曹春杰，王淑晨，趙紫芙，于景華，田慧青，陳鐵濤

（1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457；2.百施(上海)生物科技有限公司，上海200235）

0 引 言

母乳是嬰兒腸道乳酸菌的重要來源[1]，而發(fā)酵乳桿菌CECT5716 是一株分離自健康母乳的益生菌株，能夠顯著降低胃腸道感染發(fā)病率并且在嬰兒早期服用具有良好的耐受性[2]及長期安全性[3]。目前在國外已經(jīng)有了一些關(guān)于發(fā)酵乳桿菌CECT5716 應(yīng)用于嬰幼兒配方奶的研究[4-5]。發(fā)酵乳桿菌CECT5716 在母嬰配方奶粉中有很大的應(yīng)用意義及前景，但是乳酸菌在凍干或噴霧干燥制備過程中極易受到損害；另外，菌粉制備后其水分含量、儲(chǔ)存溫度、長時(shí)間的運(yùn)輸過程也會(huì)對(duì)菌體自身活力產(chǎn)生影響[7]。

目前該進(jìn)口菌粉產(chǎn)品在應(yīng)用過程中通過國標(biāo)（GB4789.35-2016）無法檢測到與產(chǎn)品說明（外標(biāo)法檢測得）中相同的菌數(shù)。該研究旨在通過對(duì)比中外標(biāo)準(zhǔn)檢測過程的差異性設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)找出問題所在并提出可行性改進(jìn)意見。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料及器皿

發(fā)酵乳桿菌CECT5716 固體菌粉，MRS 合成培養(yǎng)基，MRS 進(jìn)口培養(yǎng)基，7.5L 厭氧盒，厭氧產(chǎn)氣袋，厭氧指示劑，90 mm 塑料培養(yǎng)皿。

1.2 儀器與設(shè)備

超凈工作臺(tái)，高壓滅菌鍋，微型旋渦混合儀，電子天平，pH 計(jì)，恒溫水浴鍋。

1.3 方法

1.3.1 乳桿菌計(jì)數(shù)

以無菌操作稱取25 g 樣品，置于裝有225 mL 溶解介質(zhì)的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，于轉(zhuǎn)速8 000 ～10 000 r/min均質(zhì)1 min，制成1∶10 樣品勻液，根據(jù)待檢樣品活菌總數(shù)的估計(jì)，選擇3 個(gè)連續(xù)的適宜稀釋度，每個(gè)稀釋度吸取1 mL 樣品勻液于滅菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。稀釋液移入平皿后，將冷卻至48 ℃的MRS 瓊脂培養(yǎng)基傾注入平皿約15 mL，轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使混合均勻。36±1℃厭氧培養(yǎng)72±2h[7]。

表1 為中外乳桿菌技術(shù)方法的差異，實(shí)驗(yàn)變量將參照該表進(jìn)行設(shè)計(jì)。

1.3.2 數(shù)據(jù)分析

表1 中外標(biāo)準(zhǔn)差異

用IBM SPSS 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性分析，顯著性差異（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 探討制樣前解凍對(duì)檢測結(jié)果的影響

將固體菌粉（-20 ℃保存）分為兩組，一組置于4 ℃下解凍6 h，另外一組繼續(xù)置于-20 ℃進(jìn)行保存，待6 h 后，將兩組同時(shí)取出，參照國標(biāo)（GB4789.35-2016）操作進(jìn)行培養(yǎng)。表2 為不同解凍情況對(duì)應(yīng)的計(jì)數(shù)結(jié)果。

表2 不同解凍情況對(duì)應(yīng)的計(jì)數(shù)結(jié)果 1011g-1

由表2 可知，在4 ℃下解凍6 h 后，菌落數(shù)相較不進(jìn)行解凍操作組均有不同幅度的提升，從平均值看解凍后檢測到的菌落數(shù)略有增加，說明解凍操作對(duì)于冷凍保藏下的固體菌種檢測具有積極意義。

2.2 不同處理方式對(duì)檢測結(jié)果的影響

參照1.3.1 中乳酸菌計(jì)數(shù)方法，按照表3 中實(shí)驗(yàn)處理方式進(jìn)行培養(yǎng)并記錄結(jié)果。

表3 針對(duì)樣品采用不同的處理方式進(jìn)行培養(yǎng)

