孫達(dá)權(quán) 張欽真 胡桐

摘要 [目的]介紹一種PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行“TA”克隆的高保真PCR法，減少高保真PCR產(chǎn)物“TA”克隆的中間步驟。[方法]Trizol法提取人肝癌細(xì)胞SMMC-7721總RNA，并將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，聯(lián)合不同特性的Taq DNA聚合酶擴(kuò)增PKC基因的蛋白編碼區(qū)。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后進(jìn)行“TA”克隆、細(xì)菌轉(zhuǎn)化、篩選培養(yǎng)、質(zhì)粒抽提、酶切鑒定和測(cè)序鑒定等。[結(jié)果]高保真DNA聚合酶擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物未發(fā)現(xiàn)DNA突變，但不能直接進(jìn)行“TA”克隆。Taq DNA聚合酶擴(kuò)增的產(chǎn)物可直接進(jìn)行“TA”克隆，但其內(nèi)部存在多個(gè)突變位點(diǎn)，保真性明顯不足。聯(lián)合使用高保真DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶（雙酶聯(lián)用）擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物可直接進(jìn)行“TA”克隆，且DNA測(cè)序未發(fā)現(xiàn)突變。[結(jié)論]雙酶聯(lián)用PCR可以獲得高保真PCR產(chǎn)物，并直接進(jìn)行“TA”克隆。

關(guān)鍵詞 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng);DNA聚合酶;“TA”克隆;DNA突變

中圖分類(lèi)號(hào) Q78 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2020）05-0109-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.05.030

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract [Objective]To introduce a highfidelity PCR method with its product used in “TA” cloning directly，which could simplify the “TA” cloning step.[Method]Total RNAs were extracted from human hepatocellular carcinoma cell line SMMC7721 by Trizol reagent，and the mRNAs were reverse transcribed into cDNAs.Employing cDNAs as the templates，the cDNA region that codes protein of PKC was amplified by different types of DNA polymerases.The PCR products were subjected to a series of processes such as “TA” cloning，bacterial transformation，screening culture，plasmid extraction，restriction enzyme digestion and DNA sequencing.[Result]No DNA mutation was found in the product of PCR amplification with high fidelity DNA polymerase，but the product could not be linked directly to T vector.On the other hand，the product of PCR amplification with Taq DNA polymerase could be cloned into T vector directly，but it possessed multiple DNA point mutations and its fault was low fidelity.The product of PCR amplification with an alliance of high fidelity DNA polymerase and Taq DNA polymerase could be directly inserted into T vector without any point mutation.[Conclusion]Combined utilization of high fidelity DNA polymerase and Taq DNA polymerase in PCR can obtain high fidelity PCR product which is utilized in “TA” cloning directly.

Key words Polymerase chain reaction;DNA polymerase;“TA” cloning;DNA mutation

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）起源于美國(guó)Cetus公司，是由Mullis和Saiki發(fā)明的一種用于體外快速擴(kuò)增DNA的技術(shù)，也是分子生物學(xué)領(lǐng)域中最經(jīng)典、最常用的一種實(shí)驗(yàn)方法，主要用于基因克隆和檢測(cè)[1-3]。由于其過(guò)程簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)周期短、重復(fù)性好，因而成為現(xiàn)代分子生物學(xué)領(lǐng)域中最基本和最受歡迎的方法之一[4-5]。根據(jù)擴(kuò)增所使用的DNA聚合酶不同，可將PCR分成普通PCR和高保真PCR。常用的Taq DNA聚合酶是一種從嗜熱細(xì)菌Thermus aquaticus中分離的DNA聚合酶，其特點(diǎn)是可以耐受高溫而不變性[6-7]。它擴(kuò)增出來(lái)的PCR產(chǎn)物的3′末端帶有突出的“A”，但其內(nèi)部常常含突變位點(diǎn)。高保真DNA聚合酶來(lái)源各有差異，如Vent來(lái)源于Thermococcus litoralis，pfu來(lái)源于Pyrococcus furisus，或由這2種酶的基因突變和改造而來(lái)[8-9]。它擴(kuò)增出來(lái)的PCR產(chǎn)物具有較高的保真性，但其3′末端為平末端，不能直接進(jìn)行“TA”克隆，需要對(duì)產(chǎn)物 3′端額外加“A”后才能進(jìn)行“TA”克隆。此外，也有公司推出了平末端克隆技術(shù)，但其克隆效率不理想，大大限制了其利用和推廣。

