李小玲,劉 榮,華智銳
(商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院,陜西 商洛 726000)
干旱是常見(jiàn)的非生物脅迫因子之一,嚴(yán)重影響植物的產(chǎn)量和質(zhì)量。根據(jù)相關(guān)報(bào)道,每年因干旱造成的全球農(nóng)作物產(chǎn)量損失率達(dá)50%以上,而全球氣候變暖又加劇了干旱對(duì)農(nóng)作物的破壞。植物的抗旱性除受多基因控制外還受到其它環(huán)境因子的影響,其機(jī)理較為復(fù)雜,目前,還缺乏有效的提高作物抗旱性的方法。因此,干旱對(duì)農(nóng)作物造成的損失在所有非生物脅迫中占首位。
黃芩(ScutellariabaicalensisGeorigi)屬于唇形科黃芩屬多年生草本植物,以根入藥,具有清熱降火、涼血安胎、解毒等多種功效,是我國(guó)常用大宗中藥材之一[1]。近年來(lái),中藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展帶動(dòng)了黃芩的規(guī)范化栽培及市場(chǎng)需求量。但由于全球氣候變暖,高溫少雨、大氣水分及土壤水分缺乏使土地失墑問(wèn)題愈發(fā)突出,導(dǎo)致黃芩種子吸水能力顯著下降,嚴(yán)重影響了黃芩的產(chǎn)量及質(zhì)量。如何提高干旱條件下植物的產(chǎn)量,是科研工作者長(zhǎng)期以來(lái)急需解決的問(wèn)題。研究發(fā)現(xiàn),在干旱脅迫下植物會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧和自由基,破壞植物體內(nèi)的生物大分子,引起細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化作用及導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損傷。因此,尋找一種化控措施來(lái)提高黃芩在干旱地區(qū)生產(chǎn)中的抗旱性至關(guān)重要,對(duì)于擴(kuò)大黃芩人工栽培具有重要的意義。
殼聚糖(CTS)又稱為脫乙酰甲殼素,學(xué)名聚氨基葡萄糖,它是由甲殼素經(jīng)脫乙?;饔玫玫降闹辨湢罡叻肿踊衔颷2]。甲殼素是許多低等動(dòng)植物(蝦、蟹、昆蟲(chóng)、真菌、藻類等)的重要組成成分,天然無(wú)害、環(huán)保、可生物降解,不僅具有良好的生物相容性[3],而且具有良好的成膜性、附著性和吸濕性[4],可以被廣泛應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、生物等領(lǐng)域。研究表明,抽穗期玉米花絲和穗軸經(jīng)CTS處理能有效提高種子的貯藏蛋白和醇溶蛋白含量,可作為一種新型蛋白質(zhì)生物調(diào)節(jié)劑應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中[5]。CTS及其寡糖都屬于天然產(chǎn)物,對(duì)植物無(wú)任何毒副作用。眾多研究表明,CTS可作為一種新型的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑,促進(jìn)植物生長(zhǎng),增強(qiáng)植物的抗逆能力[6-9],在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方面具有廣闊的應(yīng)用前景。
