（江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇淮安223003）

黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）為茄科枸杞屬多年生灌木野生植物，富含多種維生素、礦物質(zhì)和花色苷，具有高度藥食兩用價(jià)值[1-2]。其中花色苷為花青素與不同單糖以糖苷鍵相連形成的化合物，有研究發(fā)現(xiàn)，其具有抗氧化、抗動(dòng)脈粥樣硬化、調(diào)節(jié)血脂及增強(qiáng)機(jī)體免疫等功效[3-4]，因而前人在其分離提取研究方面作出大量工作。由于光照、溫度、pH值等理化因素均會(huì)影響其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，鄭覃等采用超聲提取黑果枸杞花色苷，極大縮短提取時(shí)間，增大提取效率[5]；同時(shí)，趙文娟等先后利用不同型號(hào)樹脂對(duì)提取物進(jìn)一步純化，使得產(chǎn)物總花色苷含量明顯提高[6-7]，但一般樹脂精制取得的產(chǎn)物仍含有較多糖類、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)[8]，因此對(duì)其提取物的純化再研究，仍具有重大意義。

凝膠柱層析作為經(jīng)典的分離純化技術(shù)，具有選擇性高、干擾因素少、可重復(fù)循環(huán)利用等特點(diǎn)，被廣泛用于化工、制藥、生物、環(huán)境等領(lǐng)域[9-11]。本研究利用Sephadex LH-20葡聚糖凝膠分離特性，探討富集黑果枸杞總花色苷的最佳工藝條件，從而為黑果枸杞花色苷的后續(xù)開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑果枸杞干果：寧夏杞愛原生黑果枸杞股份有限公司；AB-8大孔樹脂：天津市西金納環(huán)保材料科技有限公司；Sephadex LH-20填料：美國(guó)GE公司；無水乙醇、甲醇、氯化鉀、醋酸鈉、醋酸、鹽酸、磷酸、硫酸亞鐵、雙氧水、水楊酸：分析純，國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司；錦葵色素-3-葡萄糖苷：天津一方科技有限公司；DPPH試劑：上?；晒I(yè)發(fā)展有限公司；試驗(yàn)用水為二次純化水。

1.2 儀器與設(shè)備

AE224型電子天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；雷磁PHS-3C型pH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；XO-SM 200型超聲微波協(xié)同反應(yīng)器：南京先歐儀器制造有限公司；TU-1900型紫外分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；FD-1C-80型冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康試驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 總花色苷粗提物制備

準(zhǔn)確稱取2.0 g黑果枸杞干粉置于圓底燒瓶?jī)?nèi)，加入50 mL，1%鹽酸酸化的80%乙醇溶液后，避光于50℃超聲提?。ǔ曨l率：40 KHz）1 h，離心（轉(zhuǎn)速：4 000 r/min）收集上清液后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)乙醇，冷凍干燥，即得粗提物[5]。

1.3.2 樹脂純化物制備

依照文獻(xiàn)所述樹脂純化條件[7]，采用AB-8大孔樹脂純化提取物中花色苷，所得產(chǎn)物即樹脂純化物。

1.3.3 凝膠柱預(yù)處理

葡聚糖凝膠濕法填裝至層析柱（規(guī)格：15 mm×50 cm）后，采用2倍～3倍柱體積的無水乙醇平衡。每次上樣前，經(jīng)無水乙醇平衡后，進(jìn)行上樣吸附與洗脫[11]。

1.3.4 總花色苷含量測(cè)定

樣品中總花色苷含量以錦葵色素-3-葡萄糖苷表示，采用pH示差法測(cè)定，具體如下：準(zhǔn)確稱取一定量粗提物溶于酸性乙醇后定容于100 mL容量瓶，準(zhǔn)確移取一定體積分別使用pH 1.0和pH 4.5的緩沖溶液稀釋10倍后，搖勻置于恒溫水浴鍋中30 min，分別測(cè)得在波長(zhǎng)530 nm和700 nm處吸光度，另作空白試驗(yàn)，按照下式計(jì)算樣品中總花色苷含量，平行測(cè)定6次[12]。

式中：W為樣品總花色苷含量，mg/g；M為錦葵色素-3-葡萄糖苷摩爾質(zhì)量，493 200 mg/mol；DF稀釋因子；V為提取液體積，mL；ε為摩爾吸光系數(shù)，29 600 L/（mol·cm）；l為光程寬度，cm；m 為粗提物質(zhì)量，g。

1.3.5 不同吸附條件影響

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，分別考察上樣液濃度、pH值和上樣流速對(duì)總花色苷吸附率的影響，具體如下：1）以50 mL無水乙醇為溶劑，將粗提物配制成pH值為3.0，濃度分別為 10、20、30、40、50 mg/L 的上樣液，以1.0 mL/min流速上樣；2）將粗提物配制成濃度為30 mg/L，pH 值分別為 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 的上樣液，以1.0 mL/min流速上樣；3）將粗提物配制成總花色苷濃度為30 mg/L、pH值為3.0的上樣液，分別以0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL/min流速上樣，凝膠對(duì)粗提物中總花色苷的吸附率Q，照下式計(jì)算：