目前在保證PCR產(chǎn)物具有較高保真性的同時(shí)還能直接進(jìn)行“TA”克隆的方法鮮見(jiàn)報(bào)道。該研究在前人的技術(shù)基礎(chǔ)上，利用高保真DNA聚合酶的高保真性和Taq DNA聚合酶的加“A”特性，通過(guò)聯(lián)合使用來(lái)有效解決這一問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 材料 RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液來(lái)源于GIBCO公司（美國(guó)），新生牛血清來(lái)源于杭州四季青（中國(guó)），人肝癌細(xì)胞SMMC-7721來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)（中國(guó)），Trizol來(lái)源于Invitrogen公司（美國(guó)），反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA A-Tailing Kit、Z-TaqTM DNA聚合酶、LA TaqDNA 聚合酶、PrimeSTAR GXL DNA聚合酶、TA克隆試劑盒（pMD18-T vector）、DNA凝膠回收試劑盒、Xho Ⅰ和BamH Ⅰ來(lái)源于大連寶生物公司（中國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)。用含10%新生牛血清的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)SMMC-7721細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)到80%時(shí)備用。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)和測(cè)序?；騊KCε （NM_005400） PCR引物和DNA測(cè)序委托廣州Invitrogen公司完成。PKCε上游引物序列為5′-TCTCGAGCGACCATGGTAGTGTTCAATGGCCTTC-3′，下游引物序列為5′-TGGATCCCAGGGCATCAGGTCTTCACCAAAGTAG-3′。

1.2.3 Trizol法抽提肝癌細(xì)胞總RNA。當(dāng)SMMC-7721細(xì)胞在6 cm的培養(yǎng)皿中生長(zhǎng)融合至80%時(shí)，用無(wú)菌PBS清洗培養(yǎng)皿中的細(xì)胞3次。然后加入1 ?mL Trizol，反復(fù)吹打直至細(xì)胞全部裂解。將裂解后的液體轉(zhuǎn)移到RNase-free的1.5 mL離心管中，加入200 μL氯仿，劇烈振蕩15 s，4 ℃、10 000 r/min離心10 min。將水相溶液轉(zhuǎn)移入新的RNase-free的1.5 mL離心管中，并加入500 μL異丙醇，倒置混勻后7 500 r/min離心5 min，棄去上清液。白色沉淀用DEPC處理過(guò)的75%乙醇清洗2次，每次7 500 r/min離心5 min。室溫自然干燥3 min，用100 μL RNase-free ddH2O溶解沉淀，即為RNA溶液，濃度定量至1 mg/mL，-80 ℃凍存。

1.2.4 RT-PCR與PCR。取2 μg RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit 說(shuō)明書(shū)操作，將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。用不同特性的Taq DNA聚合酶按表1配制PCR反應(yīng)液，并按程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其中，LA TaqDNA聚合酶的特性是長(zhǎng)鏈DNA擴(kuò)增、產(chǎn)物3′末端有突出“A”、高保真性低;PrimeSTAR GXL DNA聚合酶的特性是長(zhǎng)鏈DNA擴(kuò)增、產(chǎn)物3′末端為平末端、高保真性強(qiáng);Z-TaqTM DNA 聚合酶的特性是短鏈DNA擴(kuò)增、產(chǎn)物3′末端有突出“A”、高保真性低。

1.2.5 “TA”克隆。將上述3管PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠回收試劑盒回收DNA，并用無(wú)菌水定容至0.4 mg/mL。反應(yīng)1、反應(yīng)2、反應(yīng)3的純化產(chǎn)物分別標(biāo)記為T(mén)ube 1、Tube 2、Tube 3。取一部分Tube 3純化的DNA產(chǎn)物，按DNA A-Tailing Kit說(shuō)明書(shū)對(duì)DNA進(jìn)行加“A”，并將產(chǎn)物標(biāo)記為T(mén)ube 4。對(duì)Tube 1、Tube 2、Tube 3、Tube 4中的DNA進(jìn)行“TA”克隆，其中反應(yīng)液配制如下：各取上述純化產(chǎn)物0.4 μg，并各自加入pM18-T vector 1 μL，用ddH2O將體積補(bǔ)足至5 μL，再各自加入solution I 5 μL，4 ℃反應(yīng)過(guò)夜。

1.2.6 細(xì)菌轉(zhuǎn)化和鑒定。取100 μL感受態(tài)細(xì)菌置于冰浴中，將連接產(chǎn)物加入到感受態(tài)細(xì)菌中，冰浴30 min、42 ℃熱激60 s、冰浴2 min、加入900 μL LB細(xì)菌培養(yǎng)基，37 ℃復(fù)蘇1 h，取200 μL菌液涂布于A(yíng)mp+ LB固體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取克隆菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，質(zhì)粒提取后用限制性核酸內(nèi)切酶 （Xho Ⅰ/BamH Ⅰ） 酶切鑒定，并進(jìn)行DNA測(cè)序鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙酶聯(lián)用PCR可擴(kuò)增出PKCε的編碼區(qū)DNA片段

