王健 楊成龍 楊小雨

摘要 以薏苡黑穗病菌粉胞內(nèi)蛋白為免疫原，制備抗體，建立薏苡黑穗病ELISA檢測(cè)方法。結(jié)果表明，測(cè)定純化后抗體的最高效價(jià)為1∶800 000，具特異性強(qiáng);方陣試驗(yàn)測(cè)定抗原的最佳包被濃度為10.3 CFU/mL，抗體的工作濃度為1∶4 000;優(yōu)化ELISA檢測(cè)條件，確定抗體4 ℃過(guò)夜（8～12 h）包被效果最好，選擇1%酪蛋白作為抗體的封閉液，抗體的最佳封閉時(shí)間為 1.5 h，抗體的最佳孵育時(shí)間為2.5 h，最佳底物作用時(shí)間為15 min;建立ELISA標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，表明抗體的靈敏度為10.4 CFU/mL。ELISA檢測(cè)田間采集的黑穗病病葉顯示，抗體可與病葉提取液發(fā)生特異性反應(yīng)，而與健康葉提取液呈陰性反應(yīng)，由此可確定黑穗病的存在與否。該方法可用于田間薏苡黑穗病快速檢測(cè)，以及時(shí)指導(dǎo)病害防治。

關(guān)鍵詞 薏苡黑穗病;抗體;酶聯(lián)免疫反應(yīng)

中圖分類號(hào) S435.19 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2020）05-0197-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.05.056

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract The antibody was prepared by the immunogen with the intracellular protein in Coix lacrymajobi smut fungus powder， and the ELISA detection method was established. The results showed that the titer was 1∶800 000 of the purified antibody，which had high specific.The square matrix test to determine the optimal coating concentration of the antigen was 10.3 CFU/mL， and the working concentration of the antibody was 1∶4 000;the optimization ELISA detection conditions were antigen blocked for night （8-12 h） at 4 ?℃， 1% cottomin of the assay buffer blocked for 1.5 h， antigen incubated for 2.5 h， the reaction time of coloration was 15 min. The standard curves of ELISA was established，which showed that the antibody sensitivity was 10.4 CFU/mL.ELISA detection of smut diseased leaves collected in the field showed that the antibody could be specific reaction with the extracted solution of disease leaves，and it be negative reaction with extracted solution of healthy leaves， which could confirm the presence or absence of smut.The method can be applied to detect cucumber bacterial white spot disease in field and direct the disease control in time.

Key words Coix lacrymajobi smut;Antibody;ELISA

薏苡（Coix lacrymajobi L.）是我國(guó)重要的藥糧兼用的經(jīng)濟(jì)作物，具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。薏苡在我國(guó)分布廣泛，主產(chǎn)貴州、廣西、云南、福建等省[1]。目前，貴州省薏仁米種植面積、產(chǎn)量均居全國(guó)第一，生產(chǎn)量占全國(guó)2/3[2]。貴州省各地薏苡種植分散，生產(chǎn)以農(nóng)民自留當(dāng)?shù)剞r(nóng)家種為主，種植區(qū)域沒(méi)有實(shí)行合理布局，難以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化、規(guī)?；?，導(dǎo)致薏苡病害多發(fā)，尤其是由薏苡黑穗病最為嚴(yán)重，可使產(chǎn)量下降30%～50%，嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)80%[3-5]。

近年由于薏苡品種雜亂，導(dǎo)致黑穗病對(duì)薏苡的生長(zhǎng)危害日趨嚴(yán)重，嚴(yán)重影響薏苡的產(chǎn)量和品質(zhì)，對(duì)農(nóng)戶的經(jīng)濟(jì)收入造成嚴(yán)重的影響以及制約薏仁米產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。對(duì)薏苡感黑穗病后建立快速檢測(cè)的方法報(bào)道較少，而采用建立酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定（ELISA）技術(shù)檢測(cè)早期薏苡感染黑穗病的方法鮮見(jiàn)報(bào)道，至1976年首次采用應(yīng)用于植物病毒檢測(cè)[6]后，該方法被用于植物、動(dòng)物、醫(yī)學(xué)上對(duì)病原菌及農(nóng)藥殘留等快速檢測(cè)的有效手段[7-9]，該技術(shù)方法為一類通過(guò)固相載體進(jìn)行酶聯(lián)免疫染色的免疫酶標(biāo)，其特點(diǎn)具有特異性較強(qiáng)、高靈敏度、易操作、快速準(zhǔn)確，對(duì)于生產(chǎn)上常規(guī)方法難以檢測(cè)的病害具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。目前國(guó)內(nèi)采用ELISA 技術(shù)成功檢測(cè)各種病害，孫艷秋等[10]建立ELISA方法對(duì)黃瓜細(xì)菌性白枯病菌檢測(cè)結(jié)果表明抗體的靈敏度為10.5 CFU/mL;Tsuchiya等[11]制備了番茄和辣椒細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌的單克隆抗體;寧紅等[12]用I-ELISA方法檢測(cè)水稻細(xì)菌性條斑病菌，通過(guò)ELISA測(cè)定靈敏度可達(dá)10.3～10.4 CFU/mL。該研究以薏苡黑穗病菌菌絲蛋白作為免疫原，制備了多克隆抗體，并建立了快速靈敏的薏苡黑穗病ELISA檢測(cè)體系，為進(jìn)一步進(jìn)行針對(duì)薏苡黑穗病的快速檢測(cè)試劑盒的研究奠定了基礎(chǔ)。