式中：m0為提取物總花色苷質(zhì)量，mg；me為吸附后流出液中總花色苷質(zhì)量，mg。

1.3.6 不同洗脫條件影響

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，考察上樣結(jié)束后，洗脫液濃度、pH值和洗脫流速對(duì)產(chǎn)物中總花色苷解吸率影響，具體如下：1）分別以體積 150 mL，50%、60%、70%、80%、90%的pH值為3.0乙醇溶液為洗脫液，在1.0 mL/min流速洗脫；2） 分別以 pH 值為 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 的80%乙醇溶液為洗脫液，在1.0 mL/min流速洗脫；3）以pH值為3.0的80%乙醇溶液為洗脫液，分別在0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL/min 流速下洗脫，每 5 mL 洗脫液為1管，測(cè)定洗脫液中總花色苷的濃度，并照下式計(jì)算解吸率。

式中：D為洗脫產(chǎn)物中總花色苷的解吸率，%；m0為提取液總花色苷質(zhì)量，mg；md為洗脫液總花色苷質(zhì)量，mg；me為吸附后流出液中總花色苷質(zhì)量，mg。

1.3.7 動(dòng)態(tài)吸附條件考察

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用三因素三水平的正交試驗(yàn)，以凝膠對(duì)樣品總花色苷的吸附率為衡量指標(biāo)，考察上樣液濃度、上樣液pH值和上樣流速對(duì)總花色苷吸附效果的影響，確定最佳吸附條件，具體因素水平見表1所示。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Table of the factorial experiment

1.3.8 動(dòng)態(tài)洗脫條件考察

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用三因素三水平的正交試驗(yàn)，以產(chǎn)物中總花色苷解吸率為衡量指標(biāo)，釆用不同濃度的乙醇為洗脫液，考察洗脫液濃度（A）、洗脫液pH值（B）和洗脫流速（C）對(duì)總花色苷洗脫效果影響，確定最佳洗脫條件，具體因素水平見表2所示。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表Table 2 Table of the factorial experiment

1.3.9 抗氧化性研究

1.3.9.1 DPPH自由基清除率檢測(cè)

準(zhǔn)確移取2 mL樣品溶液至試管內(nèi)，另加入2 mL DPPH乙醇溶液（0.2 mol/L)，搖勻后，避光放置30 min，以無水乙醇作空白對(duì)照，測(cè)得517 nm波長(zhǎng)處吸光度，平行測(cè)定3次，照下式測(cè)得DPPH自由基清除率[13]。

式中：w為DPPH自由基清除率，%；A1為樣品與DPPH自由基混合液吸光度；A2為樣品與無水乙醇混合液吸光度；A0為DPPH自由基與無水乙醇混合液吸光度。

1.3.9.2 羥自由基清除率檢測(cè)

準(zhǔn)確移取2 mL樣品溶液至試管內(nèi)，另加入2 mL硫酸亞鐵（3 mmol/L)和2 mL水楊酸-乙醇溶液（3 mmol/L)搖勻，最后加入2 mL雙氧水（5 mmol/L)混合均勻后，于37℃水浴避光放置30 min，以純化水作空白對(duì)照，測(cè)得510 nm波長(zhǎng)處吸光度，平行測(cè)定3次，照下式測(cè)得羥自由基清除率[13]。

式中：M為羥自由基清除率，%；A0為純化水+硫酸亞鐵+水楊酸-乙醇+雙氧水溶液的吸光度；A1為樣品+硫酸亞鐵+水楊酸-乙醇+雙氧水溶液的吸光度；A2為樣品+硫酸亞鐵+水楊酸-乙醇+純化水的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 上樣液濃度對(duì)凝膠吸附率影響

若上樣液濃度過高，易使得凝膠吸附達(dá)到飽和，導(dǎo)致花色苷過早泄漏，造成吸附率下降。而上樣液濃度過低，分離純化耗時(shí)過長(zhǎng)，影響試驗(yàn)效率，不同上樣液濃度對(duì)吸附率的影響，見圖1。

圖1 上樣液濃度對(duì)吸附率影響Fig.1 The influence of sample concentration on adsorption rate of gel column

從圖1可知，葡聚糖凝膠對(duì)花色苷的吸附率隨濃度的增大先升高后降低，當(dāng)上樣液濃度為30 mg/L時(shí)，吸附率達(dá)到最大值為88.7%，因此本研究選擇25、30、35 mg/L上樣液濃度作為正交試驗(yàn)因素考察水平。