通過對(duì)比中外標(biāo)準(zhǔn)中處理方式的差異，設(shè)計(jì)如下表格探討溶解介質(zhì)、溶解溫度、復(fù)溶情況、均質(zhì)方式和接種方式對(duì)檢測結(jié)果的影響。表4 為不同計(jì)數(shù)方法得到檢測結(jié)果。

由表4經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后得到以下結(jié)果：

（1）混勻方式對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果的影響。將計(jì)數(shù)方法1與2，方法3 與4，方法5 與6，方法7 與8 兩兩進(jìn)行獨(dú)立樣本T 檢驗(yàn)，結(jié)果顯示無顯著性差異（P＞0.05），說明用國標(biāo)法中“均質(zhì)杯+吹吸”與外標(biāo)法中“搖動(dòng)+漩渦混合器”兩種均質(zhì)方式對(duì)檢測結(jié)果無明顯影響，不是造成中外標(biāo)準(zhǔn)檢測結(jié)果差異的主要原因。

表4 不同處理方式計(jì)算結(jié)果 1011g-1

（2）溶解溫度對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果的影響。對(duì)計(jì)數(shù)方法1與3，方法2 與4 兩兩進(jìn)行獨(dú)立樣本T 檢驗(yàn)，結(jié)果顯示無顯著性差異（P＞0.05），表明室溫與37 ℃條件下溶解固體菌粉對(duì)檢測結(jié)果的影響不顯著，溶解溫度不是造成中外標(biāo)準(zhǔn)檢測結(jié)果差異的主要因素。

（3）溶解介質(zhì)對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果的影響。對(duì)計(jì)數(shù)方法5與7，方法6 與8 兩兩進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，從平均值看使用蛋白胨水復(fù)溶后菌落數(shù)有所增加，但是獨(dú)立樣本T 檢驗(yàn)結(jié)果顯示無顯著性差異（P＞0.05），表明溶解介質(zhì)為1%緩沖蛋白胨時(shí)更有利于恢復(fù)固體菌粉的活力，是構(gòu)成中外檢測標(biāo)準(zhǔn)差異的因素之一，但是其效果在統(tǒng)計(jì)學(xué)上分析不顯著。

（4）復(fù)溶情況對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果的影響。對(duì)計(jì)數(shù)方法3與5，方法4與6兩兩數(shù)據(jù)分析，從平均值看復(fù)溶45 min后檢測所得菌落數(shù)會(huì)有所增加，但是不構(gòu)成顯著性（P＞0.05），說明復(fù)溶45 min 后有助于固體菌粉恢復(fù)活力，是中外標(biāo)準(zhǔn)差異的因素之一，但統(tǒng)計(jì)學(xué)分析不顯著。

2.3 不同培養(yǎng)基對(duì)檢測結(jié)果的影響

將固體菌粉參照國標(biāo)（GB4789.35-2016）進(jìn)行同樣的處理后分別放至國標(biāo)法自配MRS 培養(yǎng)基、外標(biāo)法中進(jìn)口MRS 培養(yǎng)基、市售國標(biāo)法合成MRS 培養(yǎng)基和在國標(biāo)法自配MRS 培養(yǎng)基中加入適量維生素以及復(fù)合加入維生素與肝浸汁的物種不同培養(yǎng)基中相同條件下培養(yǎng)后計(jì)數(shù)。表5 為不同培養(yǎng)基上的計(jì)數(shù)結(jié)果；圖1為5種培養(yǎng)基菌落數(shù)的平均值。

