程 龍，徐五琴，張 鵬，黃建軍，李小寧

1. 皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院檢驗科，蕪湖 241001；2. 皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院病理科，蕪湖 241001

三陰乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是指雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）和人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor-2，HER2）表 達(dá)均為陰性的乳腺癌，其占所有乳腺癌的15%～25%，且具有特殊的生物學(xué)表達(dá)及臨床病理特性[1]。與非三陰乳腺癌（non-triple-negative breast cancer，non-TNBC）相 比，TNBC具有較高的復(fù)發(fā)率及轉(zhuǎn)移率，患者生存時間短，且因其HER2表達(dá)陰性而無法應(yīng)用曲妥珠單抗等靶向治療藥物[1-2]。因此探討TNBC發(fā)生發(fā)展的分子機制，尋找有效的TNBC治療靶點已成為目前乳腺癌研究領(lǐng)域的熱點。

miRNA是一類具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)功能的單鏈RNA分子，其異常表達(dá)在腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用[3]。miR-27a作為一種致癌因子在多種實體腫瘤中表達(dá)升高，并能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲[4-5]。研究[4,6]發(fā)現(xiàn)，miR-27a在乳腺癌組織中高表達(dá)，其通過抑制鋅指蛋白ZBTB10（zinefinger and BTB domain containing 10）、泛素連接酶FBW7（F-box and WD repeat domain-containing 7，F(xiàn)BW7）等蛋白表達(dá)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲。FBW7是泛素-蛋白酶體系統(tǒng)中的一種重要蛋白，可通過介導(dǎo)多種腫瘤相關(guān)蛋白，如Egl 9同源物2（Egl nine homolog 2，EGLN2）泛素化發(fā)揮抑癌作用[7]。EGLN2又名脯氨酸羥基化酶1（proly hydroxylase 1，PHD1），具有在特定環(huán)境下調(diào)控缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factor，HIF）的作用[8]。EGLN2在乳腺癌中的表達(dá)升高，并促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞系的增殖及耐藥[9]。本研究通過實驗檢測miR-27a表達(dá)對TNBC細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲的影響，并闡釋其調(diào)控的分子機制，以期為TNBC的治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本和細(xì)胞株

選取2017年1月—2018年12月皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院甲乳外科行乳腺癌改良根治術(shù)的TNBC新鮮組織標(biāo)本68例，經(jīng)常規(guī)病理學(xué)檢查明確為非特殊類型的浸潤性導(dǎo)管癌，且免疫組織化學(xué)法染色ER、PR、HER2均為陰性。于距離腫瘤邊緣3 cm以上處取正常乳腺組織作為癌旁組織對照，標(biāo)本收集后保存于液氮中備用。收集患者基本臨床資料，包括年齡、是否絕經(jīng)、腫瘤最大直徑、腫瘤組織學(xué)分級、腫瘤臨床分期、增殖細(xì)胞核抗原Ki-67指數(shù)、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等。采用2012版WHO乳腺癌腫瘤組織學(xué)分級將乳腺癌分為Ⅰ級（高分化）、Ⅱ級（中分化）、Ⅲ級（低分化），腫瘤臨床分期采用TNM分期將乳腺癌分為Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期。根據(jù)熒光定量PCR結(jié)果，miR-27a表達(dá)較癌旁組織升高大于等于50%列為miR-27a高表達(dá)組，miR-27a表達(dá)較癌旁組織不升高或升高小于50%列為miR-27a低表達(dá)組。所有患者術(shù)前均未行放射治療和化學(xué)治療。本研究經(jīng)皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。人轉(zhuǎn)移性TNBC細(xì)胞系MDA-MB-453以及人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A均購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.2 主要試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶細(xì)胞消化液均購自美國Gibco公司，miR-27a抑制物及其對照購自上海吉瑪公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000、總RNA抽提試劑TRIzol購自美國ThermoFisher公司，SYBR Green熒光定量PCR試劑盒、miR-27a及U6引物購自日本TaKaRa公司，IPA裂解液、蛋白酶抑制劑PMSF、BCA蛋白濃度檢測試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、CCK-8試劑及凋亡檢測試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)研究所，Transwell小室購自美國Corning公司，Matrigel基底膜基質(zhì)膠購自美國BD公司，F(xiàn)BW7、EGLN2、β- 肌動蛋白（β-actin）抗體及二抗購自美國Abcam公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

TNBC細(xì)胞MDA-MB-453采用RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，MCF-10A細(xì)胞采用DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)基均加入10%胎牛血清、100 U/L青霉素和100 U/L鏈霉素，培養(yǎng)箱條件為37 ℃、95%飽和濕度及5% CO2。根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)2～3 d換液1次。細(xì)胞生長至70%融合時，0.25%胰酶細(xì)胞消化液消化傳代，取第3代對數(shù)生長期細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.4 實時熒光定量PCR檢測miR-27a表達(dá)