近年來(lái),前人針對(duì)黃芩的種質(zhì)資源、化學(xué)成分、質(zhì)量以及藥理作用等方面開(kāi)展了大量研究[10],但目前有關(guān)殼聚糖對(duì)黃芩種子萌發(fā)及幼苗抗旱性的影響研究尚未見(jiàn)報(bào)道。前人已開(kāi)展殼聚糖對(duì)玉米[9]、小麥[11]、蘋(píng)果[12]等植物抗旱性的影響研究,而在藥用植物中的相關(guān)研究報(bào)道較少。因此,本試驗(yàn)以商洛黃芩為材料,研究了外源殼聚糖對(duì)黃芩種子萌發(fā)及干旱脅迫下的幼苗生理特征的影響,旨在探索CTS對(duì)黃芩種子萌發(fā)及幼苗抗旱性的影響,為將CTS作為抗旱劑應(yīng)用到黃芩抗旱栽培中提供理論依據(jù)。
試驗(yàn)所用黃芩種子及幼苗于2018年4月中旬購(gòu)自洛南藥材種植基地,為一年生黃芩幼苗;CTS購(gòu)自陜西博諾生物技術(shù)有限公司,含量≥99.5%,分析純?cè)噭〢R級(jí)。
1.2.1 材料預(yù)處理 選取成熟飽滿、大小一致的黃芩種子,用1.0%的次氯酸鈉消毒5 min,然后用蒸餾水沖洗并自然晾干,備用;將所購(gòu)買(mǎi)的黃芩幼苗移栽至直徑約15 cm的花盆中,進(jìn)行預(yù)培養(yǎng),在戶外溫度下培養(yǎng)1個(gè)月左右,在此期間,定時(shí)澆水和松土以保持土壤濕潤(rùn)。
1.2.2 黃芩種子的處理 先用少量2% HAC溶解CTS,再加蒸餾水配制成不同濃度(體積分?jǐn)?shù))的CTS溶液。本試驗(yàn)設(shè)1個(gè)對(duì)照和5個(gè)處理: CK,蒸餾水對(duì)照;處理T1,0.05% CTS; T2,0.10% CTS; T3,0.15% CTS; T4,0.20% CTS; T5.0.25% CTS。
將預(yù)處理的黃芩種子分別用不同濃度的CTS溶液浸種24 h,然后取出晾干;以等量蒸餾水浸種為對(duì)照(CK)。采用紙上發(fā)芽床法,在洗凈、烘干的培養(yǎng)皿(直徑9 cm)中鋪單層濾紙,并加入蒸餾水,整齊地放入50粒黃芩種子,置入人工氣候箱中培養(yǎng),培養(yǎng)溫度設(shè)為25 ℃/16 ℃(晝/夜),相對(duì)濕度為75%,光照強(qiáng)度為1400 lx。每個(gè)處理重復(fù)3次,每天記錄發(fā)芽的種子數(shù);定期補(bǔ)充蒸餾水,在第6天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢(shì),在第10天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)。
1.2.3 黃芩幼苗的處理 試驗(yàn)設(shè)2個(gè)對(duì)照和5個(gè)處理: CK1,蒸餾水對(duì)照; CK2,20% PEG6000,藥劑對(duì)照;處理T1,0.05% CTS+20% PEG6000; T2,0.10% CTS+20% PEG6000; T3,0.15% CTS+20% PEG6000; T4,0.20% CTS+20% PEG6000; T5,0.25% CTS+20% PEG6000。
將CK2、T1~T5中的黃芩幼苗用20% PEG6000[13,14]模擬干旱處理24 h后,用噴霧器將不同濃度的CTS噴于相應(yīng)處理的黃芩幼苗葉片正反面,每天噴灑1次,共處理5 d,其中CK1、CK2施加蒸餾水。在間隔4 d后選取長(zhǎng)勢(shì)良好的植株,測(cè)定黃芩幼苗葉片的葉綠素含量、保護(hù)酶(POD、SOD、CAT)活性、丙二醛(MDA)含量、脯氨酸含量和可溶性糖含量等生理指標(biāo),以篩選適宜的CTS濃度。