表5 不同培養(yǎng)基上的計(jì)數(shù)結(jié)果 1011g-1

圖1 不同培養(yǎng)基培養(yǎng)下的菌落數(shù)平均值

由圖1 可以看出，在國標(biāo)法自配的MRS 培養(yǎng)基中加入維生素和肝浸汁后菌落數(shù)有明顯的升高，進(jìn)口MRS 培養(yǎng)基與國標(biāo)法自配培養(yǎng)基相比，培養(yǎng)后菌落數(shù)略有升高。對(duì)表5 中不同培養(yǎng)基成分培養(yǎng)的檢測結(jié)果進(jìn)行ANOVA 分析，結(jié)果表明國標(biāo)法合成MRS 培養(yǎng)基與外標(biāo)法進(jìn)口MRS 培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌落數(shù)差異不顯著（P＞0.05）。在國標(biāo)法培養(yǎng)基中加入維生素和肝浸汁后，菌落數(shù)相比國標(biāo)法自配培養(yǎng)基和外標(biāo)法進(jìn)口MRS培養(yǎng)基有顯著性增加（P=0.012及P=0.032）。

3 結(jié)果與討論

本研究針對(duì)中外標(biāo)準(zhǔn)檢測發(fā)酵乳桿菌固體菌粉過程差異造成檢測結(jié)果性差異的現(xiàn)象設(shè)計(jì)相關(guān)實(shí)驗(yàn)，從固體菌粉有無解凍，檢測中處理方式的不同以及培養(yǎng)基的差異3 個(gè)角度入手，并結(jié)合數(shù)據(jù)分析探究檢測結(jié)果差異產(chǎn)生的原因。

結(jié)果顯示冷凍保存（-20 ℃）的固體菌粉在4 ℃條件下進(jìn)行解凍6 h 會(huì)使檢測結(jié)果中菌落數(shù)量增加，但是最佳效果對(duì)應(yīng)的具體解凍時(shí)長需要再進(jìn)一步進(jìn)行研究；在探究處理方式對(duì)檢測結(jié)果的影響實(shí)驗(yàn)中，國標(biāo)法中“均質(zhì)杯+吹吸”與外標(biāo)法中“搖動(dòng)+漩渦混合器”兩種均質(zhì)方式檢測到的菌落數(shù)沒有明顯差異，說明兩種標(biāo)準(zhǔn)中均質(zhì)條件不是構(gòu)成結(jié)果差異的主要因素；在溶解過程中，室溫條件與37 ℃條件相比差異不明顯，不是構(gòu)成結(jié)果差異的主要因素；溶解后用1%緩沖蛋白胨水在37 ℃下復(fù)溶45 min 后菌落數(shù)有所提升，說明在此條件下進(jìn)行復(fù)溶更有利于固體菌粉恢復(fù)原活力，減小中外檢測結(jié)果的差異。該結(jié)論與文獻(xiàn)[6]相符，但在日常應(yīng)用中復(fù)溶時(shí)間需要進(jìn)一步驗(yàn)證以得到最佳效果。在探究培養(yǎng)基對(duì)菌落數(shù)的影響實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)相同條件下在外標(biāo)法所用培養(yǎng)基與國標(biāo)法自配培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，檢測結(jié)果差異并不顯著，說明中外培養(yǎng)基不是檢測過程中差異的主要來源。此外，在國標(biāo)法培養(yǎng)基中加入的不同營養(yǎng)物質(zhì)探究其影響，結(jié)果顯示加入混合維生素后檢測結(jié)果中菌落數(shù)相較兩種標(biāo)準(zhǔn)中培養(yǎng)基均有升高，但是差異不具有顯著性，而同時(shí)加入混合維生素和肝浸汁后菌落數(shù)顯著增加，說明混合維生素與肝浸汁的共同加入更有利于刺激發(fā)酵乳桿菌的生長，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

為了更準(zhǔn)確計(jì)算發(fā)酵乳桿菌CECT5716 固體制劑的具體含量，建議：（1）經(jīng)長時(shí)間冷凍保存后的固體菌粉在進(jìn)行檢測前要進(jìn)行解凍操作以提高菌體的活力；（2）用1%緩沖蛋白胨水進(jìn)行溶解操作后在與培養(yǎng)條件相同的溫度下進(jìn)行復(fù)溶操作能夠進(jìn)一步提高菌體的活力，使有活力的菌數(shù)更貼近原始值。此外，在培養(yǎng)基中加入適量的營養(yǎng)物質(zhì)能夠?yàn)榫渖L提供更多的營養(yǎng)物質(zhì)，刺激菌體生長便于觀察。