2.3 建立間接 ELISA 方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線

將薏苡黑穗病菌粉配成不同濃度按“2.2.2”和“2.2.3”優(yōu)化條件進(jìn)行間接 ELISA 方法測(cè)定，以黑穗病菌粉液濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)、抑制率為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，評(píng)價(jià)其靈敏度;檢測(cè)結(jié)果顯示（圖6），薏苡黑穗病菌粉在60%～75%線性關(guān)系良好，即抗體的檢測(cè)線性范圍為 10.3～10.5 CFU/mL，所以該方法對(duì)薏苡黑穗病的檢測(cè)靈敏度為 10.4 CFU/mL。

2.4 采用ELISA方法檢測(cè)薏苡黑穗病病葉樣品

采用ELISA 方法對(duì)薏苡黑穗病病葉的提取液進(jìn)行檢測(cè)，將提取液包被酶標(biāo)板4 ℃過(guò)夜處理8～12 h后，以1%酪蛋白封閉液進(jìn)行封閉處理，置于 37 ℃恒溫箱中溫育封閉l.5 h，加入薏苡黑穗病菌抗體和病葉提取液，再放入 37 ℃恒溫箱中孵育 2.5 h，加入稀釋4 000倍的HRP-羊抗兔IgG后再次放入?37 ℃恒溫箱中孵育2.5 h，最終加入底物基質(zhì)液反應(yīng)15 min后終止反應(yīng)并測(cè)定 OD490。結(jié)果表明（表2），病葉提取液的 P/N為 4.8，對(duì)照健康葉片提取液為陰性反應(yīng)，表明建立的改良 ELISA 方法可準(zhǔn)確檢測(cè)出病葉中的薏苡黑穗病病菌。

3 小結(jié)與討論

關(guān)于植物病原真菌的血清學(xué)檢測(cè)中，一般可以將抗體分為2種，分別為單克隆抗體和多克隆抗體。單克隆抗體（monoclonal antibody，MAb） 是由一個(gè)B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，針對(duì)一種抗原決定簇的抗體[15]， 因具有特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性高、可無(wú)限量生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，但真菌結(jié)構(gòu)與物質(zhì)組成極為復(fù)雜，尋找具有特異性抗原極其困難[16-17]。而多克隆抗體（polyclonal antibody，PAb）是由多種抗原決定簇刺激機(jī)體后相應(yīng)地產(chǎn)生多種多樣的單克隆抗體，把這些單克隆抗體組合在一起就稱為多克隆抗體，雖其在某些情況下特異性不如單克隆抗體，但具有制備時(shí)間短、制備方法簡(jiǎn)單便捷、成本較單克隆抗體費(fèi)用低的特點(diǎn)，所以仍被廣泛研究和應(yīng)用于生物、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域?qū)Σ≡⑸锏臋z測(cè)[18]。

近年來(lái)，在薏苡種植生產(chǎn)中存在的問(wèn)題有品種單一、優(yōu)良品種少、品種退化等問(wèn)題日益突出，導(dǎo)致薏苡抗性差、病害多發(fā)，其中以薏苡黑穗病最為嚴(yán)重，嚴(yán)重制約了薏苡產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，該病系由擔(dān)子菌亞門(mén)黑粉菌屬冬孢子引起的全株系統(tǒng)性真菌病害[3，19]，病斑最早出現(xiàn)在分蘗期的葉片上，一般在植株抽穗期病情大規(guī)模暴發(fā)，防治極其困難，對(duì)已發(fā)病的植株生產(chǎn)上暫無(wú)特效藥劑進(jìn)行防治，因此建立一套早期檢測(cè)薏苡黑穗病的方法勢(shì)在必行。目前，一般采用分子生物技術(shù)對(duì)一些常規(guī)病害進(jìn)行檢測(cè)，但因其成本高與使用精密的儀器，對(duì)操作者的要求較高，而且一般局限于實(shí)驗(yàn)室使用，而ELISA方法的操作相對(duì)簡(jiǎn)單快捷，具有特異性好、靈敏度高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，而且可以開(kāi)發(fā)成試劑盒的形式，更適用于大規(guī)模田間樣品的檢測(cè)與基層推廣。該研究以薏苡黑穗病菌菌絲與菌粉的胞內(nèi)蛋白為抗原，獲得了黑穗病菌的多克隆抗體，效價(jià)分別為1∶450 000與1∶800 000，具有非常理想的效價(jià)與特異性。目前已報(bào)道ELISA的靈敏度一般為10.5～10.6 CFU/mL，對(duì)于鑒定常規(guī)病害的病原菌是足夠的[20]，該試驗(yàn)最佳的抗原抗體工作濃度已確定，并對(duì)各項(xiàng)反應(yīng)條件進(jìn)行初探優(yōu)化，同時(shí)對(duì)建立的 ELISA 方法進(jìn)行了薏苡黑穗病病葉的檢測(cè)，采用10.4 CFU/mL對(duì)供試植物病原菌檢測(cè)P/N為 4.8>2.1，而健康葉片呈陰性反應(yīng)P/N<2.1，可見(jiàn)其特異性較好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，為薏苡黑穗病快速診斷提供了有效的技術(shù)手段，具有良好的應(yīng)用前景。

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