1.2.4 生理指標(biāo)的測(cè)定 發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)的統(tǒng)計(jì)參照《國(guó)際種子檢驗(yàn)規(guī)程》[15];葉綠素含量的測(cè)定參照張志良等[16]的分光光度法;SOD活性的測(cè)定參照李合生等[17]的氮藍(lán)四唑(NBT)光還原法;POD活性的測(cè)定參照李合生等[17]的愈創(chuàng)木酚法;CAT活性的測(cè)定參照李合生等[17]的紫外分光光度法;MDA含量的測(cè)定參照張志良等[16]的硫代巴比妥酸法;脯氨酸含量的測(cè)定參照李合生等[17]的茚三酮法;可溶性糖含量的測(cè)定參照李合生等[17]的苯酚法。
所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)為3次重復(fù)測(cè)定值的平均值,用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
由圖1可以看出:不同濃度的殼聚糖溶液浸種處理24 h后,黃芩種子的發(fā)芽勢(shì)與對(duì)照組CK相比差異顯著(P<0.05),并且在一定范圍內(nèi)出現(xiàn)濃度效應(yīng),即隨著濃度的增加,發(fā)芽勢(shì)也逐漸增加,當(dāng)殼聚糖濃度增加至0.15%時(shí),發(fā)芽勢(shì)達(dá)到最大,且比對(duì)照組高出22.6個(gè)百分點(diǎn);之后隨著殼聚糖濃度上升,其對(duì)黃芩種子萌發(fā)的促進(jìn)作用逐漸下降。可見(jiàn),適宜濃度的殼聚糖溶液能顯著地提高黃芩種子的發(fā)芽勢(shì)。
標(biāo)有不同字母的處理間在0.05水平下差異顯著。下同。圖1 不同濃度殼聚糖對(duì)黃芩種子發(fā)芽勢(shì)的影響
由圖2可見(jiàn):經(jīng)不同濃度的殼聚糖溶液浸種處理24 h后,黃芩種子的發(fā)芽率與對(duì)照組CK相比差異顯著(P<0.05),且在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)濃度效應(yīng),即隨著濃度的增加,發(fā)芽率逐漸增加;當(dāng)殼聚糖溶液濃度增加至0.15%時(shí),發(fā)芽率達(dá)到最大,且比對(duì)照組高出24.1個(gè)百分點(diǎn);之后隨著殼聚糖濃度的上升,其對(duì)黃芩種子發(fā)芽的促進(jìn)作用逐漸下降,但仍高于對(duì)照組CK的。可見(jiàn),適宜濃度的殼聚糖溶液能顯著地提高黃芩種子的發(fā)芽率。
由圖3可以看出:用不同濃度的殼聚糖溶液浸種處理黃芩種子24 h后,發(fā)芽指數(shù)呈上升的趨勢(shì),與對(duì)照組CK差異顯著(P<0.05),且在一定濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)遞增遞減趨勢(shì);當(dāng)殼聚糖溶液濃度上升至0.15%時(shí),發(fā)芽指數(shù)達(dá)到最高峰,且比對(duì)照組CK高出61.3%;之后隨著殼聚糖濃度的上升,其對(duì)黃芩種子發(fā)芽的促進(jìn)作用逐漸下降,但仍高于對(duì)照組CK??梢?jiàn),適宜濃度的殼聚糖溶液能顯著提高黃芩種子的發(fā)芽指數(shù)。
圖2 不同濃度殼聚糖對(duì)黃芩種子發(fā)芽率的影響
圖3 不同濃度殼聚糖對(duì)黃芩種子發(fā)芽指數(shù)的影響
