鄭旋 向準(zhǔn) 康超 李鵬 汪建文 楊彝華

摘 要 對(duì)貴州省龍里縣羊肚菌開(kāi)展真菌病害調(diào)查、采集與分離純化，運(yùn)用形態(tài)學(xué)鑒定和rDNA-ITS序列分子檢測(cè)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。共分離鑒定了18個(gè)真菌病原菌菌株，屬于木霉屬（Trichoderma）、毛霉屬（Mucor）、根霉屬（Rhizopus）、鐮刀菌屬（Fusarium）和阿太菌屬（Athelia）等。

關(guān)鍵詞 羊肚菌;真菌病害;分離鑒定

中圖分類號(hào)：S567.34 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.21.066

羊肚菌（Morchella importuna）隸屬于羊肚菌科（Morchellaceae）羊肚菌屬（Morchella）[1]，因其菌蓋表面凹凸不平形似羊肚，又被稱為羊肚菜、羊肚蘑，是一種珍貴食藥用菌[2]。近年來(lái)，隨著羊肚菌產(chǎn)業(yè)的擴(kuò)大發(fā)展，栽培管理中病蟲(chóng)害問(wèn)題日趨明顯[3]，其中由真菌病原菌引發(fā)的競(jìng)爭(zhēng)（侵染）性病害最為嚴(yán)重，造成羊肚菌減產(chǎn)甚至失收[4]。本研究通過(guò)羊肚菌真菌病害調(diào)查和分離鑒定，了解羊肚菌真菌病害發(fā)生情況和病原菌類別，為羊肚菌防治病害提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2020年1月，在貴州省龍里縣灣灘河鎮(zhèn)羊肚菌種植基地開(kāi)展真菌病害調(diào)查，以3～5個(gè)大棚為調(diào)查重點(diǎn)，每個(gè)大棚隨機(jī)采集有明顯真菌病害特征的羊肚菌子實(shí)體、營(yíng)養(yǎng)袋和栽培土壤標(biāo)本，記錄發(fā)病時(shí)間和病害特征等信息，標(biāo)本編號(hào)并裝入密封袋內(nèi)，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離、培養(yǎng)、鑒定。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離、純化

在超凈工作臺(tái)上，用滅菌過(guò)的接種針從樣品病害部位挑取1小塊置于PDA培養(yǎng)基平板上，于25 ℃恒溫避光培養(yǎng)3～5 d，挑取菌落尖端菌絲于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，重復(fù)3～5次。將純化后的菌絲轉(zhuǎn)入斜面試管培養(yǎng)，于

4 ℃冰箱內(nèi)保存。

1.2.2 病原菌形態(tài)鑒定

在超凈工作臺(tái)上，用滅過(guò)菌的接種針從保存的病原菌株上各挑取少量菌絲，分別接種于PDA平板培養(yǎng)基上，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔1 d觀察菌落形態(tài)和菌絲生長(zhǎng)情況等。

1.2.3 病原菌分子鑒定

采用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取病原菌菌株DNA，用引物5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3和5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3擴(kuò)增菌株DNA基因的ITS序列，PCR反應(yīng)采用25 μL反應(yīng)體系。PCR循環(huán)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min;擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)（94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min），72 ℃延伸10 min。測(cè)序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊肚菌真菌病害調(diào)查

在調(diào)查的羊肚菌栽培大棚內(nèi)，共采集病害樣品9份，病害特征調(diào)查結(jié)果為：羊肚菌子實(shí)體顏色變深，不同程度萎蔫、畸形，蛛網(wǎng)狀白色菌絲自下而上侵染，包裹整個(gè)子實(shí)體，幼菇停止發(fā)育;菌柄顏色偏紅，菌蓋畸形發(fā)育呈近圓球形，頂部有白色霉層，并產(chǎn)生白色孢子粉;菌蓋萎蔫形成孔洞，孔洞邊緣有白色霉層。營(yíng)養(yǎng)袋內(nèi)有粉紅色至紫色、綠色黑色霉菌污染。白色病菌菌絲自菌袋底部向周圍土壤侵染蔓延，覆蓋營(yíng)養(yǎng)袋周圍栽培土壤，后期菌絲侵染整個(gè)廂面，顏色加深，廂面上無(wú)羊肚菌生長(zhǎng)。

2.2 病原菌菌落形態(tài)特征

分離純化采集的9份病害樣品，共獲得18個(gè)真菌病原菌菌株，分別對(duì)18個(gè)真菌病原菌菌株進(jìn)行菌落形態(tài)特征觀測(cè)，結(jié)果如圖1所示。

2.3 病原菌分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

將18個(gè)真菌病原菌菌株的ITS序列在GenBank中進(jìn)行Blast序列分析

3 討論

調(diào)查顯示，因栽培土壤處理不當(dāng)或培養(yǎng)料滅菌不徹底，真菌在適宜環(huán)境下迅速生長(zhǎng)，與羊肚菌菌絲爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)、水分、氧氣和空間，導(dǎo)致羊肚菌子實(shí)體生長(zhǎng)不良或停止生長(zhǎng)[5-6]。其中，深綠木霉（T.atroviride）和綠木霉（T.virens）為常見(jiàn)食用菌栽培中的木霉雜菌，總狀毛霉（M.racemosus）為常見(jiàn)的食用菌栽培中的毛霉雜菌，尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）和亞洲鐮刀菌（F.asiaticum）可能為羊肚菌鐮刀菌病或霉菌性枯萎病的病原菌[7-8]。在羊肚菌栽培過(guò)程中，土壤表面出現(xiàn)大量白色菌絲，可能為阿太菌，梨采后阿太菌易發(fā)，此次是首次從食用菌病害中分離得到的[6]，在食用菌上還未見(jiàn)其致病報(bào)道，對(duì)所得結(jié)果還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)：

[1] 吳興亮，卯曉嵐，圖力古爾，等.中國(guó)藥用真菌[M].北京：科學(xué)出版社，2013.

[2] 敬華英.羊肚菌種屬鑒定及活性成分保健功效研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，46（14）：34-36.

[3] 劉偉，張亞，何培新.羊肚菌生物學(xué)與栽培技術(shù)[M].長(zhǎng)春：吉林科學(xué)技術(shù)出版社，2017.

[4] 宋金俤，曲紹軒，馬林，等.食用菌病蟲(chóng)識(shí)別與防治原色圖譜[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2013.

[5] 劉正慧，李丹，等.食用菌主要病原真菌和細(xì)菌[J].菌物研究，2018，16（3）：158-163.

[6] 賈曉輝.梨采后阿太菌果腐病病原學(xué)及其致病機(jī)制研究[D].沈陽(yáng)：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2019.

[7] 吳小平.食用菌致病木霉的鑒定、致病機(jī)理及防治研究[D].福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2008.

[8] 余苗，尹琪，何培新.羊肚菌白腐病病原菌的分離與鑒定[J].北方園藝，2020（7）：142-145.

（責(zé)任編輯：劉昀）