用LA Taq DNA聚合酶、雙酶（PrimeSTARG×L/Z-TaqTM DNA聚合酶）、PrimeSTARG×L DNA聚合酶分別作為PCR反應(yīng)的DNA聚合酶，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示均可以擴(kuò)增出靶基因PKCε的編碼區(qū)DNA片段，其分子量約為2.2 kb，與理論長(zhǎng)度一致（圖1）。

2.2 雙酶聯(lián)用PCR產(chǎn)物可直接進(jìn)行TA克隆

將純化的3管PCR產(chǎn)物和用高保真PCR擴(kuò)增并加“A”的產(chǎn)物分別進(jìn)行“TA”克隆，其結(jié)果如圖2所示。由于PrimeSTARG×L DNA聚合酶是一種高保真DNA聚合酶，其DNA產(chǎn)物的3′末端是平末端，所以TA克隆不能成功（圖2C）;當(dāng)用加“A”試劑盒對(duì)其產(chǎn)物3′末端加“A”后，其TA克隆成功（圖2D）。另外，用LA TaqDNA聚合酶、雙酶聯(lián)用（PrimeSTARG×L/ Z-Taq DNA聚合酶）擴(kuò)增產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物均可以直接進(jìn)行TA克?。▓D2A和2B），說(shuō)明雙酶聯(lián)用PCR擴(kuò)增出的DNA產(chǎn)物的3′末端有突出“A”，可直接進(jìn)行“TA”克隆。

2.3 雙酶聯(lián)用PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物具有高保真性

不同來(lái)源的單克隆菌落經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)、質(zhì)粒抽提和Xho Ⅰ酶切鑒定后， 發(fā)現(xiàn)T載體中所含有的靶序列長(zhǎng)度均一致（圖3）。對(duì)這些質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示用LA Taq ?DNA聚合酶擴(kuò)增的2.2 kb的DNA產(chǎn)物中存在多處點(diǎn)突變和缺失突變，其中一株克隆菌落中的靶DNA有6處點(diǎn)突變;而用PrimeSTAR ?G×L DNA聚合酶和雙酶聯(lián)用擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物具有高度保真性，無(wú)基因突變。說(shuō)明雙酶聯(lián)用可以保證PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的高保真性。

3 討論

PCR技術(shù)自出現(xiàn)以來(lái)，就受到生物學(xué)界和醫(yī)學(xué)界的高度關(guān)注，在短短的數(shù)年時(shí)間里，PCR技術(shù)經(jīng)歷了高速發(fā)展。到目前為止，PCR技術(shù)已經(jīng)成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最重要的技術(shù)手段之一。根據(jù)PCR的作用可將其分為檢測(cè)型PCR和基因克隆型PCR兩大類(lèi)別。檢測(cè)型PCR根據(jù)其實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟町悾?可延伸出不同的PCR，如對(duì)目的DNA進(jìn)行定量分析的熒光定量PCR[10]、制備探針用的不對(duì)稱(chēng)PCR[11]、檢測(cè)基因突變的單鏈構(gòu)型多態(tài)性PCR和低嚴(yán)格單鏈特異性引物PCR[12-13]、分析基因表達(dá)差異的隨機(jī)引物擴(kuò)增PCR[14]、用于腫瘤亞類(lèi)分型的低溫PCR[15]、檢測(cè)流行性傳染病的免疫PCR等[16]，這些特殊PCR在當(dāng)今生物、醫(yī)學(xué)界發(fā)揮重要的作用。另一方面，PCR主要用于體外高效擴(kuò)增靶基因或目的DNA，是當(dāng)今科研工作者獲取靶DNA的主要方法之一。這種技術(shù)主要依賴(lài)于高品質(zhì)的Taq DNA聚合酶，即酶的屬性決定擴(kuò)增產(chǎn)物的品質(zhì)。目前，不同商業(yè)公司已針對(duì)客戶(hù)不同的需求開(kāi)發(fā)了多種不同特性的DNA聚合酶，這些酶在靶基因獲得上起著重要的作用。

根據(jù)PCR反應(yīng)中DNA聚合酶屬性差異，其可分為普通型和高保真型兩大類(lèi)。普通型Taq DNA 聚合酶擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的3 ′末端有一個(gè)突出的“A”，它可以與市面上的“TA”克隆載體直接通過(guò)A-T配對(duì)而形成環(huán)形質(zhì)粒，用于高效的“TA”克隆。但是，由于這種酶的高保真性較低，在基因克隆時(shí)會(huì)隨機(jī)引入各種突變，使獲得的目的DNA往往與模板之間有一定的差異，這對(duì)基因功能研究帶來(lái)了諸多不便。高保真DNA 聚合酶就很好地解決了這一難題，利用其較強(qiáng)的外切酶活性，能夠最大限度地維持PCR產(chǎn)物的高保真性。這一特性受到廣大科研工作者的喜愛(ài)。但是，其自身也有不可回避的難題，即由于其PCR產(chǎn)物高度保真、產(chǎn)物3′末端無(wú)突出的“A”，不能直接進(jìn)行“TA”克隆。