2.1.2 上樣液流速對(duì)凝膠吸附率影響

在動(dòng)態(tài)吸附過程中，上樣流速過快，會(huì)使得目標(biāo)分離物與凝膠接觸不充分，而過早泄漏，但流速過慢，吸附工藝耗時(shí)過長(zhǎng)，且對(duì)后續(xù)凝膠再生造成困難，不同上樣流速對(duì)吸附率的影響，見圖2。

圖2 上樣液流速對(duì)吸附率影響Fig.2 The influence of sample solution flow rate on adsorption rate of gel column

從圖2可知，隨著上樣流速增大，吸附率不斷下降，因此綜合考慮吸附效率與效果，本研究選擇0.5、1.0、2.0 mL/min上樣流速作為正交試驗(yàn)因素考察水平。

2.1.3 上樣液pH值對(duì)總花色苷吸附率影響

由于花色苷在較低pH值環(huán)境下易形成黃烊鹽，而在較高pH值條件下又易電離質(zhì)子，均會(huì)減少在凝膠中吸附[14]，不同上樣液pH值對(duì)吸附率的影響，見圖3。

圖3 上樣液pH值對(duì)吸附率影響Fig.3 The influence of sample solution pH value on adsorption rate of gel column

從圖3可知，隨著上樣液pH值的增大，凝膠對(duì)總花色苷的吸附率先升高后降低，當(dāng)pH值為3.0時(shí)達(dá)到最大值，因此本研究選擇上樣液pH值3.0、3.5、4.0作為正交試驗(yàn)因素考察水平。

2.1.4 洗脫液濃度對(duì)總花色苷解吸率影響

吸附在凝膠上的花色苷回收，依賴洗脫液洗脫，不同濃度乙醇對(duì)總花色苷的洗脫效果，見圖4。

圖4 洗脫液濃度對(duì)花色苷解吸率影響Fig.4 The influence of elution concentration on recovery

從圖4可知，隨著洗脫液濃度的增大，解吸率逐漸增大，至80%開始降低。這可能因?yàn)椴捎幂^高濃度乙醇，有利于爭(zhēng)奪凝膠中活性位點(diǎn)，但濃度過高，會(huì)降低對(duì)花色苷部分組分的洗脫能力[15]，綜合考慮本研究選擇75%、80%、85%乙醇濃度作為正交試驗(yàn)因素考察水平。

2.1.5 洗脫液流速對(duì)總花色苷解吸率影響

不同洗脫流速對(duì)花色苷的解吸率影響，見圖5。

圖5 洗脫液流速對(duì)花色苷解吸率影響Fig.5 The influence of elution flow rate on recovery

從圖5可知，隨著洗脫流速的增大，解吸率逐漸降低，這源于洗脫液不能充分接觸凝膠，即直接流出，且洗脫液用量也會(huì)增大，而流速過低，又延長(zhǎng)洗脫過程，因此本研究選擇1.0、1.5、2.0 mL/min洗脫流速作為正交試驗(yàn)因素考察水平。

2.1.6 洗脫液pH值對(duì)總花色苷解吸率影響

由于洗脫液pH值影響花色苷的洗脫效果[15]，因而分別考察不同洗脫液pH值對(duì)花色苷解吸率的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 洗脫液pH值對(duì)花色苷解吸率影響Fig.6 The influence of elution pH value on recovery

從圖6可知，隨著洗脫液pH值的增大，花色苷的解吸率緩慢升高，至pH值為3.0時(shí)開始急劇下降，因此本研究選擇洗脫液pH值2.5、3.0、3.5作為正交試驗(yàn)因素考察水平。

2.2 動(dòng)態(tài)吸附工藝確定

根據(jù)上述單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，上樣液濃度、pH值和流速對(duì)凝膠吸附花色苷的效果影響較大，考慮單因素試驗(yàn)結(jié)果并非最優(yōu)值，因此采用以三者為變量的正交試驗(yàn)，確定最佳動(dòng)態(tài)吸附條件，結(jié)果見表3，試驗(yàn)結(jié)果方差分析見表4。

從表3與表4結(jié)果可知，各因素對(duì)凝膠吸附粗提物中總花色苷的影響順序?yàn)锳＞C＞B，其中上樣液濃度對(duì)吸附率影響極其顯著（P＜0.01），上樣流速對(duì)吸附率影響顯著（P＜0.05），通過極差分析可知，最佳動(dòng)態(tài)吸附工藝條件為A1B2C2，即25 mg/L的pH值為3.5樣品溶液，以1.0 mL/min流速上樣至Sephadex LH-20葡聚糖凝膠柱中，有利于花色苷以分子形式較好吸附在凝膠篩孔內(nèi)。

表3 吸附工藝正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of the orthogonal-test method of adsorption process