采用TRIzol-氯仿提取組織及細(xì)胞總RNA，將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。SYBR Green熒光定量PCR試劑盒檢測miR-27a表達(dá)，以U6為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCT計算目的基因的相對定量結(jié)果。miR-27a上、下游引物序列[10]分 別 為 5'-CGGCGGTTTCACAGTGGCTAAG-3'和5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-3'；U6上、下游引物序列分別為5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'和5'-AACGCTT CACGAATTTGCGT-3'。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于6孔板，使用Lipofectamine 3 000轉(zhuǎn)染試劑，參考說明書分別向MDA-MB-453細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-27a抑制物（miR-27a inhibitor組）和miR-27a陰性對照片段（NC組），未轉(zhuǎn)染組作為空白對照（control組）。熒光顯微鏡下檢查轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染成功后培養(yǎng)板置37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。miR-27a抑制物序列為5'-GCGGAACUUAGCCCACUGUGAA-3'。

1.6 CCK-8實驗檢測細(xì)胞增殖能力

收集轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞接種于96孔板中，每孔接種2×104細(xì)胞，分別在接種后1、2、3、4、5 d，采用CCK-8法檢測細(xì)胞活性。直接向每孔加入10 μL的CCK-8試劑，37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育30 min，酶標(biāo)儀上測定450 nm處吸光度值[D（450 nm）]，根據(jù)吸光度值計算各組細(xì)胞生存率。

1.7 Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力

收集各組對數(shù)生長期細(xì)胞，采用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后接種于Transwell上室，每組設(shè)置5個復(fù)孔，每室接種100 μL密度為2.5×105/mL的細(xì)胞懸液。其中遷移實驗直接使用未處理的Transwell小室，侵襲實驗采用包被Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室。下室加入600 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。4%多聚甲醛固定后，結(jié)晶紫染色，高倍鏡下計數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.8 蛋白質(zhì)印跡法檢測FBW7和EGLN2蛋白表達(dá)

細(xì)胞裂解法提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測蛋白質(zhì)濃度，并行蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測。于SDSPAGE蛋白電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉3 h，加入一抗，4 ℃封閉過夜，次日洗膜后加入二抗，37 ℃孵育1 h。洗膜后加入化學(xué)發(fā)光底物，凝膠成像系統(tǒng)掃描成像。以β-actin作為內(nèi)參照，分析所得條帶灰度值，計算蛋白相對含量。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 13.0和Graphpad Prism 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和作圖。定量資料用±s表示，組間比較采用t檢驗；定性資料用頻數(shù)和百分比表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。所有實驗至少進(jìn)行3次獨立重復(fù)實驗。

2 結(jié)果

2.1 miR-27a表達(dá)與TNBC患者臨床特征的關(guān)系

通過分析miR-27a表達(dá)與TNBC患者臨床特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)miR-27a表達(dá)與患者組織學(xué)分級、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及腫瘤最大直徑相關(guān)（均P＜0.05）；而與患者年齡、是否絕經(jīng)以及Ki-67指數(shù)無明顯相關(guān)性（表 1）。

表1 不同miR-27a表達(dá)水平的TNBC患者臨床特征比較[n（%）]Tab 1 Comparison of clinical characteristics of TNBC patients with different levels of miR-27a expression [n (%)]

2.2 miR-27a在TNBC組織及MDA-MB-453細(xì)胞系中的表達(dá)

實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）檢測結(jié)果顯示，TNBC組織中miR-27a表達(dá)明顯高于癌旁組織（P=0.039）（圖1A），miR-27a在TNBC細(xì)胞系MDAMB-453中表達(dá)顯著高于正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A（P=0.015）（圖 1B）。

圖1 qPCR檢測miR-27a在TNBC組織及細(xì)胞系中的表達(dá)水平Fig 1 Expression of miR-27a in TNBC tissues and TNBC cell line detected by qPCR

2.3 MDA-MB-453細(xì)胞系中miR-27a干預(yù)實驗

MDA-MB-453細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-27a抑制物后48 h，細(xì)胞內(nèi)miR-27a含量與NC組相比顯著下降（P=0.041），而NC組細(xì)胞miR-27a含量與control組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖2A）。Western blotting實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-27a抑制物后，細(xì)胞內(nèi)FBW7蛋白表達(dá)顯著上升，而EGLN2蛋白表達(dá)明顯下降（均P＜0.05）（圖2B）。這表明抑制TNBC細(xì)胞中miR-27a表達(dá)可以上調(diào)FBW7蛋白質(zhì)表達(dá)，同時抑制EGLN2蛋白表達(dá)。

圖2 轉(zhuǎn)染miR-27a抑制物對MDA-MB-453細(xì)胞miR-27a表達(dá)以及FBW7、EGLN2蛋白表達(dá)的影響Fig 2 Effect of transfection of miR-27a inhibitor on miR-27a, FBW7 and EGLN2 expression in MDA-MB-453 cells

