陳利云，呼麗萍，汪之波

(天水師范學(xué)院 生物工程與技術(shù)學(xué)院/甘肅省大櫻桃工程技術(shù)研究中心，甘肅 天水 741000)

天然無污染微生物菌肥能提高作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，增強作物的抗逆性，是發(fā)展綠色可持續(xù)農(nóng)業(yè)的重要途徑。植物內(nèi)生菌(endophytic fungi)是一類生活在活體植物組織內(nèi)的微生物菌體，具有不同生存策略，與宿主共生的內(nèi)生菌不會引發(fā)植物產(chǎn)生明顯病害癥狀[1]。1993年Stierle從短葉紅豆杉(TaxusbrevifoliaNutt)內(nèi)生菌中分離出抗癌藥物紫杉醇，推動了從植物內(nèi)生菌中尋求活性生物活性代謝物的研究[2]，在真菌、細菌和放線菌中，植物內(nèi)生真菌是目前研究的熱點[3-5]，它們代謝產(chǎn)生的酚類物質(zhì)、抗氧化活性物質(zhì)、生物堿等物質(zhì)能促進宿主植物的生長并增強植物抗逆性[6-7]。銀杏(GinkgobilobaL.)是被稱為“活化石”的裸子植物，在地球上已有約3億年的演化歷史，是銀杏屬唯一的現(xiàn)存種，也是我國特有的世界珍稀樹種，內(nèi)共生理論學(xué)說認為，在長期的進化歷程中，銀杏幾乎不被病蟲害感染的原因與其體內(nèi)協(xié)同進化的多樣性內(nèi)生菌密不可分，而這些內(nèi)生菌代謝產(chǎn)生高活性的抑菌物質(zhì)，為此樹種成為自然進化史中的活化石提供了保障[8-10]。本研究前期試驗從銀杏葉片中分離篩選了大量內(nèi)生真菌，用這些內(nèi)生真菌醇提取物處理鳳尾雞冠花，以探究不同的內(nèi)生菌醇提取物對鳳尾雞冠花生長發(fā)育及抗逆性的影響，為深入解析內(nèi)生真菌與宿主植物間的共生關(guān)系的分子機理，研制無污染、綠色、環(huán)保的生物制劑提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試鳳尾雞冠花：鳳尾雞冠花(CwlosiaargenteaL. cv.plumosa)，購買于北京金地永豐農(nóng)業(yè)科技有限公司。供試內(nèi)生真菌分離于天水地區(qū)本土銀杏鮮葉(保存于天水師范學(xué)院農(nóng)業(yè)微生物重點實驗室)。

內(nèi)生菌醇提取物：編號為Ⅰ、Ⅲ和Ⅵ的內(nèi)生菌醇提取物分別提取于編號為1、3、6的銀杏內(nèi)生真菌，分屬于晶粒鬼傘種(Coprinusmicaceus)、鏈格孢屬(Alternariasp.)、鏈格孢種(Alternariaalternate)，提取方法是在參考Wu等[11]方法的基礎(chǔ)上做了優(yōu)化。

1.2 試驗設(shè)計

種子處理：供試的鳳尾雞冠花種子用10%的巴氏消毒液處理15～20 min，再用單蒸水清洗4～5次，分別用1 ng/mL內(nèi)生菌醇提取物Ⅰ、Ⅲ和Ⅵ浸泡12 h，設(shè)置超純水浸種為對照，之后將種子移入MS培養(yǎng)液中發(fā)芽培養(yǎng)7～10 d，備用。

盆栽試驗：培養(yǎng)盆(直徑28 cm、高30 cm)裝入同等質(zhì)量的基質(zhì)(沙、草炭、有機肥體積比為4∶1∶2)，種植以上處理過的種子，每處理3次重復(fù)，分甲乙2組溫室培養(yǎng)，甲組植株長出2片子葉后(10 d)每5 d用100 mL 0.1 ng/mL的內(nèi)生菌醇提取物Ⅰ、Ⅲ、Ⅵ葉面噴灑處理組，培養(yǎng)30 d。

干旱試驗：乙組植株長出2片子葉后(10 d)用濃度為0、30%的聚乙二醇(PEG-6000)溶液葉面噴灑做干旱脅迫處理，20 d后進行形態(tài)和生理指標的測定。

1.3 測定項目與方法

電子天平測定每盆植株鮮重，葉片面積用便攜式葉面積測定儀進行測定，花色素的測定采用液質(zhì)聯(lián)用法分光光度法測定?？共×z測采用西瓜殼二孢-甜瓜蔓枯病(AscochytaCitullinaSmith)病原真菌感染葉片，臺盼藍(Typan blue)染色程度的量化分析。葉綠素采用比色法測定，脯氨酸采用茚三酮顯色比色法測定，丙二醛采用紫外分光光度法測定，可溶性糖采用蒽酮比色法測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2007、SPSS 11軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計、整理、分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生菌醇提取物Ⅲ對鳳尾雞冠花生長發(fā)育的影響

內(nèi)生菌醇提取物Ⅲ能促進鳳尾雞冠花地上植株的生長(圖1)，與對照相比，植株莖稈明顯粗壯，單株鮮重是對照的3.87倍，同時葉片面積明顯增大，比未處理的對照增加了83%，呈顯著差異。鳳尾雞冠花表型特性表明：內(nèi)生菌醇提取物Ⅲ能促進雞冠花莖、葉等器官變大，對鳳尾雞冠花的生長發(fā)育具有明顯的促進作用。