從圖4中可以看出:對(duì)照組CK2與CK1相比,黃芩幼苗葉片葉綠素含量明顯下降18.8%,說(shuō)明干旱脅迫顯然抑制了黃芩幼苗葉片中的葉綠素含量;在噴施不同濃度的殼聚糖溶液后,葉綠素含量趨于上升,與對(duì)照組CK1、CK2相比,差異顯著,且在一定范圍內(nèi)存在濃度效應(yīng);當(dāng)殼聚糖濃度為0.15%時(shí),黃芩幼苗葉片中葉綠素含量最高,為2.75 mg/g,且比對(duì)照組CK1、CK2分別高出78.6%和120.0%,且差異顯著(P<0.05);之后隨著殼聚糖濃度的上升,其對(duì)黃芩幼苗葉綠素合成的促進(jìn)作用逐漸下降,但仍高于對(duì)照組。結(jié)果表明,噴施0.15%的殼聚糖對(duì)促進(jìn)光合色素含量的升高有顯著作用,且能有效緩解干旱脅迫對(duì)黃芩幼苗光合色素的抑制效應(yīng)。
由圖5可知:與CK1相比,對(duì)照組CK2的黃芩幼苗SOD活性明顯上升,說(shuō)明干旱脅迫可促進(jìn)黃芩植株體內(nèi)SOD活性的增加;當(dāng)噴灑殼聚糖溶液后,黃芩幼苗的SOD活性也不斷增強(qiáng),且在一定濃度范圍內(nèi)存在濃度效應(yīng),當(dāng)殼聚糖溶液濃度為0.15%時(shí),SOD活性最大,為158.69 U/(g·min),且比對(duì)照組CK1、CK2分別高出40.7%和19.8%,差異達(dá)到了顯著水平(P<0.05);之后隨著殼聚糖濃度的上升,其對(duì)SOD活性的促進(jìn)作用逐漸下降,但仍高于對(duì)照組。結(jié)果表明,噴施0.15%的殼聚糖溶液可明顯提高黃芩幼苗中SOD活性,且有效緩解干旱脅迫對(duì)黃芩幼苗的傷害。
圖4 不同濃度殼聚糖對(duì)干旱脅迫下黃芩幼苗葉片葉綠素含量的影響
圖5 不同濃度殼聚糖對(duì)干旱脅迫下黃芩幼苗SOD活性的影響
由圖6可以看出:CK2與CK1相比,黃芩幼苗POD活性顯著上升25.1%;當(dāng)殼聚糖濃度達(dá)到0.15%時(shí),黃芩幼苗POD活性達(dá)到最高峰,為23.58 U/(g·min),且比對(duì)照組CK1、CK2分別高出86.0%、48.7%,存在顯著性差異(P<0.05);當(dāng)殼聚糖濃度大于0.15%時(shí),黃芩幼苗POD活性逐漸下降,但仍高于對(duì)照組。結(jié)果表明,適宜濃度的殼聚糖處理能提高黃芩幼苗的POD活性,增強(qiáng)其在干旱脅迫下的代謝強(qiáng)度,且有效地緩解干旱脅迫對(duì)黃芩幼苗的傷害。
由圖7可知:CK2與CK1相比,CAT活性顯著上升11.5%,表明逆境脅迫下黃芩植株體內(nèi)保護(hù)酶活性明顯上升;當(dāng)噴灑殼聚糖溶液后,CAT活性在一定范圍內(nèi)存在遞增遞減趨勢(shì);當(dāng)殼聚糖溶液濃度為0.15%時(shí),CAT活性最高,為4.97 U/(g·min),與對(duì)照組CK1、CK2相比分別高出42.8%、28.1%,差異達(dá)顯著水平(P<0.05);之后隨著殼聚糖濃度的上升,CAT活性顯著減弱,但仍高于對(duì)照組。由此表明,噴施0.15%的殼聚糖溶液可明顯提高黃芩幼苗中CAT活性,且有效緩解干旱脅迫對(duì)黃芩幼苗的傷害。
圖6 不同濃度殼聚糖對(duì)干旱脅迫下黃芩幼苗POD活性的影響
圖7 不同濃度殼聚糖對(duì)干旱脅迫下黃芩幼苗CAT活性的影響
由圖8可知:CK2與CK1相比,黃芩幼苗葉片MDA含量顯著增加,表明干旱脅迫導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化作用增強(qiáng);當(dāng)噴灑殼聚糖溶液后,MDA含量呈現(xiàn)先減后增的趨勢(shì),在T3處理下達(dá)到最低谷值6.92 nmol/g,分別比對(duì)照組CK1、CK2降低了39.6%、47.2%,存在顯著差異(P<0.05),且其它處理的MDA含量較對(duì)照CK2均有不同程度的降低,這說(shuō)明噴施殼聚糖溶液能顯著抑制MDA的生成;之后隨著殼聚糖溶液濃度的上升,MDA含量明顯增加,且仍低于對(duì)照??梢?jiàn),當(dāng)殼聚糖溶液濃度為0.15%時(shí),黃芩幼苗受到干旱脅迫危害最小,抗旱性最強(qiáng)。