2.4 轉(zhuǎn)染miR-27a抑制物對MDA-MB-453細(xì)胞增殖的影響

CCK-8檢測結(jié)果，在接種后3、4和5 d，miR-27a inhibitor組細(xì)胞增殖活性較NC組明顯降低（均P＜0.05）；而在各檢測時間點，NC組與control組，增殖活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖3）。表明下調(diào)MDA-MB-453細(xì)胞中miR-27a表達(dá)可顯著抑制細(xì)胞增殖能力。

圖3 下調(diào)miR-27a表達(dá)對MDA-MB-453細(xì)胞增殖能力的影響Fig 3 Effect of miR-27a down-regulation on the proliferation of MDA-MB-453 cells

2.5 轉(zhuǎn)染miR-27a抑制物對MDA-MB-453細(xì)胞遷移和侵襲的影響

Transwell遷移實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-27a抑制物48 h后穿膜細(xì)胞數(shù)明顯少于NC組（P＜0.05），而NC組與control組相比穿膜細(xì)胞數(shù)無明顯差異（圖4A）；同樣，Transwell侵襲實驗呈現(xiàn)出一致的結(jié)果（圖4B）。表明下調(diào)miR-27a表達(dá)可抑制TNBC細(xì)胞MDA-MB-453的遷移和侵襲能力。

圖4 下調(diào)miR-27a表達(dá)對MDA-MB-453細(xì)胞遷移和侵襲的影響(×400，結(jié)晶紫染色）Fig 4 Effect of miR-27a down-regulation on the migration and invasion of MDA-MB-453 cells (×400, crystal violet staining)

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)逐年增高，研究乳腺癌發(fā)病的分子機制成為世界普遍關(guān)注的熱點。TNBC作為一種特殊類型的乳腺癌，有發(fā)病年齡低、家族史明顯、惡性程度高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率和復(fù)發(fā)率高等特點[11-12]，其發(fā)生、發(fā)展機制更加值得關(guān)注。

miR-27a作為一種致癌因子已被發(fā)現(xiàn)在多種實體腫瘤中表達(dá)升高，并且與腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲密切相關(guān)。Xia等[13]研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌細(xì)胞中miR-27a呈高表達(dá)，而下調(diào)miR-27a表達(dá)能夠顯著抑制胰腺癌細(xì)胞系的增殖和侵襲能力。最近的研究發(fā)現(xiàn)，miR-27a參與調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲。如miR-27a能夠通過特異性地調(diào)控FBW7蛋白促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[14]；此外miR-27a可直接上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子SP1，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞G1/S期轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞異常增殖，而下調(diào)miR-27a能夠顯著抑制乳腺癌細(xì)胞增殖[15]。本研究在TNBC組織中檢測發(fā)現(xiàn)miR-27a表達(dá)升高，并且miR-27a表達(dá)與TNBC患者組織學(xué)分級、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及腫瘤最大直徑相關(guān)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。此外，在TNBC細(xì)胞株MDAMB-453中同樣發(fā)現(xiàn)miR-27a高表達(dá)；進(jìn)一步轉(zhuǎn)染miR-27a抑制物下調(diào)miR-27a表達(dá)，并檢測細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力。實驗結(jié)果顯示，miR-27a inhibitor組細(xì)胞在接種后3、4和5 d的細(xì)胞增殖活性明顯低于NC組，并且Transwell遷移和侵襲實驗中miR-27a inhibitor組穿膜細(xì)胞數(shù)均顯著少于NC組。證實了下調(diào)miR-27a可抑制TNBC細(xì)胞MDA-MB-453的增殖、遷移和侵襲。

近年來有研究[7]發(fā)現(xiàn)，在TNBC細(xì)胞中FBW7表達(dá)缺失，這一缺失導(dǎo)致EGLN2蛋白升高并與腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移相關(guān)。FBW7是一種泛素連接酶，其基因在多種腫瘤包括直腸癌、胃癌、卵巢癌和乳腺癌中存在著突變或缺失。FBW7可直接結(jié)合和靶向作用多種轉(zhuǎn)錄激活因子或原癌基因并對其進(jìn)行泛素化修飾[16]，誘導(dǎo)靶蛋白水解，從而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖與凋亡[17]。為進(jìn)一步明確miR-27a對TNBC細(xì)胞生物學(xué)功能影響的分子機制，本實驗對各組細(xì)胞FBW7以及EGLN2蛋白表達(dá)進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示，與NC組相比下調(diào)miR-27a表達(dá)導(dǎo)致MAD-MB-453細(xì)胞中FBW7表達(dá)上升，而EGLN2蛋白表達(dá)顯著下降。已有研究[18-20]證實miR-27a可負(fù)向調(diào)控FBW7蛋白表達(dá)，與本實驗結(jié)果一致。綜上所述，在TNBC細(xì)胞MDA-MB-453中下調(diào)miR-27a表達(dá)可顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并可能與FBW7介導(dǎo)的EGLN2蛋白泛素化密切相關(guān)。