2.2 內(nèi)生菌醇提取物Ⅰ對鳳尾雞冠花耐旱性的影響

花青素含量是衡量植物耐旱能力的主要指標，對鳳尾雞冠花進行干旱脅迫培養(yǎng)顯示，內(nèi)生菌醇提取物Ⅰ處理的雞冠花耐旱性明顯提高(圖2)。與對照相比植株成活率為增加了4.97倍。干旱脅迫比較敏感的植物花青素合成較快，未經(jīng)內(nèi)生菌醇提取物Ⅰ處理的鳳尾雞冠花花青素含量明顯比處理過的高，為處理的2.7倍。

2.3 內(nèi)生菌醇提取物Ⅵ鳳尾雞冠花抗病力的影響

內(nèi)生菌醇提取物Ⅵ能增強抗病能力(圖3)，將內(nèi)生菌醇Ⅵ處理過的種子播種培養(yǎng)15 d后，葉片用西瓜殼二孢-甜瓜蔓枯病病原真菌感染，通過對臺盼藍染色程度的量化分析顯示，與對照相比內(nèi)生菌醇提取物Ⅵ處理過的雞冠花死亡細胞數(shù)目顯著降低，是對照的44%，試驗結(jié)果表明，內(nèi)生菌醇提取物Ⅵ能明顯提高鳳尾雞冠花對蔓枯病病原菌的抵抗力。

A.內(nèi)生菌醇Ⅰ處理干旱脅迫盆栽30 d的鳳尾雞冠花植株；B.未處理對照播種后30 d葉片上花青素。圖2 內(nèi)生菌醇Ⅰ對鳳尾雞冠花花青素含量的影響

A.用內(nèi)生菌醇Ⅵ處理盆栽15 d后的鳳尾雞冠花植株；B.Ⅵ未處理的盆栽15 d植株。圖3 內(nèi)生菌醇Ⅵ對鳳尾雞冠花抗病力的影響

2.4 內(nèi)生菌醇提取物對鳳尾雞冠花可溶性糖、葉綠素等物含量的影響

對由內(nèi)生菌醇提取物Ⅰ、Ⅲ和Ⅵ處理及對照培養(yǎng)30 d后的葉綠素、脯氨酸、丙二醛及葡萄糖含量檢測顯示，植株可溶性糖含量隨著干旱脅迫程度的加強而增強(圖4)，但其他幾種活性物質(zhì)含量與對照間無顯著差異，內(nèi)生菌醇提取物Ⅲ、Ⅵ對植株抗旱性無明顯影響，而內(nèi)生菌醇提取物Ⅰ能顯著提高鳳尾雞冠花對干旱脅迫的抵抗力。

圖4 內(nèi)生菌醇提取物Ⅰ、Ⅲ和Ⅵ對鳳尾雞冠花葉綠素、脯氨酸、丙二醛及葡萄糖含量的影響

3 討論

共生在宿主組織中的內(nèi)生真菌能促進宿主植物生長發(fā)育，它們能代謝產(chǎn)生生長素、赤霉素等植物激素，能加強宿主的生物固氮效率，增強宿主對礦物質(zhì)營養(yǎng)元素如氮、磷、鉀的吸收，從而促進宿主種子萌發(fā)率，提高幼苗存活、增加分蘗生長[12-15]。通過與宿主長期的協(xié)同進化，內(nèi)生菌能產(chǎn)生與宿主植物相似或相同的活性化學(xué)物質(zhì)，這些物質(zhì)大多能促進植物生長發(fā)育并提高宿主植物對生物和非生物脅迫的抵抗力[16-17]。易婷等[18]研究發(fā)現(xiàn)，向日葵根部分離出的根瘤菌可通過分泌胞外多糖改變土壤結(jié)構(gòu)增加植物根部對環(huán)境的適應(yīng)性，從而促進向日葵的生長。內(nèi)生菌醇提取物Ⅲ誘導(dǎo)鳳尾雞冠花葉片面積增大和生物量的增加很可能是通過活性物質(zhì)改變根部土壤環(huán)境從而緩解了植物根部的非生物壓力來實現(xiàn)的。

內(nèi)生真菌在宿主細胞中的定殖、孢子萌發(fā)、菌體生長繁殖以及物質(zhì)代謝過程都要受宿主植物表現(xiàn)型和基因型的影響，這種基因?qū)用娴慕换プ饔卯a(chǎn)生的信息傳導(dǎo)通路，使內(nèi)生菌參與到宿主次生代謝產(chǎn)物合成的過程中，在其中起到協(xié)同或催化關(guān)鍵酶類合成的作用[19-20]，直接或間接地影響宿主植物的生長發(fā)育、抗逆性及生殖等過程，提高宿主植物在惡劣、貧瘠環(huán)境中的生存力[21]。內(nèi)生菌醇Ⅵ處理能增強雞冠花對西瓜殼二孢-甜瓜蔓枯病病原真菌侵染的抵抗力，降低葉片細胞死亡數(shù)目。內(nèi)生菌醇提取物Ⅰ處理時鳳尾雞冠花可溶性糖含量隨著干旱脅迫程度的增大而增加，這與Yu等[22]的研究結(jié)果一致，推測此種變化很可能是由內(nèi)生菌醇提取物Ⅰ處理后，鳳尾雞冠花對糖信號感知能力發(fā)生變化引起的。

在植物體內(nèi)，調(diào)控植物生長發(fā)育、脅迫、代謝等途徑的信號通常是一致的，這都是生物進化的結(jié)果[23-24]。解析糖信號介導(dǎo)的內(nèi)生菌提取物誘導(dǎo)雞冠花高產(chǎn)抗逆性的分子機制，能為未來研發(fā)更高效的微生物肥料提供理論支柱和基本思路，但內(nèi)生菌醇提取物Ⅰ、Ⅲ和Ⅵ是否誘導(dǎo)了糖信號異常？這些糖信號的受體是什么是以什么方式作用等問題還需進一步深入探討。