圖8 不同濃度殼聚糖對(duì)干旱脅迫下黃芩幼苗MDA含量的影響
由圖9可看出:CK2黃芩幼苗的脯氨酸含量較CK1顯著上升17.3%,說(shuō)明黃芩幼苗在逆境情況下,體內(nèi)脯氨酸含量明顯上升;當(dāng)噴灑殼聚糖溶液后,脯氨酸含量也持續(xù)上升,且在一定濃度范圍內(nèi)存在遞增遞減趨勢(shì);當(dāng)殼聚糖溶液濃度為0.15%時(shí),脯氨酸含量達(dá)到最高峰,為10.75 μg/g,且比對(duì)照組CK1、CK2分別高出194.5%、151.1%,有顯著性差異(P<0.05);隨著殼聚糖溶液濃度的增加,其對(duì)黃芩幼苗脯氨酸含量的促進(jìn)作用逐漸下降,但仍高于對(duì)照組。結(jié)果表明,當(dāng)CTS濃度為0.15%時(shí),黃芩幼苗受到干旱脅迫危害最小,抗旱性最強(qiáng)。
圖9 不同濃度殼聚糖對(duì)干旱脅迫下黃芩幼苗脯氨酸含量的影響
由圖10可知:在20% PEG6000模擬干旱脅迫下黃芩幼苗葉片可溶性糖含量隨著殼聚糖濃度的增加呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì);對(duì)照組CK2的黃芩幼苗可溶性糖含量較CK1明顯提高1.92個(gè)百分點(diǎn);當(dāng)殼聚糖濃度為0.15%時(shí),可溶性糖含量達(dá)到最高,為9.56%,且比對(duì)照組CK1、CK2分別高出5.14、3.22個(gè)百分點(diǎn),差異達(dá)顯著性水平(P<0.05);隨著殼聚糖溶液濃度的進(jìn)一步上升,其對(duì)黃芩幼苗可溶性糖含量的促進(jìn)逐漸下降,但仍高于對(duì)照組。結(jié)果表明,當(dāng)殼聚糖濃度為0.15%時(shí),滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可溶性糖含量最高,可降低植物組織水勢(shì),提高植物的吸水能力,從而顯著提高黃芩幼苗的抗旱性。
圖10 不同濃度殼聚糖對(duì)干旱脅迫下黃芩幼苗可溶性糖含量的影響
種子的發(fā)芽率(勢(shì))及發(fā)芽指數(shù)代表著種子的活力指標(biāo),是衡量種子質(zhì)量的重要指標(biāo)。在本試驗(yàn)中,用不同濃度的殼聚糖溶液浸種處理黃芩種子,其各項(xiàng)萌發(fā)指標(biāo)都以在0.15% CTS處理下最佳;而當(dāng)CTS濃度高于0.15%時(shí),其萌發(fā)指標(biāo)逐漸下降。說(shuō)明殼聚糖能夠明顯提高種子發(fā)芽的呼吸速率,并隨著殼聚糖濃度的增大而提高,使種子內(nèi)的物質(zhì)加速轉(zhuǎn)化,進(jìn)而促進(jìn)種子的萌發(fā)。而隨著殼聚糖濃度的不斷增加,種子的呼吸速率過(guò)快,促使大量的能量以熱量的形式散失,降低了殼聚糖的促進(jìn)作用。
葉綠素是植物光合作用中非常重要的色素,其含量的高低決定了植物光合能力的強(qiáng)弱。在本試驗(yàn)中,用20% PEG6000模擬干旱處理黃芩幼苗,導(dǎo)致其葉綠素含量明顯下降,這說(shuō)明干旱脅迫會(huì)對(duì)植物光合器官造成傷害。當(dāng)噴灑殼聚糖溶液后,葉綠素含量得到顯著提高,且濃度為0.15%時(shí)效果最佳,表明殼聚糖可抑制逆境脅迫對(duì)植物的傷害,提高黃芩幼苗葉綠素含量,進(jìn)而促進(jìn)其光合能力,促進(jìn)干物質(zhì)和能量的積累,有利于后期黃芩幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育。