在該研究中，首先利用高保真Taq DNA 聚合酶擴(kuò)增目的片段，保證PCR產(chǎn)物的高保真性，然后在PCR反應(yīng)的最后3個(gè)循環(huán)中直接加入普通Taq DNA 聚合酶，利用其3′末端加“A”特性獲得既有高度保真性又能在產(chǎn)物3′末端加“A”的PCR產(chǎn)物，實(shí)現(xiàn)高保真PCR產(chǎn)物的直接“TA”克隆。此方法簡(jiǎn)單方便，可直接跳過(guò)高保真PCR產(chǎn)物需要額外加“A”的步驟，實(shí)現(xiàn)快速“TA”克隆的目的，具有一定的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)

[1]WATERS D L E，SHAPTER F M.The polymerase chain reaction （PCR）：General methods[J].Methods Mol Biol，2014，1099：65-75.

[2]ISHMAEL F T，STELLATO C.Principles and applications of polymerase chain reaction：Basic science for the practicing physician[J].Ann Allergy Asthma Immunol，2008，101（4）：437-443.

[3]LORENZ T C.Polymerase chain reaction：Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies[J].J Vis Exp，2012，63：1-15.

[4]BAE J M，WEN X Y，KIM T S，et al.Fibroblast growth factor receptor 1 （FGFR1） amplification detected by droplet digital polymerase chain reaction （ddPCR） is a prognostic factor in colorectal cancers[J/OL].Cancer Res Treat，2019-05-08[2019-05-10].https：//www.ecrt.org/upload/pdf/crt-2019-062.pdf.DOI：10.4143/crt.2019.062.

[5]KANE S R，SHAH S R，ALFARO T M.Development of a rapid viability polymerase chain reaction method for detection of Yersinia pestis[J].J Microbiol Methods，2019，162：21-27.

[6]SUNDARRAJAN S，PARAMBATH S，SURESH S，et al.Novel properties of recombinant Sso7dTaq DNA polymerase purified using aqueous twophase extraction：Utilities of the enzyme in viral diagnosis[J].Biotechnol Rep （Amst），2018，20：1-10.

[7]SCHULTZ H J，GOCHI A M，CHIA H E，et al.Taq DNA polymerase mutants and 2′modified sugar recognition[J].Biochemistry，2015，54（38）：5999-6008.

[8]LUNDBERG K S，SHOEMAKER D D，ADAMS M W W，et al.Highfidelity amplification using a thermostable DNA polymerase isolated from Pyrococcus furiosus[J].Gene，1991，108（1）：1-6.

[9]GUO J X，ZHANG W L，COKER A R，et al.Structure of the family B DNA polymerase from the hyperthermophilic archaeon Pyrobaculum calidifontis[J].Acta Crystallogr D Struct Biol，2017，73（Pt 5）：420-427.

[10]黃小玲，張登，廖嘉明，等.熒光定量PCR技術(shù)的原理及其在植物研究中的應(yīng)用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，46（25）：36-40.

[11]FINCKH U，LINGENFELTER P A，MYERSON D.Producing singlestranded DNA probes with the Taq DNA polymerase：A high yield protocol[J].BioTechniques，1991，10（1）：35-36，38-39.

[12]撒云俐，那冬晨.山楂PCR-SSCP反應(yīng)體系與反應(yīng)條件的優(yōu)化[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（33）：137-139，142.

[13]NASRABADI N N，SARGAZI F，SHOKRZADEH M，et al.Expression of MT1 receptor in patients with gastric adenocarcinoma and its relationship with clinicopathological features[J].Neuro Endocrinol Lett，2018，39（2）：111-118.

[14]RUNGSRI P，AKKARACHANEEYAKORN N，WONGSUWANLERT M，et al.Effect of fermented milk containing Lactobacillus rhamnosus SD11 on oral microbiota of healthy volunteers：A randomized clinical trial[J].J Dairy Sci，2017，100（10）：7780-7787.

[15]梁卉，陳國(guó)杰，于燕，等.低溫變性下復(fù)合PCR技術(shù)及其應(yīng)用[J].遺傳，2018，40（3）：227-236.

[16]ANZAI H，TERAI T，JAYATHILAKE C，et al.A novel immunoPCR method using cDNA display[J].Anal Biochem，2019，578：1-6.