表4 吸附工藝結(jié)果方差分析Table 4 Analysis of variance for the adsorption process factors

2.3 動(dòng)態(tài)洗脫工藝確定

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，洗脫液濃度、pH值和洗脫流速對(duì)凝膠中花色苷的洗脫效果影響較大，因此采用正交試驗(yàn)，確定最佳動(dòng)態(tài)洗脫工藝，結(jié)果見表5，相應(yīng)結(jié)果方差分析見表6。

從表5與表6結(jié)果可知，各因素對(duì)花色苷的解吸率影響影響順序?yàn)镃'＞A'＞B'，其中洗脫流速對(duì)解吸率影響極其顯著（P＜0.01），通過極差分析得到，最佳洗脫工藝條件為A'3B'3C'1，因此選擇采用85%的pH值為3.5乙醇溶液，以1.0 mL/min流速洗脫被凝膠吸附的總花色苷。

表5 洗脫工藝正交試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of the orthogonal-test method of elution process

表6 洗脫工藝結(jié)果方差分析Table 6 Analysis of variance for the elution process factors

2.4 最佳分離純化條件驗(yàn)證和結(jié)果比較

根據(jù)上述單因素與正交試驗(yàn)優(yōu)選得到的Sephadex LH-20葡聚糖凝膠富集純化黑色枸杞花色苷工藝條件為：質(zhì)量濃度為25 mg/mL的pH值為3.5樣品溶液以1.0 mL/min流速上樣至凝膠柱后，采用pH值3.5的85%乙醇溶液，以1.0 mL/min流速洗脫，平行試驗(yàn)6次，測(cè)得對(duì)花色苷的吸附率與洗脫率分別為90.9%和85.3%，另外采用凝膠富集、樹脂純化及超聲提取得到的產(chǎn)物中總花色苷的含量比較，見表7，凝膠柱層析富集后產(chǎn)物的總花色苷含量高于樹脂純化物。

表7 不同產(chǎn)物中總花色苷的含量（n=6）Table 7 The results of anthocyanins contents of different product（n=6）

2.5 總花色苷抗氧化性

2.5.1 DPPH自由基清除能力

不同產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除率結(jié)果見圖7。

圖7 不同產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除率Fig.7 The clearance rate of DPPH free radicals for different product

過量的DPPH自由基容易造成細(xì)胞組織損傷和生物大分子結(jié)構(gòu)的變化，總花色苷可提供質(zhì)子氫，還原自由基，形成穩(wěn)定化合物。從圖7可見，黑果枸杞總花色苷濃度在0.01mg/mL～0.05 mg/mL時(shí)，隨著其質(zhì)量濃度增加，對(duì)DPPH自由基清除率不斷增強(qiáng)，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL時(shí)，提取物、樹脂和凝膠純化黑果枸杞總花色苷的清除率分別為77.4%、82.8%、85.2%，表明提取物、樹脂與凝膠純化后產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除能力依次增大，且DPPH自由基清除率與總花色苷濃度呈正相關(guān)，與相關(guān)文獻(xiàn)所述一致[16-17]。

2.5.2 羥自由基清除能力

不同產(chǎn)物對(duì)羥自由基的清除率結(jié)果見圖8。

圖8 不同產(chǎn)物對(duì)羥自由基的清除率Fig.8 The clearance rate of hydroxyl radical for different product

向雙氧水反應(yīng)體系中加入總花色苷后，有色化合物生成量減少，可利用吸光度變化反映總花色苷抗氧化能力。從圖8可知，黑果枸杞總花色苷濃度在0.01 mg/mL～0.05 mg/mL時(shí)，隨著其質(zhì)量濃度增加，對(duì)羥自由基清除率不斷增強(qiáng)，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL時(shí)，提取物、樹脂和凝膠后產(chǎn)物對(duì)羥自由基的清除率分別為88.4%、91.5%、94.2%，從而可知3種產(chǎn)物對(duì)羥自由基的清除能力依次為凝膠純化＞樹脂純化＞提取物。

3 結(jié)論

本研究采用Sephadex LH-20葡聚糖凝膠柱富集黑果枸杞粗提物中總花色苷，利用單因素與正交試驗(yàn)優(yōu)化得到的最佳富集純化工藝條件：質(zhì)量濃度為25 mg/L的pH值為3.5樣品溶液，以1.0 mL/min流速上樣至凝膠柱后，采用85%的pH值為3.5乙醇溶液，以1.0 mL/min流速洗脫，對(duì)總花色苷的吸附率和解吸率分別為90.9%、85.3%，得到的富集產(chǎn)物含量明顯高于樹脂純化物。該工藝操作簡(jiǎn)便、富集純化效率較高，且產(chǎn)物對(duì)羥自由基和DPPH自由基清除作用較好，可為黑果枸杞花色苷的后續(xù)開發(fā)利用提供參考。