超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)是植物組織中重要的保護(hù)酶,與植物的衰老和抗逆性密切相關(guān)。當(dāng)植物受到逆境脅迫時(shí),體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧自由基,而保護(hù)酶SOD可以催化超氧物陰離子自由基,生成O2和H2O2。為了避免H2O2對(duì)細(xì)胞的氧化損傷,通過(guò)CAT將生成的H2O2分解為O2和H2O。本研究發(fā)現(xiàn),在干旱脅迫下黃芩幼苗保護(hù)酶活性顯著高于對(duì)照組,這與段輝國(guó)等[18]、郭東會(huì)等[19]、張俊風(fēng)等[20]的研究結(jié)果一致。在本試驗(yàn)中,用殼聚糖溶液處理干旱脅迫下黃芩幼苗后,其保護(hù)酶活性都得到明顯提高,且在殼聚糖溶液濃度為0.15%時(shí)效果最佳。表明殼聚糖可抑制逆境脅迫對(duì)植物的傷害,延緩黃芩的衰老,增強(qiáng)其抗逆性,促進(jìn)黃芩幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育。
當(dāng)植物遭受逆境脅迫時(shí),其細(xì)胞中活性氧自由基的產(chǎn)生和清除之間的平衡遭到破壞,自由基迅速積累,造成膜脂過(guò)氧化,產(chǎn)生大量的丙二醛(MDA)。因此,MDA含量能反映黃芩幼苗葉片生物膜受傷害的程度及其抗旱性的強(qiáng)弱。在干旱脅迫下,黃芩幼苗葉片中的MDA含量得到明顯的提升,而經(jīng)過(guò)殼聚糖溶液處理后,MDA含量顯著降低,均低于對(duì)照組,且以0.15%濃度的效果最佳,說(shuō)明殼聚糖可緩解膜脂過(guò)氧化的過(guò)程,降低丙二醛的含量。
脯氨酸和可溶性糖是植物細(xì)胞中重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),與植物抗逆性密切相關(guān)。脯氨酸能夠有效保持細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)與環(huán)境的滲透平衡,預(yù)防水分丟失,并能保護(hù)膜結(jié)構(gòu)的完整性??扇苄蕴峭ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)植物組織滲透勢(shì),在逆境下維持植物生長(zhǎng)。在本試驗(yàn)中,用殼聚糖處理干旱脅迫下的黃芩幼苗,其脯氨酸、可溶性糖的含量均高于對(duì)照組,且以0.15%濃度時(shí)效果最佳。這與顧麗嬙等[21]、從心黎等[22]的研究結(jié)果基本一致。說(shuō)明干旱情況下施加殼聚糖可有效地提高脯氨酸、可溶性糖含量,降低對(duì)幼苗的干旱脅迫。
綜上所述,適宜濃度(0.15%)的殼聚糖處理可抑制黃芩幼苗MDA含量的增加,提高種子的萌發(fā)率,增強(qiáng)植物細(xì)胞內(nèi)保護(hù)酶活性,增加光合色素和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量,從而防止或降低膜脂過(guò)氧化作用對(duì)質(zhì)膜的傷害。本試驗(yàn)結(jié)果可為黃芩的抗旱性研究提供參考,也可為利用殼聚糖作為化控措施來(lái)增強(qiáng)黃芩的耐旱性提供理論依據(jù)。本研究開(kāi)展了外源CTS噴施最佳濃度試驗(yàn),但主要針對(duì)盆栽苗開(kāi)展研究,而對(duì)于黃芩大田栽培中相關(guān)生理生化指標(biāo)的研究還有待進(jìn)一步開(kāi)展。