fā)酵椰子水對指示菌的抑菌效果與酸度（pH值和乳酸含量）相關(guān)，乳酸菌發(fā)酵椰子水對大腸桿菌的抑制率與pH值呈極顯著負(fù)相關(guān)；對金黃色葡萄球菌的抑制率與pH值呈顯著負(fù)相關(guān)，與乳酸含量呈顯著正相關(guān)；對沙門氏菌的抑制率與乳酸含量呈極顯著正相關(guān)。試驗結(jié)果與戴梓茹等[23]研究酸楊桃發(fā)酵液pH值和有機酸與抑菌活性呈顯著相關(guān)結(jié)果類似。

表4 發(fā)酵椰子水pH值和乳酸含量與抑菌活性的相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis between pH value，lactic acid content and antibacterial activity of fermented coconut water

2.8 不同菌株對發(fā)酵椰子水感官評價的影響

因為椰子水是微生物的天然培養(yǎng)基，所以易受污染，目前超高溫（ultra high temperature，UHT）工藝和罐裝是世界市場上廣泛用于椰子水的熱處理方式[24]，高溫滅菌后的椰子水會產(chǎn)生蒸煮味或紅糖味并且椰子水的顏色由無色透明轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色至黃色，這是因為糖在高溫加熱的過程中會發(fā)生美拉德反應(yīng)或焦糖化反應(yīng)，目前市場上多數(shù)椰子水產(chǎn)品都存在這一問題。而乳酸菌發(fā)酵后產(chǎn)生的獨特的發(fā)酵香氣，可以減少椰子水原本的蒸煮味給部分消費者帶來的不適感。

不同乳酸菌株發(fā)酵椰子水的風(fēng)味不同，試驗邀請20位專業(yè)人士從氣味、色澤、滋味、組織狀態(tài)以及個人喜好度這5個角度對發(fā)酵椰子水飲料進(jìn)行感官評分，結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同乳酸菌對椰子水感官品質(zhì)的影響Fig.5 Effects of different lactic acid bacteria on sensory quality of coconut water

從總分來看，植物乳桿菌A33、德氏乳桿菌保加利亞亞種CICC6045和嗜熱鏈球菌IFFI6038顯著高于其他菌株；可能是因為發(fā)酵乳桿菌L20和面包乳桿菌32-2-2澀感較重，且酸味刺激喉嚨，讓人不悅；短乳桿菌64-1發(fā)酵能力較差。

3 結(jié)論

研制發(fā)酵椰子水飲料的一大重點就是選擇合適的發(fā)酵菌株，試驗結(jié)果表明椰子水經(jīng)不同乳酸菌發(fā)酵后成分和抑菌活性以及感官均發(fā)生顯著變化。發(fā)酵48 h后各項指標(biāo)趨于穩(wěn)定：植物乳桿菌A33和德氏乳桿菌保加利亞亞種CICC6045在椰子水中生長活菌數(shù)最多；面包乳桿菌32-2-2產(chǎn)酸最多，達(dá)10.85 g/L；植物乳桿菌A33和德氏乳桿菌保加利亞亞種CICC6045 pH值降到最低為3.1；德氏乳桿菌保加利亞亞種CICC6045還原糖幾乎消耗完全；有機酸含量均顯著增加，其中檸檬酸增加最為顯著；植物乳桿菌A33的抑菌譜較廣；植物乳桿菌A33、嗜熱鏈球菌IFFI6038和德氏乳桿菌保加利亞亞種CICC6045發(fā)酵椰子水感官評分較高。本研究為解決椰子水作為加工副產(chǎn)物被浪費的問題獻(xiàn)策，也為研制風(fēng)味良好又有營養(yǎng)價值的發(fā)酵椰子水飲料提供理論支持。